壳聚糖基可注射水凝胶的制备及其在三维细胞培养中的应用

摘要

本文介绍了一种利用动态亚胺化学简便制备基于壳聚糖的可注射水凝胶的方法。同时提供了调节水凝胶机械强度的方法及其在三维细胞培养中的应用。

摘要

本方案介绍了一种利用动态亚胺化学简便、高效且多功能地制备壳聚糖基水凝胶的方法。通过将乙二醇壳聚糖溶液与合成的苯甲醛封端聚合物凝胶剂溶液混合，可在室温下数分钟内高效形成水凝胶。通过调节乙二醇壳聚糖、聚合物凝胶剂和水的比例，可获得具有不同凝胶时间和刚度的多种水凝胶。由于动态亚胺键作为交联结构具有可逆性，该水凝胶在受损后能够恢复其外观和模量。这种自愈合特性使水凝胶具备可注射性，因为在注射过程中被挤压成碎片后，仍可在注射完成后自愈合为完整的块状水凝胶。此外，由于动态亚胺键存在不同的平衡状态，该水凝胶对多种生物活性刺激具有多重响应性。经证实，该水凝胶具有良好的生物相容性，可按照标准操作将L929小鼠成纤维细胞包埋其中，并通过三维细胞培养过程便捷地评估细胞增殖情况。该水凝胶可为需要模拟细胞三维生理环境的不同研究提供可调控的平台。结合其多重响应性、自愈合性和可注射性，这类水凝胶在未来生物医学应用中有望作为药物和细胞的多功能载体。

引言

水凝胶是一类具有大量水分和柔软力学性能的交联聚合物材料，已广泛应用于多种生物医学领域^1,2水凝胶可提供一种柔软湿润的环境，与细胞的生理环境非常相似 体内因此，水凝胶已成为三维细胞培养中最常用的支架材料之一^3,4与二维培养皿细胞培养相比，三维细胞培养已迅速发展，可为细胞提供模拟细胞外基质（ECM）的微环境，以促进细胞的接触、聚集、增殖和分化⁵此外，含有天然聚合物的水凝胶可为细胞增殖和分化提供生物相容且具有促进作用的环境³合成聚合物来源的水凝胶因其成分简单明确，可排除动物源性蛋白质或病毒等复杂影响因素，因而更受青睐。在所有用于三维细胞培养的水凝胶候选材料中，易于制备且性能一致的水凝胶始终是首选。此外，能够方便地调节水凝胶的性质以满足不同研究需求也十分重要。⁶.

本文介绍了一种基于动态亚胺化学的乙二醇壳聚糖水凝胶的简便制备方法，该方法构建了一个适用于三维细胞培养的多功能水凝胶平台⁷。该方法采用已知具有良好生物相容性的乙二醇壳聚糖作为水凝胶网络的骨架结构，其氨基与末端带有苯甲醛基团的聚乙二醇聚合物交联剂发生反应，形成作为水凝胶交联结构的动态亚胺键⁸。动态亚胺键能够可逆地形成与分解，并对外界环境变化作出响应，从而使水凝胶具备机械性能可调的交联网络^9,10,11。由于该水凝胶具有高含水量、良好的生物相容性以及可调节的机械强度，已成功作为L929细胞三维培养的支架材料被应用^12,13。本实验方案详细描述了包括聚合物交联剂的合成、水凝胶制备、细胞包埋以及三维细胞培养在内的各项操作步骤。

该水凝胶由于具有动态亚胺交联结构，还表现出多种其他特性，包括对多种生物刺激（酸/ pH、维生素B6衍生物吡哆醛、蛋白酶木瓜蛋白酶）的多重响应性， 等等。），表明该水凝胶可在生理条件下被诱导分解⁸该水凝胶还具有自愈性和可注射性，这意味着可通过微创注射方式给药，并在药物和细胞递送方面具有优势。^14,15通过添加功能添加剂或特定预设计的聚合物凝胶剂，该水凝胶可具备磁性、温度和pH响应等特定性能。 等等。^16,17，可满足广泛的研究需求。这些特性表明该水凝胶具有作为可注射的多功能载体用于药物和细胞递送的潜力 体外 和 体内 生物医学研究与应用

方案

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。进行化学实验时，请采用适当的安全操作规范，包括在通风橱中操作，并佩戴个人防护装备（安全眼镜、防护手套、实验服）。 等等。）。该方案需要标准的细胞操作技术（灭菌、细胞复苏、细胞传代、细胞冻存、细胞染色， 等等。).

1. 水凝胶的制备

1. 苯甲醛封端双功能化聚乙二醇（DF PEG）的合成
   1. PEG 聚合物的预干燥
      1. 称取 4.00 g PEG（分子量 4,000，1.00 mmol），转移至圆底烧瓶（250 mL）中，加入甲苯（100 mL）。
         注意：其他不同分子量的 PEG 也可用于水凝胶的形成，但会导致不同的刚度。
      2. 使用加热枪（或约 40 °C 的加热板）温和加热溶液，以帮助完全溶解所有聚合物。待聚合物完全溶解后，使用旋转蒸发仪除去所有溶剂。重复此溶解和干燥过程两次，得到干燥的 PEG 聚合物。
         警告：该操作应在通风橱中极其小心地进行。甲苯易燃。
   2. PEG 的苯甲醛封端反应
      1. 向烧瓶中加入磁力搅拌子和四氢呋喃（THF，100 mL），用搅拌器溶解 PEG。依次加入 4-羧基苯甲醛（0.90 g，6.0 mmol）和 4-二甲氨基吡啶（0.07 g，0.6 mmol），搅拌至所有固体完全溶解。
      2. 向溶液中加入 N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC，1.25 g，6.0 mmol），并在烧瓶口安装填充无水 CaCl₂ 的干燥管。在室温（约 20 °C）下持续搅拌反应约 12 小时。
   3. 反应后处理
      1. 反应结束后，通过真空过滤除去溶液中生成的白色固体。在搅拌下将滤液倒入冷的乙醚（500 mL）中，使白色固体沉淀析出。通过过滤收集所有白色固体，并在通风橱中干燥。
      2. 再次将白色固体溶于 THF，过滤除去任何不溶的白色固体，将滤液倒入新鲜的冷乙醚中重新沉淀白色固体，并进行干燥。重复此过程两到三次，然后将白色固体置于真空干燥箱中（20 °C，0.1 mbar）彻底干燥。收集所得白色粉末作为最终产物：苯甲醛封端的 DF PEG。
2. 水凝胶的制备
   1. 在试管（10 mL）中称取不同质量的 DF PEG（0.11 g，0.028 mmol；0.22 g，0.055 mmol；0.44 g，0.110 mmol），加入去离子水（5.0 mL），使用涡旋振荡器或磁力搅拌器帮助溶解聚合物。
   2. 在另一试管（50 mL）中将乙二醇壳聚糖（0.495 g，6.18 × 10^-3 mmol）溶于去离子水（15.0 mL）中，使用涡旋振荡器搅拌数分钟，使壳聚糖溶液均质化（3 wt%）。
   3. 在试管（2.0 mL）中依次加入乙二醇壳聚糖溶液（0.2 mL，3 wt%）和 DF PEG 溶液（0.2 mL）。使用涡旋振荡器充分混合溶液，数分钟内形成水凝胶。参照表 1中的比例制备具有不同力学强度的水凝胶。
      注意：使用倒管法判断水凝胶是否已形成。
3. 流变学分析
   1. 使用配备平行钢质板（直径：20 mm）的旋转流变仪进行流变学测试。进行凝胶化测试时，将乙二醇壳聚糖溶液（0.2 mL，3 wt%）涂布于下板上，然后将 DF PEG 水溶液（0.2 mL，2 wt%）均匀滴加至壳聚糖溶液表面，并迅速用移液器混合。降下上板，开始测试。
   2. 进行水凝胶刚度测试时，将水凝胶切割成圆形（直径：20 mm），在 1% 应变条件下测量其储能模量（G'）随频率变化的关系。典型 G' 值在 6.3 rad s⁻¹ 下列于表 1中。
      注意：在水凝胶形成后 0.5 小时进行流变学测试，以确保水凝胶中动态键的稳定。
   3. 进行水凝胶自修复性能测试时，将水凝胶切开成若干片段，使其重新接触并自修复为整体。然后将修复后的水凝胶切割成圆形（直径：20 mm），置于流变仪上进行流变学分析。

2. 水凝胶中的三维细胞培养

1. 水凝胶凝胶化溶液的制备
   1. 在无菌试管（4.0 mL）中称取DF PEG（0.44 g，0.11 mmol），加入细胞培养基（RPMI-1640，2.0 mL），使用涡旋振荡器或搅拌器助溶，使聚合物完全溶解，得到20 wt%的聚合物溶液。将溶液转移至注射器（10.0 mL）中，随后通过微孔细菌截留滤器（0.22 µm）过滤除菌。
   2. 称取乙二醇壳聚糖（0.165 g，2.06 × 10^-3 在无菌管（15.0 mL）中加入 mmol 量的物质，再加入细胞培养基（RPMI-1640，4.0 mL），涡旋振荡以促进聚合物溶解，得到 4.0 wt% 的乙二醇壳聚糖溶液。将溶液吸入注射器（10.0 mL）中，并使用 0.22 µm 除菌滤膜过滤。
2. 水凝胶中的细胞培养
   注意：所有与细胞相关的操作均须在组织培养罩内进行。操作者应具备无菌技术的基本知识。
   1. 细胞悬液的制备
      1. 在直径为10 cm的培养皿中，使用添加10% FBS和5%青霉素（10 mL）的RPMI-1640培养基培养L929细胞，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂每天使用前更换培养基。
      2. 用含胰蛋白酶（0.025 w/v %）和EDTA（0.01% w/v）的PBS收集L929细胞，离心（70 × g，5分钟），用RPMI-1640培养基（1.0 mL）重悬细胞。按照血细胞计数板的标准操作进行细胞计数。调整细胞浓度至约3.75 × 10⁵个/mL。⁶ 细胞/毫升
   2. 水凝胶中的细胞包封
      1. 混合L929细胞悬液（0.4 mL，3.75 × 10⁶ 细胞/mL^-1将甘油壳聚糖溶液（0.4 mL）加入离心管（4.0 mL）中，与溶液充分涡旋混合。取L929/甘油壳聚糖溶液（0.8 mL）滴加至共聚焦培养皿（直径2.0 cm）中央。随后加入DF PEG溶液（0.2 mL），轻轻吹打混匀，诱导水凝胶形成。
         注意：通过倾斜培养皿来评估水凝胶的形成情况。
      2. 对于直接细胞培养，在水凝胶上方加入额外的 RPMI-1640 培养基（1.0 mL）。将包埋细胞的水凝胶（1.0 mL，1.5 wt% 乙二醇壳聚糖，4.0 wt% DF PEG，1.5 × 10⁶ 个细胞/mL）置于培养环境中。⁶ 细胞/mL^-1) 置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）₂）并每天更换培养基。在细胞包封后的第1、3、5和7天进行细胞成像准备。
   3. 对于注射后水凝胶中三维细胞培养，使用注射器（10.0 mL，48 G针头）准备含细胞的水凝胶（1.0 mL，参见步骤2.2.2）。水凝胶形成后，缓慢将其注入培养皿中用于共聚焦成像。在水凝胶上方加入额外培养基（1.0 mL），并每日更换。将培养皿置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）₂）并准备后续成像。
      警告：请检查并遵守注射器的安全操作规程。
3. 细胞活力分析
   1. 共聚焦观察
      1. 用 PBS（1.0 mL）冲洗水凝胶两次。加入荧光素二乙酸酯（FDA，0.5 mL，0.05 mg/mL）和碘化丙啶（PI，0.5 mL，0.08 mg/mL）溶液对水凝胶染色 15 分钟。染色后，去除所有溶液。
      2. 使用共聚焦显微镜，在488 nm和543 nm激发波长下观察水凝胶，分别显示活细胞和死细胞。对水凝胶每隔2 µm深度采集z轴层扫图像，以验证细胞在整个水凝胶中的均匀分布。
         注意：FDA 对活细胞进行染色，而 PI 对死细胞进行染色。
   2. 用乙酸（HAc，3 v%，1.0 mL）降解水凝胶（1.0 mL），持续5分钟，然后用移液器转移至4.0 mL离心管中。通过离心（70 × g，5分钟）收集细胞，并将细胞重悬于RPMI-1640细胞培养基（1.0 mL）中。使用血细胞计数板进行细胞计数。

结果

本方案关于水凝胶制备及其作为三维细胞培养应用的示意图见图1。不同力学强度水凝胶的组分及配比信息总结于表1。水凝胶的自愈合性与流变性能通过储能模量随频率变化的测试结果展示于图2。水凝胶中细胞的共聚焦图像及培养天数对应的细胞数量见图3，结果证实了细胞在三维培养条件下的存活能力与增殖能力。图4展示了经注射并进行后续培养后，包埋于水凝胶中细胞的显微镜图像、共聚焦图像以及细胞增殖速率的分析结果。高细胞存活率与增殖能力表明，包埋于水凝胶中的细胞未受到破坏性损伤，并可通过后续培养恢复，从而验证了该水凝胶的可注射性。

讨论

本方案中介绍的水凝胶（图1）包含两种主要成分：天然聚合物乙二醇壳聚糖和一种合成的苯甲醛封端聚合物凝胶剂DF PEG，二者均为生物相容性材料。DF PEG通过一步修饰反应合成。本方案选用分子量为4,000的PEG，主要考虑其溶解性、修饰效率以及水凝胶的刚度。通过使用不同固含量及乙二醇壳聚糖与DF PEG比例，制备了一系列具有不同机械强度的水凝胶。在室温下混合凝胶溶液后，可在数分钟内快速形成均一的水凝胶，尽管稀释溶液可减缓凝胶化速度。采用流变学测试评估不同水凝胶的机械强度。这些水凝胶的储能模量（G'）分别约为900 Pa（柔软）、2,100 Pa（中等）至4,700 Pa（坚硬）（表1和图2A）。该特性归因于在水凝胶网络中增加聚合物凝胶剂含量，从而提高了交联密度，导致储能模量升高（即刚度增强）。水凝胶模量的恢复证实了其自愈合性能（图2B）。已知细胞外基质（ECM）的刚度因组织类型而异，因此通过调节乙二醇壳聚糖与DF PEG凝胶剂之...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙二醇壳聚糖	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90% 脱乙酰度
4-羧基苯甲醛	上海阿拉丁 生物科技有限公司	619-66-9	99%
N,N'-二环己基碳二亚胺	上海阿拉丁 生物科技有限公司	538-75-0	99%
无水氯化钙	上海阿拉丁 生物科技有限公司	10043-52-4	96%
4-二甲氨基吡啶	上海阿拉丁 生物科技有限公司	1122-58	99%
聚乙二醇	国药集团化学试剂有限公司	5254-43-7	99%
四氢呋喃	国药集团化学试剂有限公司	109-99-9	99%
甲苯	国药集团化学试剂有限公司	108-88-3	99%
乙醚	国药集团化学试剂有限公司	60-29-7	99%
乙酸	国药集团化学试剂有限公司	64-19-7	99%
无水 CaCl₂	国药集团化学试剂有限公司	10043-52-4	99%
荧光素二乙酸酯	Sigma	596-09-8	99%
碘化丙啶	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 培养基	Gibco
胎牛血清	Gibco
胰蛋白酶-EDTA	Gibco		0.25%
PBS	Solarbio		0.01 M
青霉素-链霉素溶液	Hyclone		10,000 U/mL
流变仪	TA Instrument		AR-G2
共聚焦显微镜	Zeiss		710-3通道
L929 细胞	ATCC		NCTC 克隆 929；L 细胞，L929，Strain L 的衍生物
旋转蒸发仪	EYELA		N-1100
48 号针头	上海志誉医疗器械有限公司		48 号
显微镜	Leica		DM3000 B
显微镜软件	Imaris
热风枪	Confu		KF-5843
培养皿	NEST