本方案描述了一种通用策略，用于再生市售的阵列式金微电极，该电极专为无标记细胞分析仪设计，旨在降低基于微芯片检测的高昂运行成本。再生过程包括胰蛋白酶消化、乙醇和水冲洗以及离心步骤，可实现微芯片的重复使用。
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本文内容
摘要
摘要
无标记细胞实验因其无需使用实验动物而在生物化学研究中具有优势。由于该方法能够比传统生物化学实验提供更动态的生理条件下细胞信息，基于电学阻抗原理的无标记实时细胞检测技术在过去十年中受到越来越多关注。然而，由于检测成本相对较高，其实际应用可能受到限制，其中细胞分析仪需使用昂贵的一次性金微芯片作为耗材。在本实验方案中，我们开发了一种通用策略，用于再生适用于商用无标记细胞分析仪的阵列式金微电极。再生过程包括胰蛋白酶消化、乙醇和水冲洗以及旋转步骤。该方法已通过测试，证明可有效实现商用电子检测板的再生和重复使用至少三次，有助于研究人员降低实时细胞检测的高昂运行成本。
引言
由于其实验流程高效且劳动强度较低，无标记细胞分析技术在过去十年中发展迅速，已广泛应用于分析和筛选领域，例如蛋白质组学研究。1,2药物递送3, 等等。4,5 与传统的以细胞分析为目标的生化方法相比，采用Giaever及其同事先前开发的原型进行的无标记实时细胞检测6 基于记录细胞附着微芯片表面电信号变化的原理，可对细胞生长或迁移进行连续且定量的测量。依据该策略，已开发出一种基于电阻抗检测原理的实时细胞电子传感（RT-CES）系统。7,8 最近，一种用于实验室研究的商用实时细胞分析仪（RTCA）已上市。9.
商用实时细胞分析仪主要读取细胞在微芯片表面培养过程中因细胞增殖、迁移、活性、形态及贴壁状态等生理变化所引起的电学阻抗信号10,11。这些电信号进一步被分析....
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方案
注意：通常情况下，再生过程包括胰蛋白酶消化以及用乙醇和水进行冲洗的步骤。消化时间需根据所用细胞的数量进行调整，而所用细胞的类型和数量则可能因实验目的不同而有所差异。建议使用光学和电化学方法检测再生后的微芯片，以优化再生条件。实验过程中可能涉及可溶性和不可溶性化学物质，本文详细说明了这两种典型情况下的再生操作流程。
1. 再生溶液的制备
注意：所有溶液均需在无菌条件下配制和操作。
- 配制新鲜的 0.25% (g/v) 胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶可直接购买，或按以下步骤新鲜配制。
- 将 0.25 g 胰蛋白酶溶解于 100 mL pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 在 4 oC 下搅拌溶液，直至胰蛋白酶完全溶解。以低速搅拌，注意避免产生气泡。
- 在生物安全柜中使用 0.22 µm 滤器过滤该溶液。
- 使用纯乙醇配制 75% 乙醇。取 75 mL 纯乙醇倒入容量瓶中，加入去离子水至总体积为 100 mL。必要时进行进一步灭菌处理。
2. 电子培养板中A549细胞的孵育与增殖
注意：电子板类型16和L8均采用光刻技术在孵育孔底部印制的阵列式金微电极制成。....
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结果
金微芯片的表面特性本方案中所采用的再生步骤已在 图1. 图2 显示了通过光学显微镜观察的新鲜和再生电子板的微观表面形貌。如图所示 图2A 和 图 2C，显微观察表明，新鲜电子板与处理后电子板的微芯片表面在光学性质上几乎没有差异。利用细胞内阿霉素分子的自发荧光来方便地评估细胞状态，我们观察到在再生后的金微芯片上培养的细胞具有相似的均一性图2B 和 图2D此外，孵育后的癌细胞在电子芯片上呈现出清晰的细胞形态，表明芯片具有可重复使用性。 图3 显示了新鲜与再生电子芯片的拉曼光谱。新鲜与处理后电子芯片.......
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讨论
我们在表1中总结了若干可用于微芯片再生的方法17,23,24,25,26。这些方法通常需要较为剧烈的实验条件，才能实现芯片的完全再生，原因在于分子间存在较强的相互作用，例如SPR芯片中使用的免疫复合物。然而，这些剧烈的实验条件可能对RTCA中所用的阵列化金微芯片表面性质造成严重损害。因此，在本研究提出的再生策略开发过程中，温和且高效的方法成为主要考虑因素。此外，环境问题也同样重要，因为这些一次性微芯片常与靶向癌细胞联合使用。
在本实验方案中，我们介绍了一种用于再生商用阵列式金微芯片的通用方法，该芯片用于实时细胞分析（RTCA）。本方案基于胰蛋白酶消化，并使用乙醇和水进行冲洗。额外的离心步骤有助于在再生过程中有效去除检测中使用的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（U1703118）、江苏省高校优势学科建设工程（PAPD）项目、江苏省“双创计划”、化学生物传感与计量学国家重点实验室开放基金（2016015）、生物大分子国家重点实验室开放基金（2017kf05）以及江苏省特聘教授项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠：Sprague-Dawley | 查尔斯河实验室（Charles River） | 货号# 400 | |
| 小鼠抗大鼠 CD11b 单克隆抗体（克隆株 OX42） | 伯乐（Bio-Rad） | 货号 MCA275R | 平移：1:1,000；染色：1:500 |
| 山羊多克隆抗Iba1 | Abcam | 货号 AB5076 | 染色：1:500 |
| 兔多克隆抗Ki67抗体 | Abcam | 货号 AB15580 | 染色：1:500 |
| Alexa Fluor 驴抗小鼠 594 | Invitrogen | 货号 11055 | 染色：1:500 |
| Alexa Fluor 驴抗山羊 488 | Invitrogen | 货号 A-21203 | 染色：1:500 |
| Alexa Fluor 驴抗兔 647 | Invitrogen | 货号 A-31573 | 染色：1:500 |
| Triton-X（免疫细胞化学染色中的去垢剂） | Thermo Fisher | 货号 28313 | |
| 硫酸乙酰肝素 | 盖伦实验室用品 | 货号 GAG-HS01 | |
| 肝素 | Sigma | 货号 M3149 | |
| 脱脂乳蛋白胨 | Sigma | 货号 P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | 货号 100-35B | |
| 小鼠 IL-34 | R&D Systems | 货号# 5195-ML/CF | |
| 绵羊羊毛胆固醇 | Avanti Polar Lipids | 货号 700000P | |
| IV型胶原蛋白 | 康宁 | 货号 354233 | |
| 油酸 | Cayman Chemicals | 货号 90260 | |
| 11(Z)二十碳二烯酸（芥酸） | Cayman Chemicals | 货号 20606 | |
| 钙黄绿素AM染料 | Invitrogen | 货号 C3100MP | |
| 碘化丙啶同源二聚体-1 | Invitrogen | 货号 E1169 | |
| DNaseI | 沃辛顿 | 货号：DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 货号 17-5445-02 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma | 货号 T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 货号 21041-02 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 货号 15140-122 | |
| 谷氨酰胺 | Gibco | 货号 25030-081 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | 货号 A9165 | |
| 胰岛素 | Sigma | 货号 16634 | |
| 去铁转铁蛋白 | Sigma | 货号 T1147 | |
| 亚硒酸钠 | Sigma | 货号 S-5261 | |
| DMEM（高糖） | Gibco | 货号 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | 货号# 0100-20 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma | 货号 A-003-E | |
| Primaria 培养板 | VWR | 货号 62406-456 | |
| <强>储备试剂 | <强>重组 | <强>使用的浓度 | <强>储存 |
| 脱铁转铁蛋白 | 10 mg/mL，溶于PBS中 | 1:100 | -20°C |
| N-乙酰半胱氨酸 | 5 mg/mL，溶于 H2O | 1:1,000 | -20°C |
| 亚硒酸钠 | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| IV型胶原蛋白 | 200 μg/mL 在 PBS 中 | 1:100 | -80°C |
| TGF-β2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| 绵羊羊毛胆固醇 | 1.5 mg/mL，溶于100%乙醇 | 1:1,000 | -20°C |
| 硫酸乙酰肝素 | 1 mg/mL，溶于 H2O | 1:1,000 | -20°C |
| 油酸/芥酸 | 贡多酸：0.001 mg/mL；油酸：0.1 mg/mL，溶于100%乙醇 | 1:1,000 | -20°C |
| 肝素 | 50 mg/mL，溶于PBS中 | 1:100 | -20°C |
| <强>溶液 | <强>配方 | <强>评论 | |
| 灌注缓冲液 | 50 μDPBS 中的 g/mL 肝素++ （含 Ca 的 PBS）++ 和 Mg+ +) | 冰冻时使用 | |
| Douncing 缓冲液 | 200 μ0.4% DNase I 溶于 50 mL DPBS 中++ | 冰冻时使用 | |
| 铺板缓冲液 | DPBS 中含 2 mg/mL 牛奶固体蛋白胨++ | ||
| 小胶质细胞生长培养基（MGM） | DMEM/F12，含100单位/毫升青霉素、100 μg/mL 链霉素，2 mM 谷氨酰胺，5 μg/mL N-乙酰半胱氨酸，5 μg/mL 胰岛素，100 μg/mL 脱铁转铁蛋白，以及 100 ng/mL 亚硒酸钠 | 使用预冷的MGM培养基将小胶质细胞从免疫平皿上冲洗下来。 | |
| IV型胶原蛋白包被 | 含 2 的 MGM μg/mL 胶原蛋白 IV | ||
| 髓鞘分离缓冲液 | 9 mL Percoll PLUS，1 mL 不含Ca的10x PBS++ 和 Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | 添加后充分混匀 CaCl2 和 MgCl2 | |
| 含TGF-β2/IL-34/胆固醇的生长培养基（TIC） | 含人 TGF-b2 2 ng/mL、小鼠 IL-34 100 ng/mL、1.5 μg/mL 羊毛胆固醇，10 μ0.1 g/mL 肝素硫酸酯 μ微克/毫升油酸，以及0.001 μg/ml 十一碳烯酸 | 确保将胆固醇加入已预热至37℃的培养基中 °C，且添加量不超过1.5 μg/mL，否则会析出沉淀。含胆固醇的培养基不得过滤。将TIC培养基与10% CO₂平衡2 在加入细胞前孵育30分钟至1小时，以确保pH值处于最佳状态。 |
参考文献
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al.
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