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方法文章

体内 检测抗原特异性T细胞杀伤功能的实验方法——基于疫苗接种模型

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DOI：

10.3791/56255

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2017年11月28日

 ,  ,  , 
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案的目的是实现对检测 体内 小鼠模型中抗原特异性杀伤靶细胞

摘要

抗原特异性杀伤的现有方法仅限于 体外 在传染病模型中已被使用或利用。然而，目前尚无专门用于在无感染情况下检测抗原特异性杀伤的实验方案。本方案旨在克服这些局限性，通过检测CD8+ T细胞对靶细胞的抗原特异性杀伤作用，提供并描述相应的实验方法。+ T细胞 体内通过将疫苗接种模型与传统的CFSE标记靶细胞杀伤实验相结合来实现。这种组合使研究者能够直接且快速地评估抗原特异性CTL潜能，因为该实验不依赖于肿瘤生长或感染过程。此外，实验结果基于流式细胞术，因此大多数研究者均可便捷获取相关数据。该研究的主要局限在于确定时间线 在体 这与所检验的假设相适应。需要仔细评估抗原强度的差异以及T细胞中可能导致不同细胞溶解功能的突变，以确定细胞收获和检测的最佳时间。用于疫苗接种的肽浓度已针对hgp100进行了优化25-33 和 OVA257-264，但对于其他可能更适用于特定研究的多肽，还需进一步验证。总体而言，本方案可快速评估杀伤功能 体内 并可针对任何特定抗原进行调整。

引言

评估CD8+ T细胞细胞毒性（CTL）潜能的多种实验方案+ 或 CD4+ T细胞。该评估可轻松完成 体外 在受控条件下1,2,3此外，传染病模型（如LCMV）通常通过使用不同浓度CFSE（5-(和6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯）标记的靶细胞来检测CTL功能，其中CFSE你好-标记的细胞用肽和CFSE进行脉冲处理lo未标记的靶细胞不进行脉冲处理。随后将细胞以1:1比例注入，并检测CFSE的丢失情况你好通过流式细胞术检测标记的脉冲靶标4. 疫苗与排斥反应模型也采用了类似策略进行评估 体内 由CD8介导的杀伤+ 和 CD4+ T细胞以及NK细胞5,6这是一种强大的检测方法，但需要使用能够预先激活免疫系统的感染性试剂，然后再注射靶标物。

另一方面，本方案无需预先感染宿主，而是采用疫苗接种策略，在靶细胞注射前激活免疫系统。该疫苗接种包含一种基于水相的多肽疫苗制剂，需联合使用一种名为covax7的免疫刺激混合物，该混合物由Toll样受体7（TLR7）激动剂（咪喹莫特乳膏）、激动型抗CD40抗体和白细胞介素-2（IL-2）组成，可协同作用，诱导多肽特异性免疫启动并产生强烈的免疫应答。因此，该检测可在疫苗接种后快速评估CTL功能，因为疫苗与待评估细胞在靶细胞注射前仅三天同时给予。此外，covax引发的免疫反应足够强烈，可在注射靶细胞后4至24小时内观察到致敏的抗原特异性T细胞的杀伤能力。

该方案的主要局限在于确定时间线 体内 用于检测针对特定抗原及待验证假设的靶细胞杀伤效应。必须进行仔细评估，因为抗原强度的差异以及T细胞中待检测的遗传修饰可能导致CTL功能的不同，从而需要在不同时间点检测靶细胞杀伤效果。此外，尽管针对人黑色素瘤抗原糖肽100（hgp100）的疫苗接种肽浓度已在人体中优化25-33）和卵清蛋白257-264 （OVA257-264)8,9, 使用另一种可能更适用于特定研究的抗原模型需要进一步验证。由于不同靶抗原在联合covax作为佐剂时刺激CTL效应功能的能力可能存在预期差异，因此优化IL-2的剂量浓度和给药频率对于实现预期目标可能至关重要。总体而言，本方案可实现对杀伤功能的快速评估 体内 并可针对任何特定抗原进行调整。

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方案

本文所述所有方法均已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 疫苗用多肽的制备

  1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将冻干肽溶解至适当浓度，并涡旋振荡30秒。
    注意：hgp10025-33的终浓度为1 mg/mL，OVA257-264的终浓度为0.5 mg/mL。应在注射前重新配制肽溶液，配制后不得保存。

2. 转基因小鼠脾细胞的分离

注意：脾脏细胞的分离必须以无菌方式进行。

  1. 使用经批准的 CO2 窒息法处死 OT-1 转基因小鼠，并取出脾脏。
    注意：此步骤中应使用针对所选肽段的合适转基因小鼠。
    1. 将小鼠置于其右侧，用 70% 乙醇（EtOH）喷洒小鼠左侧。用镊子提起皮肤，使用手术剪剪开皮肤；脾脏将暴露于腹腔内。轻柔切开腹腔以暴露脾脏，并用镊子取出脾脏。
  2. 将脾脏置于含 2 mL 培养基 A（含 1% 胎牛血清（FBS）的 PBS）的培养皿中的 70 µm 滤膜上，用注射器活塞末端碾压脾脏以分散组织。
    1. 收集培养皿中的脾细胞并转移至 50 mL 圆底离心管中。用 5 mL 培养基 A 洗涤培养皿两次，以回收全部细胞。加入培养基 A 至总体积 25 mL，室温下以 475 × g 离心 5 分钟。
  3. 吸除上清液，将细胞重悬于每只脾脏 1 mL 的红细胞（RBC）裂解缓冲液中。室温孵育 5 分钟。加入 10 mL 培养基 A，以 475 × g 室温离心。将细胞沉淀重悬于 10 mL 培养基 A 中，并通过 70 µm 滤膜过滤至洁净的 50 mL 圆底离心管中以去除碎片。
  4. 使用台盼蓝和血细胞计数板计数细胞。将细胞重悬于 PBS 中，终浓度为 106 –1006 个细胞/mL。对于 OVA257-264 特异性杀伤实验，重悬至 106 个细胞/mL；对于 hgp10025-33 特异性杀伤实验，重悬至 1006 个细胞/mL。
    1. 室温下以 475 × g 离心 5 分钟收集剩余细胞。吸除上清液，加入 15 mL 冷 PBS 重悬洗涤细胞。重复洗涤一次。再次于室温下以 475 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，根据步骤 2.4 确定的最终体积，用冷 PBS 重悬细胞。
    2. 将单细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中，置于冰上保存，直至注射入受体 C57/BL6 小鼠体内。

3. 转基因小鼠脾细胞的注射

  1. 将受体 C57/BL6 小鼠置于固定器中，背部朝上。用 70% 异丙醇喷洒尾部注射基部区域。使用 27 G 针头（针尖斜面朝上）将 100 µL 单细胞悬液（第 2 节）通过尾静脉静脉注射。

4. Covax 的给药

注意：如果细胞在下午注射，则应在细胞注射后18小时内于次日上午给予covax。

  1. 将小鼠放入透明麻醉盒中，使用1 - 3%异氟烷进行麻醉。待小鼠完全麻醉后，将其转移至连接于麻醉舱主路的鼻罩上，保持小鼠仰卧位并固定。
    注意：通过轻捏脚趾观察是否出现回缩反应，以确认麻醉效果。根据联邦法律，异氟烷的使用须由持证兽医授权。
  2. 用70%异丙醇喷洒尾根部注射区域。使用27 G针头将100 µL肽溶液（来自第1节）皮下注射至尾根部，进针深度为4 - 5 mm，针尖斜面朝上。
    注意：小鼠在尾根部一侧进行皮下疫苗接种10。
  3. 在疫苗注射部位侧方注射100 µL抗CD40抗体（0.5 mg/mL储备液）。
  4. 在免疫接种部位小心涂抹咪喹莫特乳膏，每只小鼠50 mg。揉搓乳膏表面直至乳膏不可见且完全吸收。
  5. 在小鼠下腹部区域进行腹腔内（i.p.）注射100 µL重组人IL-2蛋白（100,000 IU/mL）。待小鼠从麻醉中完全恢复后，继续观察5分钟。
    注意：实验在此阶段暂停3天。

5. 用CFSE标记靶向脾细胞的分离

注意：脾脏细胞的分离必须以无菌方式进行。

  1. 根据批准的 CO2 窒息方法处死 C57BL/6 小鼠。按照步骤 2.1.1 去除脾脏。按照步骤 2.2.1 - 2.2.3 将脾脏组织分散并洗涤脾细胞。按照步骤 2.3 - 2.3.2 裂解红细胞。
  2. 取细胞用血细胞计数板进行计数，并计算细胞终浓度为 106 个细胞/mL，置于 CFSE 标记溶液中（见步骤 7）。其余细胞在室温下以 475 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。

6. 靶脾细胞的肽段孵育

注意：肽脉冲必须以无菌方式进行。

  1. 用完全培养基（含10% FBS、1% L-谷氨酰胺（L-Gln）、1% 青霉素/链霉素（Pen/Strep）的RPMI 1640培养基）将细胞重悬至浓度为106 个细胞/mL。将细胞分装至2个离心管（15 mL锥形管）中。将每管分别标记为“加肽”和“未加肽”。
  2. 向标记为“加肽”的管中加入肽段。进行OVA257-264 肽段刺激时，加入1 µg/mL；进行hgp10025-33 肽段刺激时，加入2 µg/mL。
    ​注意：未加肽的细胞与加肽细胞经历相同的孵育过程，仅不添加肽段。
    1. 将细胞与肽段在37 °C孵育1小时。
  3. 向每管中加入10 mL完全培养基（含10% FBS、1% L-谷氨酰胺（L-Gln）、1% 青霉素/链霉素（Pen/Strep）的RPMI 1640培养基），以洗涤加肽和未加肽的靶细胞。在室温下以475 × g离心5分钟，收集细胞。吸除上清液。

7. 靶脾细胞CFSE标记的准备

  1. 在步骤6.3细胞洗涤过程中配制CFSE标记溶液；脉冲刺激的细胞将被标记为CFSEhi，未脉冲刺激的细胞标记为CFSElo。每106个细胞准备1 mL CFSE标记溶液。
    ​注意：CFSE对光敏感，应始终避光操作。
    1. 通过向含2% FBS的RPMI 1640培养基中加入1 µL/mL CFSE（5 mM储存液），配制终浓度为5 µM/mL的CFSEhi标记培养基。
    2. 通过向含2% FBS的RPMI 1640培养基中加入1 µL/mL CFSE（0.5 mM储存液），配制终浓度为0.5 µM/mL的CFSElo标记培养基。

8. 使用 CFSE 标记靶向脾细胞

注意：CFSE 标记必须以无菌方式进行。

  1. 将已脉冲和未脉冲的靶细胞（来自步骤6.3）重悬于106 细胞/mL CFSE标记培养基。将已处理的细胞重悬于制备好的CFSE你好- 使用制备好的CFSE对未脉冲的细胞和标记培养基进行标记lo标记培养基。
  2. 轻柔翻转或涡旋混匀细胞与CFSE标记培养基，切勿使用涡旋振荡器混匀。将细胞与CFSE标记培养基于37 °C孵育15分钟，每5分钟重新混匀一次。
  3. 向每种细胞悬液中加入 10 mL 完全培养基，在室温下以 475 × g 离心 5 分钟。
  4. 吸弃上清液，将细胞重悬于10 mL冷的PBS中。在4 °C、475 × g条件下离心5 min。
  5. 重复步骤 8.4。
  6. 计数细胞并混合肽脉冲的CFSE你好-用未脉冲的CFSE标记lo-labeled 细胞按1:1比例混合，用于注射至受体小鼠。保留一份1×10⁶的等分试样6 用于基线流式细胞术评估的混合细胞（第11节）。
    注意：每只小鼠的最终注射体积为 100 µL，最终细胞数量为 10e6 个细胞。需考虑注射器和针头中的液体损耗，损耗量应估计为 500 µL。

9. 靶细胞的注射

注意：CFSE标记的细胞在注射前和注射过程中应尽可能避免光照。

  1. 将受体C57BL/6小鼠置于固定器中，背部朝上。用70%异丙醇喷洒尾部注射部位。将100 µL单细胞悬液经尾静脉静脉注射，针尖斜面朝上。

10. 目标细胞的再次分离

注意：此步骤的时间至关重要，取决于CTL的细胞毒性以及抗原刺激的强度。在评估OVA257-264 肽脉冲靶细胞的杀伤效果时，细胞需在注射后4–6小时收集。由于CFSE标记的细胞对光敏感，脾脏处理过程需避光进行。

  1. 根据批准的 CO2 窒息方法处死受体 C57BL/6 小鼠。
  2. 按照步骤 2.1.1 取出脾脏。按照步骤 2.2.1 - 2.2.3 将脾脏组织分散并洗涤脾细胞。按照步骤 2.3 - 2.3.2 裂解红细胞。
  3. 将细胞重悬于 1 mL 荧光激活细胞分选（FACs）缓冲液（1% BSA + PBS）中，用于流式细胞术检测。

11. 通过流式细胞术确定CTL活性的门控逻辑

  1. 使用标准流式细胞术方案评估CTL活性。在流式细胞仪上使用488 nm激光激发，通过FITC通道获取细胞11。
    1. 根据前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）参数圈选活淋巴细胞。在活淋巴细胞门内进一步圈选总CFSE阳性细胞群。
      注意：注射的CFSE标记细胞仅占脾脏中全部淋巴细胞的一小部分。CFSE阳性细胞在对数尺度下应呈现为两个明显不同的群体。
    2. 采用直方图形式确定未负载抗原（左侧峰，CFSElo）和负载抗原（右侧峰，CFSEhi）细胞群的百分比。CFSEhi细胞的减少表明存在抗原特异性的CTL活性。

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结果

在注射CFSE标记的靶细胞之前，需将1:1的细胞混合物上机进行流式细胞仪检测，以确定CFSEhi 和CFSElo靶细胞的基础频率。图1A展示了检测CFSE细胞群变化的设门策略：首先根据FSC和SSC参数设定初始门控，随后对CFSE阳性细胞进行亚群设门，以便进一步评估频率变化，因为与未标记的内源性脾细胞相比，该细胞群相对较小。CFSEhi 和CFSElo 细胞群的相对频率通过将总CFSE阳性细胞群设为100%来计算。该分析可采用直方图或点图形式进行。图1B展示了注射前CFSE细胞群相对频率的示例。该比例很少恰好为1:1，但应大致接近。在图1C中显示了共刺激抗原启动（covax priming）的必要性：注射后2...

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讨论

尽管该方案较为简单，但仍有一些关键步骤必须谨慎操作。在注射待检测的抗原特异性T细胞后，必须进行covax引物接种，才能观察到对脉冲靶细胞的杀伤作用。虽然基于水的covax疫苗接种可能引发急性炎症反应，但对于慢性炎症阶段，用可缓慢释放抗原的油性制剂替代短效的水性配方可能会产生更佳的效果7,12。

此外，靶细胞在抗原刺激后进行CFSE标记时，需确保标记均匀，以获得理想的流式细胞术检测结果。在该系统中，使用5 µM CFSEhi 和0.5 µM CFSElo 进行标记可产生明显的对数级差异，便于区分不同细胞群。

本方案可根据所测试的特定抗原系统进行简单修改。首先，应确认作为佐剂疫苗组成部分所给予的肽段浓度。确定该合适浓度的一个简单方法是进行免疫，并追踪血液中注射的抗原特异性T细胞的扩增情况。在此情况下，弱抗原（hgp10025-33）所需的肽段剂量是强...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院研究基金（A1R03AI120027（RN）和1R21AI20012（RN））、机构研究基金（RN）、启动基金（RN）以及MD安德森癌症中心CIC种子基金（RN）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6至12周龄雌性C57BL/6小鼠 Charles River027C57黑6小鼠
OT-1 6-12周龄雌性小鼠 Jackson Labs003831
hgp10025–33 CPCScientific834139KVPRNQDWL
OVA 257–264 CPCScientificMISC-012SIINFEKL
5%咪喹莫特乳膏 Fougera51672-4145-6Aldara乳膏
CD40特异性单克隆抗体 BioXcellBE0016-2克隆株FGK4.5
rhIL-2蛋白 Hoffman LaRoche Inc136重组人IL-2蛋白
70%异丙醇消毒液 KendallS-17474
PBSLife Technologies10010-023磷酸盐缓冲液
FBSLife Technologies26140-079胎牛血清
RBC裂解液 Life TechnologiesA10492-01红细胞裂解缓冲液
RPMI 1640培养基Life Technologies11875119
L-谷氨酰胺 Life Technologies25030081
青霉素/链霉素Life Technologies15140122青霉素/链霉素
CFSELife TechnologiesC345545-(和6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯
牛血清白蛋白（BSA）Sigma A4503
1.5 mL MCT刻度天然 Fisher05-408-129微量离心管
70%乙醇FisherBP8201500EtOH
台盼蓝溶液，0.4%  Life Technologies15250-061
血细胞计数板Fisher267110
27号针头BD305109
1 mL注射器BD309659

参考文献

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
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