体内 检测抗原特异性T细胞杀伤功能的实验方法——基于疫苗接种模型

摘要

本实验方案的目的是实现对检测 体内 小鼠模型中抗原特异性杀伤靶细胞

摘要

抗原特异性杀伤的现有方法仅限于 体外 在传染病模型中已被使用或利用。然而，目前尚无专门用于在无感染情况下检测抗原特异性杀伤的实验方案。本方案旨在克服这些局限性，通过检测CD8+ T细胞对靶细胞的抗原特异性杀伤作用，提供并描述相应的实验方法。⁺ T细胞 体内通过将疫苗接种模型与传统的CFSE标记靶细胞杀伤实验相结合来实现。这种组合使研究者能够直接且快速地评估抗原特异性CTL潜能，因为该实验不依赖于肿瘤生长或感染过程。此外，实验结果基于流式细胞术，因此大多数研究者均可便捷获取相关数据。该研究的主要局限在于确定时间线 在体 这与所检验的假设相适应。需要仔细评估抗原强度的差异以及T细胞中可能导致不同细胞溶解功能的突变，以确定细胞收获和检测的最佳时间。用于疫苗接种的肽浓度已针对hgp100进行了优化_25-33 和 OVA_257-264，但对于其他可能更适用于特定研究的多肽，还需进一步验证。总体而言，本方案可快速评估杀伤功能 体内 并可针对任何特定抗原进行调整。

引言

评估CD8+ T细胞细胞毒性（CTL）潜能的多种实验方案⁺ 或 CD4⁺ T细胞。该评估可轻松完成 体外 在受控条件下^1,2,3此外，传染病模型（如LCMV）通常通过使用不同浓度CFSE（5-(和6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯）标记的靶细胞来检测CTL功能，其中CFSE^你好-标记的细胞用肽和CFSE进行脉冲处理^lo未标记的靶细胞不进行脉冲处理。随后将细胞以1:1比例注入，并检测CFSE的丢失情况^你好通过流式细胞术检测标记的脉冲靶标⁴. 疫苗与排斥反应模型也采用了类似策略进行评估 体内 由CD8介导的杀伤⁺ 和 CD4⁺ T细胞以及NK细胞^5,6这是一种强大的检测方法，但需要使用能够预先激活免疫系统的感染性试剂，然后再注射靶标物。

另一方面，本方案无需预先感染宿主，而是采用疫苗接种策略，在靶细胞注射前激活免疫系统。该疫苗接种包含一种基于水相....

方案

本文所述所有方法均已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 疫苗用多肽的制备

1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将冻干肽溶解至适当浓度，并涡旋振荡30秒。
   注意：hgp100_25-33的终浓度为1 mg/mL，OVA_257-264的终浓度为0.5 mg/mL。应在注射前重新配制肽溶液，配制后不得保存。

2. 转基因小鼠脾细胞的分离

注意：脾脏细胞的分离必须以无菌方式进行。

1. 使用经批准的 CO₂ 窒息法处死 OT-1 转基因小鼠，并取出脾脏。
   注意：此步骤中应使用针对所选肽段的合适转基因小鼠。
   1. 将小鼠置于其右侧，用 70% 乙醇（EtOH）喷洒小鼠左侧。用镊子提起皮肤，使用手术剪剪开皮肤；脾脏将暴露于腹腔内。轻柔切开腹腔以暴露脾脏，并用镊子取出脾脏。
2. 将脾脏置于含 2 mL 培养基 A（含 1% 胎牛血清（FBS）的 PBS）的培养皿中的 70 µm 滤膜上，用注射器活塞....

结果

在注射CFSE标记的靶细胞之前，需将1:1的细胞混合物上机进行流式细胞仪检测，以确定CFSE^hi 和CFSE^lo靶细胞的基础频率。图1A展示了检测CFSE细胞群变化的设门策略：首先根据FSC和SSC参数设定初始门控，随后对CFSE阳性细胞进行亚群设门，以便进一步评估频率变化，因为与未标记的内源性脾细胞相比，该细胞群相对较小。CFSE^hi 和CFSE^lo 细胞群的相对频率通过将总CFSE阳性细胞群设为100%来计算。该分析可采用直方图或点图形式进行。图1B展示了注射前CFSE细胞群相对频率的示例。该比例很少恰好为1:1，但应大致接近。在图1C中显示了共刺激抗原启动（covax priming）的必要性：注射后2.......

讨论

尽管该方案较为简单，但仍有一些关键步骤必须谨慎操作。在注射待检测的抗原特异性T细胞后，必须进行covax引物接种，才能观察到对脉冲靶细胞的杀伤作用。虽然基于水的covax疫苗接种可能引发急性炎症反应，但对于慢性炎症阶段，用可缓慢释放抗原的油性制剂替代短效的水性配方可能会产生更佳的效果^7,12。

此外，靶细胞在抗原刺激后进行CFSE标记时，需确保标记均匀，以获得理想的流式细胞术检测结果。在该系统中，使用5 µM CFSE^hi 和0.5 µM CFSE^lo 进行标记可产生明显的对数级差异，便于区分不同细胞群。

本方案可根据所测试的特定抗原系统进行简单修改。首先，应确认作为佐剂疫苗组成部分所给予的肽段浓度。确定该合适浓度的一个简单方法是进行免疫，并追踪血液中注射的抗原特异性T细胞的扩增情况。在此情况下，弱抗原（hgp100_25-33）所需的肽段剂量是强.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6至12周龄雌性C57BL/6小鼠	Charles River	027	C57黑6小鼠
OT-1 6-12周龄雌性小鼠	Jackson Labs	003831
hgp10025–33	CPCScientific	834139	KVPRNQDWL
OVA 257–264	CPCScientific	MISC-012	SIINFEKL
5%咪喹莫特乳膏	Fougera	51672-4145-6	Aldara乳膏
CD40特异性单克隆抗体	BioXcell	BE0016-2	克隆株FGK4.5
rhIL-2蛋白	Hoffman LaRoche Inc	136	重组人IL-2蛋白
70%异丙醇消毒液	Kendall	S-17474
PBS	Life Technologies	10010-023	磷酸盐缓冲液
FBS	Life Technologies	26140-079	胎牛血清
RBC裂解液	Life Technologies	A10492-01	红细胞裂解缓冲液
RPMI 1640培养基	Life Technologies	11875119
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030081
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122	青霉素/链霉素
CFSE	Life Technologies	C34554	5-(和6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4503
1.5 mL MCT刻度天然	Fisher	05-408-129	微量离心管
70%乙醇	Fisher	BP8201500	EtOH
台盼蓝溶液，0.4%	Life Technologies	15250-061
血细胞计数板	Fisher	267110
27号针头	BD	305109
1 mL注射器	BD	309659