本文介绍了一种利用RGB成像和高光谱成像评估土壤中生长的植物根系的实验方案。将RGB图像的时间序列与高光谱扫描的化学计量信息相结合，可优化对植物根系动态的深入理解。
本文内容
摘要
摘要
深入了解植物根系动态对于提高农业系统的资源利用效率以及增强作物品种对环境胁迫的抗性至关重要。本文介绍了一种用于根系系统RGB成像和高光谱成像的实验方案。该方法采用根箱（rhizobox）系统，使植物在自然土壤中长期生长，以观察其充分发育的根系结构。实验设置以水分胁迫条件下根箱中植物的评估及根系功能研究为例进行说明。文中描述了一种基于RGB成像的低成本、快速量化根系随时间发育情况的技术方案。相比基于RGB颜色阈值分割的方法，高光谱成像可显著提升根系与土壤背景之间的分割精度。高光谱成像的独特优势在于能够获取根-土系统的化学计量信息，从而实现对系统功能的深入理解。本文通过高分辨率土壤含水量分布图对此进行了验证。然而，与RGB成像相比，高光谱成像在图像采集、处理与分析方面更为复杂。结合两种方法可优化对根系系统的全面评估。文中还提供了整合根系与地上部分性状的应用实例，适用于植物表型分析和植物生理学研究领域。为进一步提升根系成像效果，可通过采用不同光源优化照明条件以提高RGB图像质量，并扩展图像分析方法，从光谱数据中推断根区特性。
引言
根为植物提供多种重要功能，例如同化物的储存、陆生植物在土壤中的固着，以及水分和养分的吸收与运输1。从进化角度看，根轴的形成被认为是陆生植物起源的基本前提之一2。尽管根具有如此重要的作用，但在历史上，根在生物学研究中仅处于边缘地位。然而近年来，科学界对植物根系的兴趣日益增加，如图1所示。
图1：根系研究在植物科学中的重要性。
近几十年来，在SCI期刊发表的所有植物研究中，与根系相关的研究数量所占的百分比。数据来源于Scopus数据库，检索关键词为“plant”和“plant AND root”。 请点击此处查看此图的放大版本。
可以推测，近年来根系研究取得进展主要有两个原因。首先，由于全球变化的影响，陆地植被正面临更频繁的环境胁迫3。在农作物生产背景下，据估计，全球约有30%的农业用地受到水分和磷素的限制4,5。作物产量因胁迫而降低是导致全球雨养农业生态系统实际产量与潜在生产力之间存在显著产量差的主要原因，该产量差估计可达潜在生产力的50%以下6。除了资源可用性低之外，这还与资源利用效率低下有关，即植物开发利用可用资源的能力不足7。这会导致硝酸盐等移动性资源的流失，进而对其他生态系统产生负面影响。例如，当前全球氮素利用效率估计仅为47%8。因此，通过改进管理方法和培育优良品种以提高资源利用效率，对于持续增加农业产出以及实现环境可持续性均具有重要意义。在此背景下，植物根系被认为是改良作物和种植系统的关键目标9,10。
近期人们对植物根系产生兴趣的第二个重要背景是测量方法的技术进步。长期以来，根系研究方法受到两个关键挑战的限制：对于在土壤中生长的植物根系，为了进行定量分析，必须将其分离出来，主要通过水洗法11，但这一过程会破坏根轴的构型结构。In-situ 根系观测虽可采用挖掘方法，从而保留根系在土壤中的自然位置，并已用于植物学描述12，但该方法耗时极长，因此无法满足比较性根系结构-功能分析的高通量需求。另一方面，根系构型的高通量测量大多在人工培养基上进行，且主要针对幼苗期植物13，其结果外推至植物自然生长环境的可靠性尚存疑问14。
根系研究的近期繁荣与成像技术的进步密切相关15。根系研究中的成像方法大致可分为三类。第一类是高分辨率三维成像技术，如CT和MRI16。这些方法最适合用于研究植物根系与土壤之间的相互作用过程，例如干旱诱导的木质部栓塞17。通常应用于相对较小的样品，可在其中实现详细的观察。文献18提供了针对不同尺寸花盆和细根成像的CT与MRI方法比较。第二类是高通量成像方法19,20。这类方法主要基于对在人工培养基（如凝胶、发芽纸）上生长的根系进行常规二维RGB成像，由于对比度较高，可相对简便地将根系与背景分离。该方法适用于在标准化的人工生长条件下，对不同作物基因型幼苗的根系性状进行高通量比较13。介于上述两类之间的是根际盒（rhizobox）方法：该方法利用二维成像技术对在土壤中长期生长的根系进行观测，具有中等通量21,22。当前（二维）根系成像面临的一个新挑战是，除了描述根系结构外，还需同时捕捉反映根系功能的指标23。
本文介绍了利用（i）一种廉价且简单的自制RGB成像装置，以及（ii）一种更为复杂的近红外（NIR）成像装置，对在根盒（rhizobox）中生长的根系进行成像的实验方案。文中展示了由这两种装置获得的示例结果，并结合植物表型分析与植物生理学研究对结果进行了讨论。
方案
1. 用于植物生长的根盒
注意：该实验系统使用根盒（rhizoboxes）来种植植物，以便进行根系成像。首先介绍根盒的设计及所用基质，然后详细说明装填步骤。
- 根盒设计
- 制作根盒（图2），其背板和侧框由厚度为15 mm的灰色PVC材料制成，盒体尺寸为300 mm × 1000 mm。前面窗口使用6 mm厚的矿物玻璃，通过金属轨道将其固定在PVC框架上，金属轨道用螺丝拧入侧壁。
- 在底框上制作三个孔，以便排出多余的水分。这些孔可根据需要使用塑料螺钉封闭。
- 在填充前，可通过插入聚碳酸酯多层板来调节根盒的内径（介于10 mm至30 mm之间）。对于大多数作物，建议内径为10 mm，以减轻整个系统的重量（未装土壤时根盒重量为13.2 kg）。
图2：根箱实验系统及其组件。
左图显示根箱的尺寸，右图显示其各个组件，包括灰色PVC背板及侧框、前部矿物玻璃、用于调节内径的多层板，以及用于将前部玻璃固定到后部隔室的金属角件。请点击此处查看此图的放大版本。
- 底物
- 将田间土壤（本实验使用：钙质黑钙土的粉砂质壤土表层土）过2 mm筛后填入根箱中。
- 将根盒打开，水平放置，向内腔（背板加侧框）填充预湿润的基质。应水平填充，以避免在垂直位置通过顶部开口倾倒基质时，因细颗粒与粗颗粒的分层和分离现象。
- 填充前将基质预湿。根据基质类型（尤其是其粉粒和黏粒含量），含水量不得超过0.12–0.18 cm3厘米-3 以避免涂抹和结构降解。在将基质填充到根箱后，加入预混合与目标含水量之间的差值。
注意：不建议使用（烘箱）干燥的基质填装后直接加入全部水分，因为这可能导致基质发生明显沉降并形成较大的裂缝。
- 逐步填充示例
- 确定目标含水量。此处初始设定为80%植物可利用水（PAW），在此条件下植物不会遭受任何水分亏缺。
- 测定基质的田间持水量（FC）和永久萎蔫点（PWP）。此处使用与根箱等高（100 cm）的PVC管测定FC。
- 用带有小排水孔的底部塞子封闭试管，加入1 cm厚的碎石，以防止细颗粒基质堵塞排水孔，然后填入基质，其容重需与根箱中使用的基质相同（1.3 g cm⁻³）-3).
- 用水饱和土样直至出现排水，并静置两天使其达到平衡（此时的含水量按定义相当于田间持水量），同时用保鲜膜覆盖管的上端开口以防止蒸发。本实验中该土壤达到的田间持水量为 0.357 cm3 cm-3.
注意：萎蔫点含水量（PWP）的水分含量需事先通过标准土壤物理方法（如压力板测定法）确定24或基于质地的土壤传递函数25此处为 0.12 cm3 cm-3 所用土壤 - 测量田间持水量（FC）时，若采用压力板提取法，应取基质势为 h=-100 hPa 时的含水量，而非 h=-330 hPa，以与根箱（rhizobox）的几何高度（100 cm = 100 hPa）相对应。
- 计算80% PAW时的含水量（WC）：WC（cm3 cm-3) = 0.80 (FC-PWP) + PWP。根据本研究所用土壤的水分特征，80% 有效水含量（PAW）对应的体积含水量为 0.31 cm³/cm³。3 cm-3.
- 计算容积为 2850 cm³ 的根盒所需的水量3 （宽30 cm，内间距1 cm，高95 cm，顶部留出5 cm无基质空间用于浇水）。该设置可容纳水量883.5 cm³3 水的密度为1.0 g/cm³时，相当于883.5 g-3 在 20 °C.
- 定义容重（db) 以填充根盒。此处设定为 1.3 g cm-3 对应于农业田间土壤中通常发现的数值。填充2850 cm³根际盒体积所需的干燥基质的量3 在此 db 等于3705克干土。
- 将干燥土壤预湿至质量含水量为0.108 g/g-1 （相当于0.14 cm³/cm³的体积含水量）3 cm-3通过向3705 g干土中加入400 g水，轻轻混合以获得均匀的水分分布。手动破碎较大的团聚体，使颗粒大小保持在≤2 mm。
- 将预湿润的土壤填充至打开的根盒中，并使用聚苯乙烯板（30 × 10 × 1.5 cm）轻轻压实，覆盖盒内体积，从而获得均匀的土壤密度b 1.3 g cm-3.
- 加入剩余的水（483.2 g），以达到目标含水量 0.31 cm3 cm-3 通过喷雾瓶将液体喷洒到表面。确保液滴细小，以避免表面结构降解并实现均匀润湿。喷洒过程中将盒子置于天平上，以监测实际添加到基底的水量。
- 让水分重新分布10分钟，然后将玻璃压在表面，并用侧边的金属轨道固定。湿润基质的根盒平均最终重量为17818 ± 68 g（13230 g 根盒重量 + 3705 g 干土重量 + 883 g 水重量）。
注意：当水平箱体根据最终位置的势能梯度被安置到位后，其中填充的均一含水量将重新分布。这一物理过程普遍存在于所有植物生长容器中，取决于容器的几何形状（高度），实验人员应充分考虑容器的水力学特性。26.
2. 气候室设置
- 在气候室（图3）中配备8个LED灯，提供450 μmol m-2 s-1的均匀光照，光谱峰值分别为440（蓝光）和660（红光）nm，以实现植物最佳生长。
图3：用于胁迫实验的带有根盒的气候室。
(A) 气候室整体左视图，包含LED照明、气象站和计算机（此处用于记录叶片湿度计数据）；右视图为金属框架的特写，该框架以45°倾角固定根盒，并使用木板遮挡根盒玻璃窗口，防止光照进入。 (B) 甜菜的胁迫实验，结合四个阶段，分别施加由不同大气需求（高/低）和土壤水分可利用性（高/低）引起的胁迫。绿色条形图表示平均气孔导度，可反映植物的胁迫响应。请点击此处查看该图的放大版本。
- 根据植物/实验需求设置环境参数。此处光照条件设置为14小时光照和10小时黑暗。在植株定植期间以及胁迫处理开始前，将白天温度设为20°C，夜间温度设为15°C，并将相对湿度维持在50 ± 8%。
- 使用合适的金属框架将根盒以45°倾角放置。这可利用向重力性使根系尽可能朝向玻璃表面生长。
- 用木板覆盖玻璃观察窗，以保持根区处于黑暗状态，防止光线透过玻璃表面导致藻类生长。
3. 甜菜示例实验设置与处理
- 在湿润的滤纸上预萌发甜菜种子，于3天内保持 20 °C 在培养箱中培养，直至胚根伸出。这可确保使用具有活力的植株进行播种。
注意：对于发芽活力高的植物，无需进行预萌发处理，从而避免播种时损伤胚根的风险。然而，对于种皮较厚的甜菜种子，直接播种时存在较高的种子失活风险，而预萌发处理相较于直接播种能显著加快胚根的 emergence（萌出）。 - 用螺丝刀在根盒中央的土壤中钻一个小孔，深度约1.5 cm，用镊子将一粒种子放入孔中，使胚根朝下并紧贴玻璃窗（以提高初始可见度），然后轻轻覆土。
- 在土壤表面添加一层0.5 cm厚的细砾石（2–4 mm），以保护土壤团聚体在灌溉过程中免受崩解，并减少蒸发损失。为促进种子萌发，在种子所在位置的土壤表面应保持无砾石状态。
- 加入10 g水以促进建立。
- 在建立实验系统和植物早期生长阶段直至开始施加胁迫处理前，每隔2-4天灌溉一次根盒，以维持初始80% PAW的土壤含水量。
- 通过称量根箱的重量并加水至每个根箱的初始重量，确定所需灌溉水量。手动灌溉时使用移液器，以避免浇水过程中破坏土壤表面结构。
- 按照既定设计方案将根箱排列在气候室中。本方案基于一项完全随机设计（CRD）实验，包含六个甜菜品种，每个品种设五个重复。
- 每次将根盒从金属支架中取出进行称重和浇水时，都应重新放置根盒位置。这可以避免气候室内残余（光照）不均匀性可能产生的影响。
- 定义胁迫处理的起始时间及胁迫类型。以下设置（图4) 在此使用。
- 在BBCH 15期（五片叶子展开，根系覆盖约75%的根盒深度，冠层已充分发育至可进行叶片测量）开始测量。每个阶段至少维持三天，以确保植株适应新条件后再进行测量。
- 对于非胁迫条件下的观测，保持初始设置，即土壤水分处于最佳状态（80% PAW）并维持环境条件（20° C/15° C 温度，50 ± 8% 相对湿度）条件下，白天的水汽压亏缺（VPD）为 1.28 ± 0.1 kPa（参见 图3 C）。
- 通过升高温度，将大气需求提高至白天的VPD为2.45 ± 0.4 kPa 27°C/20°C 同时将相对湿度降低至35%，并保持土壤含水量为80% PAW。
- 随后将根箱干燥至相当于40%田间持水量（PAW），即含水量为0.215 cm³/cm³3 厘米-3 通过停止灌溉实现。将初始环境条件重置为低大气需求（VPD 为 1.28 kPa）。
- 结合增加大气需求的胁迫，使VPD达到2.45 kPa，并将土壤含水量维持在40% PAW。
4. 根系成像方法
- 结合成像方法，以利用各自的优势，并根据目标信息进行选择。
- 在可见光范围内应用RGB成像技术，以随时间追踪根系生长、构型和形态，该方法隐含需要频繁测量。RGB成像的优势包括：（i）成本低，（ii）图像采集速度快，（iii）硬盘空间需求小（图像大小：48 MB），以及（iv）高分辨率（3648 × 5472 像素）。
- 当需要根系和土壤的化学计量特征时，使用近红外（NIR）范围的高光谱成像（HSI）。其优点包括：（i）具有用于区分根系与土壤背景的光谱特征，以及（ii）可获取系统的理化特性（如土壤含水量、根系年龄）。其缺点包括：（i）扫描时间较长（每个根箱约16分钟），（ii）数据集体积较大（每张根箱图像达13.7 GB），（iii）近红外相机分辨率较低（320 × 256像素），以及（iv）数据分析复杂度较高。
- RGB根部成像
- 使用成像箱（图4）用于遮挡环境光并固定相机位置，由一个宽1米、高1米的金属框架构成，侧壁内衬纤维板。在前端，将相机固定在距离根盒80厘米处的两个位置。
- 用透明胶带将卷尺固定在根盒框架上，并将根盒放置于成像箱的支架中。
- 使用四个24 W的荧光灯管，从距离根盒80 cm处照射根盒。此外，另安装四个15 W的紫外灯管，置于距离根盒20 cm处，作为替代照明方式，在根系与（颜色较亮的）基质背景之间对比度较低时，利用根系的自发荧光进行观察。
- 拍摄两张图像（顶部和底部位置），覆盖根盒的上半部分和下半部分，重叠区域约为3 cm。
- 使用单反数码相机在成像箱的相应位置通过快速释放板固定后采集RGB图像。
- 使用荧光灯管时，请应用以下设置。若尺寸、照明条件或相机型号有所变化，需根据这些示例设置进行相应调整。
- 关闭相机物镜的自动对焦和防抖功能。将相机设置为手动模式。
- 将ISO感光度设为500。将快门速度设为13。将光圈设为5.6。
- 关闭反光镜预升功能。将白平衡设置为自动白平衡。
- 使用紫外灯管照射时，请采用以下设置：
- 关闭相机物镜的自动对焦和防抖功能。将相机设置为手动模式。
- 将ISO感光度设为1000。将快门速度设为13。将光圈设为5.6。
- 关闭反光镜预升功能。将白平衡设置为荧光灯模式。
- 使用荧光灯管时，请应用以下设置。若尺寸、照明条件或相机型号有所变化，需根据这些示例设置进行相应调整。
- 将根箱顶部和底部的RGB图像使用图像编辑软件（例如 Adobe Photoshop）合并为单幅图像。利用根箱侧框上的刻度尺，并对照重叠部分的物体（根系和土壤特征）进行校准。
- 将两张独立的图像（每张图像的像素尺寸为 3648 x 5472）复制到一个新文件中，新文件尺寸为 3648 x 10944 像素，背景为白色。
- 将其中一幅图像的图层不透明度降低至60%，对齐图像的重叠部分（胶带、物体），然后将图层不透明度恢复至100%。
- 根据图像上的标尺，在图像顶部无根区域精确添加两条1 cm的红色线条。这些线条将在后续图像分析中用于校准图像，以获得正确的长度尺寸。
- 合并所有图层，并使用裁剪工具移除土壤填充窗口外的图像部分。
- 将图像另存为 TIFF 文件，以供进一步分析。
- 对于使用紫外光照拍摄的图像，在保存前使用工具栏将其颜色转换为灰度 调整-黑色 & 白色，选择预设的 高对比度蓝色 过滤器
- 用于根系与土壤背景的分割以及目标根系性状（如长度、表面积、直径、分枝）的量化分析时，可使用任意根系分析软件（可访问 www.plant-image-analysis.org 获取可用工具）。此处使用 WinRhizo。
- 打开根盒的TIFF图像至软件中。
- 使用图像中添加的比例尺校准图像的长度标度。
- 选择 基于颜色 在分析菜单中选择 根 & 背景差异
- 定义一个校准文件，其中包含对应于根系和土壤（背景）的颜色类别。对于此处使用的示例图像（参见 图8) 定义了三种根系颜色类别（老侧根、嫩侧根、主根）和三种土壤颜色类别。
- 对于灰度图像（紫外光照），选择（i） 基于灰度值，以及（ii） 黑色背景上的浅色根部 在 根 & 背景差异 菜单中使用局部拉加德强度阈值进行分割。
- 打开保存结果的数据文件。
- 运行分析，随后检查是否存在错配的区域（例如边缘区域）。若存在此类情况，应定义排除区域并重新启动分析。对于未被分类的根系，添加额外的颜色类别并重新启动分析。对于被错误分类为根系的元素，激活/增加 碎片 & 粗糙边缘 筛选选项
- 使用成像箱（图4）用于遮挡环境光并固定相机位置，由一个宽1米、高1米的金属框架构成，侧壁内衬纤维板。在前端，将相机固定在距离根盒80厘米处的两个位置。
图 4：用于获取根盒 RGB 图像的成像箱。
左侧为前视图，根盒安装于此侧，内部配有光源用于成像；右侧为后视图，相机安装于该侧。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 高光谱根系成像
- 硬件设置
- 使用一套高光谱根系成像系统（图5），该系统包括：(i) 一个热电制冷的14位单色近红外相机，光谱范围为900 nm至1700 nm，分辨率为320 × 256像素，帧率为100 Hz；以及(ii) 一个成像光谱仪，光谱范围为900 nm至2500 nm，光谱分辨率为3.6 nm。采用卤素线光源（四个50 W卤素灯）以45°/-45°几何结构布置照明。将成像传感器安装在双轴定位系统上。扫描窗口尺寸为240 × 1000 mm，即根箱（rhizobox）每侧边缘有30 mm区域无法被图像覆盖。
- 通过Matlab脚本控制系统，实现以下功能：(i) 获取白板和暗场标准图像，(ii) 设置相机积分时间，(iii) 选择空间分辨率（像素尺寸0.1 mm；像素尺寸1.0 mm）和光谱分辨率（全部222个谱带，分辨率为3.6 nm；或平滑后54个谱带，分辨率为14.8 nm），以及(iv) 定义根箱上的扫描区域。
- 将图像保存为SIF文件格式。为避免大文件保存过程中出现问题，将每次扫描的图像行（每个根箱共9行）划分为四个部分（三个长度为300 mm，一个长度为100 mm），并分别保存，文件名包含行号（1至9）、部分编号（1至4）以及日期和时间（YYYY.MM.DD HH:MM:SS）。完整一次根箱扫描需占用13.7 GB硬盘空间。
- 图像采集与分析
注：图6展示了图像采集、分割与分析的步骤。- 图像采集包括选择最佳图像质量的相机设置及定义扫描参数。
- 在相机软件中确定根箱扫描和白板标准的相机积分时间。
- 打开成像图形用户界面（GUI），将相机移动至根箱上存在根系的位置。
- 调整相机积分时间，使目标亮物体（即根系）在软件显示的直方图中占据约85%的全动态范围。通过移动相机定位系统对准白板标准，重复此操作以设置白板积分时间。然后关闭相机软件。
- 打开Matlab成像GUI，为当前根箱扫描设置所有参数。本研究中使用的参数如下：
白板标准积分时间：1000
根箱积分时间：4000
光谱分辨率：全分辨率（即222个窄谱带）
全空间分辨率（像素尺寸0.1 mm）- 每次成像运行前采集暗场和白板标准图像，例如每天一次。暗场标准代表相机噪声，白板标准提供最大反射率。这些数据在预处理阶段用于图像归一化。
- 定义是扫描整个根箱还是仅部分区域。本研究中对整个根箱进行成像。随后启动扫描。
- 在相机软件中确定根箱扫描和白板标准的相机积分时间。
- 使用Matlab脚本处理图像，脚本执行的操作如下所述。
注：目前脚本尚无文档说明，可向通讯作者索取。待完成正式文档后，脚本将可在通讯作者所在机构网站下载（www.dnw.boku.ac.at/pb/）。- 将来自根箱中心（含根系）的四个部分合并，构成完整的图像行。
注：此阶段无需也不建议使用整个根箱（即全部9行）的高光谱图像，因为文件体积过大将导致Matlab中每一步计算耗时极长，而单个中心行图像已足以支持初步图像分析。 - 利用采集的暗场和白板标准对图像进行归一化处理，并考虑白板标准与根箱扫描中不同积分时间的影响，这些参数在扫描时已自动保存于文件中。
- 可选地应用平滑滤波器以去除图像噪声。当前脚本提供3×3核中值滤波和多元散射校正（MSC）功能。本研究中图像评估未使用任何滤波器。
- 在所有记录的光谱波段上显示图像，以获得初步观察结果，并选择一个波长用于显示，以便确定感兴趣区域（参见 图像分割）。
- 将来自根箱中心（含根系）的四个部分合并，构成完整的图像行。
- 在独立脚本中执行根系与土壤背景的分割，步骤如下：
- 选择根系和土壤的感兴趣区域（ROI），以寻找用于分割的光谱特征。使用手绘选择工具，在先前确定的、根系与土壤对比度良好的波长图像上标记ROI。此处选择三个根系ROI（老侧根、新侧根、主根）和两个土壤ROI（干燥区、湿润区）。
- 显示包含所选ROI的矩形区域，其余部分以黑色掩膜表示，并在所有波长下可视化所选ROI的图像。
- 移除图像矩阵中所有包含光谱强度为0（黑色像素）的行。
- 将根系和土壤的ROI分别融合为一个前景（根系）矩阵和一个背景（土壤）矩阵，用于后续分割。
- 搜索能最好地区分根系前景与土壤背景的光谱波段（单光谱强度或光谱比值）27。使用巴塔恰里亚距离（Bhattacharyya distance）28量化根系与土壤像素直方图之间的差异。
- 选择一个阈值强度以分离两个直方图。
- 将选定阈值应用于原始图像生成二值图像。该操作将强度低于阈值的像素设为0，高于阈值的设为1（由脚本自动完成）。
- 将二值图像保存为tiff文件。
- 打开二值图像并分析根系性状。在“根系与背景区分”（Root & Background Distinction）菜单中选择：(i) 基于灰度水平，以及(ii) 黑色背景上的浅色根系，并使用全局强度阈值（图像已二值化）。
- 为从高光谱数据映射土壤含水量，需先获取校准数据集，并将校准方程应用于根箱图像。
- 使用聚苯乙烯板将一个根箱划分为5 cm的隔间，填充土壤（与实验所用基质和干密度db相同），并调节至不同含水量（图8）。
- 计算各隔间所需添加的水量，按与1.3节所述相同的方法填充各隔间（适用于整个根箱的操作流程）。
- 使用与种植根箱相同的设置扫描该校准根箱。
- 使用脚本执行以下步骤：
- 将来自含水校准箱的某一行图像的四个部分合并为一行，并使用暗场和白板标准进行归一化。
- 在每个不同含水量的隔间中选择矩形区域，并将其保存为结构数组。
- 确定最能区分不同含水量隔间的光谱特征。该步骤通过搜索相邻含水量平均光谱之间强度差异的全局最大值的算法实现。
- 计算该校准根箱中每个含水量隔间在该光谱特征下的平均光谱强度值。
- 拟合直接测量的含水量与相应光谱量化指标之间的回归方程。
- 将该回归方程应用于根箱图像中未被分类为根系的每个像素，使用前述确定的、与含水量最相关的光谱特征（波段）。
- 图像采集包括选择最佳图像质量的相机设置及定义扫描参数。
- 硬件设置
图5：高光谱根系扫描仪。
图中标出了扫描仪的主要组成部分。小图显示了成像过程中相机对根箱的拍摄状态。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：高光谱根系成像的步骤。
高光谱根系成像主要包括三个步骤：（i）图像采集，（ii）图像分割，以及（iii）光谱数据的分析。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：用于水分校准的根盒装置。
根盒包含若干装有不同含水量基质的隔室，各隔室由聚苯乙烯板分隔。在干燥隔室中放置萌发纸，以防止土壤颗粒冲刷至相邻隔室。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 应用实例
注意：定量根系信息应用于植物表型分析（品种比较）和植物生理学研究。以下地上部分数据用于说明这些情况。
- 叶面积：在实验期间选定的生长阶段，通过测量叶片的长度和宽度作为替代指标，非破坏性地测定叶面积。也可使用冠层图像进行测定29。
- 实验结束时，使用叶面积仪测量剪下的叶片的长度、宽度及实际叶面积，并利用所得数据对非破坏性方法进行校准，建立回归方程。
- 干物质：实验结束时，用剪刀剪下植株地上部分，于烘箱中在105 °C下烘干24小时，测定地上部分干物质质量。
- 气孔导度：使用叶片气孔计测量气孔导度。测量前，将仪器置于气候室中至少一小时，使传感器与环境条件达到平衡；每当气候室内的环境参数发生变化时，均需重新校准仪器。每株植物至少选取三片叶片进行测量。
结果
展示了基于RGB和高光谱成像的根系分割示例结果。对于光谱成像，提供了高分辨率水分分布图的示例。最后展示了基于图像的根系数据在科学研究背景中的应用结果。
基于 RGB 的根系测量
图8展示了甜菜品种Ferrara的根系RGB图像时间序列。这些图像显示出由于根盒光照不均匀而产生的一些伪影，在根盒左侧区域亮度较高，且上下两幅图像重叠区域的亮度存在差异。
图8：基于RGB成像的根系生长时间序列。
图片显示了甜菜品种Ferrara在播种后不同天数（DAS）的生长情况。图像中存在一些伪影，由图像左侧光照不均以及上下图像之间的光照差异所致。比例尺为2 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
图9展示了在播种后第35天（DAS）对Ferrara品种基于颜色阈值的根系分割细节。作为参考（图9A），使用了一幅通过绘图板手动追踪所有根系的二值图像。手动追踪整个完全发育且密集的甜菜根系系统所需时间约为四小时。图9B放大显示了图像顶部一个选定区域，该区域存在较老的侧根。在此处，部分根轴未被颜色阈值法正确分类。相反，在图像底部（图9C），白色的新根占主导地位，基于颜色的分割方法能够准确分类所有根轴。二值化后的根系图像（图9D）在左侧显示出因光照伪影造成的黑色区域，该区域在进行定量分析前已被定义为排除区域。图9E显示了在播种后第35天Ferrara品种RGB图像红通道中所选特征（根系与土壤）对应的像素直方图。根系像素（蓝色）明显呈现三个峰值，分别对应明亮的新侧根、深色的老侧根以及主根。老侧根与土壤背景之间的重叠非常显著，导致部分根轴未能被分类（参见 图9B）。
图9：利用颜色阈值进行根系分割。
(A) 使用图形数位板手动分割的根系系统，(B) 图像上部为旧根轴分割效果较差的区域，(C) 图像下部为正确分割的幼根轴，以及 (D) 基于颜色阈值分割获得的二值图像。(E) RGB图像所选特征的像素直方图。蓝色条形代表根系，并标注了不同根系类型；红色条形代表土壤。A和D中的比例尺为2 cm；B和C中的比例尺为1 cm。 请点击此处查看该图的放大版本。
手动分割参考图像所量化的总可见根长为 1534.1 cm，而基于颜色的自动化分割得到的总根长为 1427.6 cm。
在此所示的情况下，紫外光照射获得的灰度图像并未表现出优势，与彩色阈值法相比效果较差（根长：1679.7 cm）。由于紫外灯的光照强度较低，老根无法被有效分割，且图像中噪声更多。然而，对于具有较强自发荧光的幼根以及背景基质较亮的情况，紫外光照射仍可能是一种可行的选择，如另一项实验中以沙子作为背景基质所获得的图像所示（图10）。
图10：利用紫外光照在明亮背景下观察根系。
示例为生长在装有石英砂的根盒中的硬粒小麦根系。根盒在（A）紫外光和（B）荧光（日光）照射下成像。比例尺为2 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
基于 HSI 的根系测量
图11展示了三个根部感兴趣区域（老侧根、嫩侧根、主根）和两个土壤感兴趣区域（根箱顶部和底部）的平均光谱。
图11：根系与土壤的平均光谱。
来自根系区域（三种根类型）和土壤区域（根箱顶部和底部）感兴趣区域（ROIs）的光谱。选择这些感兴趣区域旨在确定根系与土壤之间最佳的分割标准。请点击此处查看该图的放大版本。
显然，主根和幼嫩侧根在大多数光谱波段的强度上与背景存在显著差异，而老化的侧根与背景的强度差异则小得多。可通过视觉推断的一个特征是，在水吸收区域（1450 nm）附近光谱斜率的不同。在此区域，根系光谱的斜率高于土壤光谱。此外，可在主根和幼嫩侧根光谱中观察到在约1100 nm区域发生的变化，而该变化在老化的侧根中并不存在。
图12A展示了搜索算法识别出的具有最强前景-背景对比度的光谱比值结果。1476 nm与1076 nm处光谱的比值可实现根系与土壤之间最佳的分离效果。图12B显示了根系前景和土壤背景像素的相应直方图。尽管存在部分重叠，大多数像素仍可明显地与土壤背景区分开来。通过对直方图拟合双峰高斯曲线并采用巴塔恰里亚距离（Bhattacharyya distance）进行量化，得到数值为7.80。当该值高于3.0时，表明图像对比度强，可实现可靠的分离28。
图12：不同光谱波段比值下根部前景与土壤背景之间的反射率差异，以及用于分割的光谱比值下的像素直方图。
(A) 明亮颜色（黄色）表示前景与背景之间具有高对比度，深色（蓝色）表示低对比度。前15个波段因噪声干扰已被剔除。红线标示出对比度最高的波段比值。 (B) 在用于分割的光谱比值下，根部（蓝色）与土壤（红色）的像素直方图。蓝色条代表根部，红色条代表土壤。强度值对应于第160光谱波段与第49光谱波段的比值。请点击此处查看该图的放大版本。
通过应用全局强度阈值对识别出的光谱比值进行处理，得到二值图像（图13），该阈值为根据直方图距离计算出的1.00827。对该图像的根长进行分析，得到总长度为1557.3 cm，与手动追踪获得的参考图像相比，误差仅为1.5%。
图13：甜菜品种Ferrara根系的二值图像。
该图像是通过应用全局光谱阈值获得的。比例尺（左下角），2 cm。 请点击此处查看此图的放大版本。
尽管与基于颜色的信息相比，利用光谱信息已改善了根系分割效果，但高光谱成像的主要目的仍是化学计量图像特性的分析。这可通过绘制根箱图像中水分含量的分布图来加以说明。
图14A 显示了校准根盒中各隔室的平均光谱（参见 图7），这些隔室填充了不同含水量的土壤。各隔室之间的光谱形状相似，因此在此情况下，光谱比值并不一定提供更稳定的分类依据。因此，选择在单一光谱波段（1680 nm）处的强度作为最佳区分指标，该波段处相邻含水量之间的平均差异最大。该光谱波长对应的像素直方图如图14B所示。
图14：用于水分含量校准的光谱特征。
(A) 校准根箱中九个不同含水量水区的平均光谱；(B) 在波段216处水区的像素直方图，该波段处相邻水区之间的平均距离最大。请点击此处查看该图的放大版本。
平均像素强度在1680 nm处与测得的含水量之间的关系如图15所示。
图15：光谱反射率与体积含水量的关系。
该图显示了实测含水量与光谱反射率的数据对，以及基于数据拟合的经验曲线（线性和指数曲线），拟合时排除了最高含水量数据（红色三角形）。请点击此处查看该图的放大版本。
通过光谱强度区分较高的含水量变得困难。在含水量达到约 0.30 cm3 cm-3 时，可拟合出具有高 R2 值的显著回归关系（线性或指数型）。但土壤含水量更高时，无法可靠地通过强度值进行预测。其他研究也发现了反射率与含水量之间呈指数关系的类似现象，当含水量高于 0.30 cm3 cm-3 时，响应逐渐减弱30。
显示细尺度水分含量分布的根盒图像如图所示 图16有四个方面需要说明。第一，根箱中根系分布区域的含水量较低。第二，水分消耗最严重的区域集中在单条根轴附近。第三，即使在土壤表面未观察到根轴的位置，也出现了水分消耗区，表明这些区域存在隐藏于土壤内部的根系。第四，由于土壤呈团聚态，未经进一步图像处理的水分成像结果呈现斑块状分布。这种现象可能反映团聚体尺度上水分含量分布的不均一性，也可能受到土壤表面形貌对图像质量的影响。化学计量图像处理技术可用于消除光谱图像中的此类形貌干扰。31，但目前尚未在本文所使用的 Matlab 脚本中实现。
图16：根盒中的含水量分布图。
深蓝色区域表示含水量高的区域，绿色至红色区域表示含水量低的区域。植物根系以黑色叠加在图像上。比例尺（左下角），2 cm。 请点击此处查看该图的放大版本。
应用示例
图17 将图像分析得到的定量根系性状与地上部分测量结果相关联。
图17：根系数据的典型应用示例。
(A) 和 (B) 展示了在表型分析背景下用于地上-地下植物特征描述的根系信息。(A) 表示甜菜品种Ferrara的根系生长情况，(B) 使用叶面积与根面积比（单次重复数据）比较了六种在根盒中生长的甜菜品种。(C) 和 (D) 为植物生理学研究中发现的性状之间的功能关系。(C) 显示叶面积与根面积比对干物质生产的影响力，(D) 显示根系表面积与气孔导度之间的关系。请点击此处查看该图的放大版本。
图17A 和 17B 与表型分析相关，重点关注地上部和地下部植物的全面表征。图17A 显示了甜菜品种Ferrara的根系生长情况（根系图像参见cf. 图8）。根系的扩展表明该品种在特定生育期内探索土壤体积的能力。图17B 显示了六个甜菜品种的叶面积与根面积比值，该指标可用于描述植物供应器官（根）与需求器官（叶）之间的平衡状态。
图17C 和 17D 给出了生理学研究中感兴趣的函数关系示例。图17C 显示了叶面积与根表面积之比与实验期间形成的干物质之间的关系，表明同化表面积作为干物质积累限制因素的主导作用。尽管R2值相对较高，但由于所用成对数据数量较少（n=6），该关系未达到显著性水平。图17D 表明，在整个实验过程中，根表面积较大（吸收能力更强）的品种平均具有更高的气孔导度。显然，较大的根表面积能够维持水分吸收，从而延长气孔开放时间。
讨论
该方案提供了两种互补的方法用于土壤中根系系统的成像。获得可靠实验结果的关键步骤是根箱（rhizobox）的填装，必须确保前端玻璃表面的基质层均匀且一致，以在观察窗口处实现根系与土壤的紧密接触，并避免产生气隙。因此通常使用粒径小于< 2 mm 的细筛土壤，主要原因在于：较大的土粒会增加观察窗口处的表面形貌不均，颗粒之间形成空隙。这不仅增加了根尖脱水的风险，还要求采用更复杂的图像处理技术来进行水分分布的映射31。
因此，本方案的改进主要集中在提高根盒填充效率并缩短填充时间。目前每个根盒的填充时间约为30分钟。此外，正在测试使用带有双面玻璃窗的根盒以实现双侧成像，并对光照系统进行改进以优化光照均匀性，从而获得更高质量的RGB图像。未来的硬件扩展还可能考虑将平面光极32以及电容成像技术33整合到根盒系统中。但这些内容已超出当前的升级计划。
软件改进主要集中在自动图像配准，以融合顶部和底部的RGB图像34。对于高光谱成像，测试了先进的无监督特征提取方法28，以及更灵敏的有监督目标检测方法（如支持向量机SVMs35）。由此，高光谱数据有望用于评估多种土壤、根际和根系特性36。此外，计划基于改进版的根系分析系统Root System Analyzer37，开发一套（半）自动化的根箱根系图像分析软件，用于量化形态学参数（如长度、直径、表面积）以及构型特征（如分枝频率、分枝角度）。
与三维成像方法相比，该实验方案的主要局限性在于仅能观察到可见的根系表面及其根际特性。然而已有研究表明，可见根系性状可作为整个根系系统的可靠代理指标21。根盒技术可轻松结合传统的破坏性取样（洗涤法），在动态生长成像结束后对可见性状与整体根系性状之间的关系进行验证。由于该关系可能因物种而异21，因此建议在针对不同作物物种开展新的表型分析系列实验时，进行破坏性取样以确保由可见性状推断出的结果具有可靠性。
本方案的关键优势在于结合了真实的生长条件（土壤）、相对较高的时间分辨RGB成像通量，以及通过高光谱成像获得的化学计量学根系与根际数据对根系功能（如水分吸收）进行推断。因此，该方法克服了高通量幼苗及非土壤条件下根系成像方法在功能推断方面的局限性14，同时相较于复杂的三维成像方法，能够在实验复杂度较低且通量较高的条件下，部分实现对功能过程的深度表型解析15。
在接下来的实验中，该方案将用于研究菌根对豆科植物根系发育及其功能的影响，以及与土壤结构、氮素和碳循环相关的覆盖作物物种根系特征的表型分析。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢奥地利科学基金 FWF 通过项目编号 P 25190-B16（干旱抗性的根源）提供的资助。高光谱成像基础设施的建立得到了下奥地利州联邦政府（Land Niederösterreich）通过项目 K3-F-282/001-2012 的资金支持。甜菜实验的额外资金由 AGRANA Research 提供 & 创新中心有限公司（ARIC）。作者感谢Craig Jackson在实验期间提供的技术支持以及对稿件的英文校对。我们还感谢Markus Freudhofmaier在建立RGB成像系统方面所做的贡献，以及Josef Schodl在构建根盒支架方面的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 根箱 | Technisches Büro für Bodenkultur | 实验装置制作者 | |
| LED 植物生长灯 ATUM HORTI 600 | Klutronic | AHI10600F | |
| 荧光灯管 HiLite T5 日光型 | Juwel Aquarium | 86324 | |
| 紫外灯管 Eurolite 45 cm 细管 15 W | Conrad | 593384 - 62 | |
| 佳能 EOS 6D 相机 | Canon Austria GmbH | 8035B024 | |
| Adobe Photoshop CS5 扩展版 12.0 x 32 | Adobe Systems Software Ireland Ltd. | ||
| WinRhizo Pro v. 2013 | Regent Instruments Inc. | ||
| Xeva-1.7-320 短波红外相机 | Xenics | XEN-000105 | |
| 光谱仪 Imspector N25E | Specim | ||
| 高光谱成像扫描仪 | Carinthian Tech Research AG | 实验装置制作者 | 高光谱成像扫描仪及其软件的设计与组装 |
| Matlab R2016a | Mathworks | 包含图像处理、信号处理以及统计与机器学习工具箱 | |
| AP4 气孔计 | Delta-T-Devices | ||
| LI-3100C 叶面积测量仪 | LI-COR | ||
| BASF Styradur 聚苯乙烯板 | Obi Baumarkt | 9706318 | 可使用不同类型聚苯乙烯板或其他材料，以分隔不同湿度的土壤 |
参考文献
- Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. , DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).
- Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. The origin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).
- Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. Global change and terrestrial plant community dynamics. PNAS. 113, 3725-3734 (2016).
- MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands. PNAS. 108, 3086-3091 (2011).
- Vörösmarty, C. J., Green, P., Salisbury, J., Lammers, R. B. Global water resources: vulnerability from climate change and population growth. Science. 289, 284(2000).
- Lobell, D. B., Cassman, K. G., Field, C. B. Crop yield gaps: their importance, magnitudes, and causes. Annu. Rev. Environ. Resour. 34, 179-204 (2009).
- Angus, J. F., Van Herwaarden, A. F. Increasing water use and water use efficiency in dryland wheat. Agron. J. 93, 290-298 (2001).
- Lassaletta, L., Billen, G., Grizzetti, B., Anglade, J., Garnier, J. 50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems: the relationship between yield and nitrogen input to cropland. Environ. Res. Lett. 9 (10), 105011(2014).
- Lynch, J. P. Roots of the second green revolution. Aust. J Bot. 55, 493-512 (2007).
- Comas, L. H., Becker, S. R., Von Mark, V. C., Byrne, P. F., Dierig, D. A. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front. Plant Sci. 4, 442(2013).
- Metcalfe, D. B., et al. A method for extracting plant roots from soil which facilitates rapid sample processing without compromising measurement accuracy. New Phytol. 174, 697-703 (2007).
- Kutschera, L., Lichtenegger, E., Sobotik, M. Wurzelatlas der Kulturpflanzen gemäßigter Gebiete mit Arten des Feldgemüsebaues. , DLG-Verlag, Frankfurt am Main. (2009).
- Gioia, T., et al. GrowScreen-PaGe, a non-invasive, high-throughput phenotyping system based on germination paper to quantify crop phenotypic diversity and plasticity of root traits under varying nutrient supply. Funct. Plant Biol. 44, 76-93 (2017).
- Watt, M., et al. A rapid, controlled-environment seedling root screen for wheat correlates well with rooting depths at vegetative, but not reproductive, stages at two field sites. Ann. Bot. 112, 447-455 (2013).
- Fiorani, F., Schurr, U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu. Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
- Choat, B., Badel, E., Burlett, R., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Non-invasive measurement of vulnerability to drought induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiol. 170, 273-282 (2015).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
- Le Marié, C., Kirchgessner, N., Marschall, D., Walter, A., Hund, A. Rhizoslides: paper-based growth system for non-destructive, high throughput phenotyping of root development by means of image analysis. Plant Methods. 10, 1(2014).
- Bengough, A. G., et al. Gel observation chamber for rapid screening of root traits in cereal seedlings. Plant Soil. 262, 63-70 (2004).
- Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct. Plant Biol. 39, 891-904 (2012).
- Price, A. H., et al. Upland rice grown in soil-filled chambers and exposed to contrasting water-deficit regimes: I. Root distribution, water use and plant water status. Field Crops Res. 76, 11-24 (2002).
- Vadez, V. Root hydraulics: the forgotten side of roots in drought adaptation. Field Crops Res. 165, 15-24 (2014).
- Dane, J. H., Hopmans, J. W. Pressure plate extractor. Methods of soil analysis. Part 4. Physical methods. Dane, J. H., Topp, G. C. , SSSA Inc. Madison, Wisconsin, USA. 688-690 (2002).
- Wösten, J. H. M., Pachepsky, Y. A., Rawls, W. J. Pedotransfer functions: bridging the gap between available basic soil data and missing soil hydraulic characteristics. J. Hydrol. 251, 123-150 (2001).
- Passioura, J. B. The perils of pot experiments. Funct. Plant Biol. 33, 1075-1079 (2006).
- Dorrepaal, R., Malegori, C., Gowen, A. Tutorial: Time series hyperspectral image analysis. J. Near Infrared Spec. 24, 89-107 (2016).
- Kim, D. M., et al. Highly sensitive image-derived indices of water-stressed plants using hyperspectral imaging in SWIR and histogram analysis. Scie rep. 5, (2015).
- Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses-a review. Plant Methods. 11, 29(2015).
- Lobell, D. B., Asner, G. P. Moisture effects on soil reflectance. Soil Sci. Soc. Am. J. 66, 722-727 (2002).
- Esquerre, C., Gowen, A. A., Burger, J., Downey, G., O'Donnell, C. P. Suppressing sample morphology effects in near infrared spectral imaging using chemometric data pre-treatments. Chemometr. Intell. Lab. 117, 129-137 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environ Sci. Technol. 48, 8498-8506 (2014).
- Cseresnyés, I., Takács, T., Végh, K. R., Anton, A., Rajkai, K. Electrical impedance and capacitance method: a new approach for detection of functional aspects of arbuscular mycorrhizal colonization in maize. Eur. J Soil Biol. 54, 25-31 (2013).
- Brown, M., Lowe, D. G. Automatic panoramic image stitching using invariant features. Int. J. Comput. Vision. 74, 59-73 (2007).
- Jiang, Y., Li, C., Takeda, F. Nondestructive detection and quantification of blueberry bruising using near-infrared (NIR) hyperspectral reflectance imaging. Scientific Reports. 6, 35679(2016).
- Chang, C. -W., Laird, D. A., Mausbach, M. J., Hurburgh, C. R. Near-infrared reflectance spectroscopy-principal components regression analyses of soil properties. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 480-490 (2001).
- Leitner, D., Felderer, B., Vontobel, P., Schnepf, A. Recovering root system traits using image analysis exemplified by two-dimensional neutron radiography images of lupine. Plant Physiol. 164 (1), 24-35 (2014).
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