利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs

摘要

本方案详细描述了在无饲养层条件下，从人胰腺细胞生成无足迹诱导多能干细胞（iPSCs）的过程，随后利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白进行基因编辑，并对经修饰的单细胞克隆进行表征分析。

摘要

胚胎干细胞和诱导性多能干细胞具有自我更新能力，并可分化为机体多种细胞类型。因此，这类多能细胞在再生医学研究中备受关注，目前正用于眼科疾病、糖尿病、心脏病及其他疾病的临床试验。由于其具备向特化细胞类型分化的潜能，加之近年来基因组编辑技术（包括CRISPR/Cas系统）的进展，为定制化改造iPSC基因组以实现多种应用（如疾病建模、基因治疗以及调控分化通路等）提供了更多机遇。在现有的基因编辑技术中，源自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统已成为真核生物基因组位点特异性编辑的首选工具。CRISPR技术易于获取、成本低廉且在实现靶向编辑方面效率极高。该系统需要一种Cas9核酸酶以及一段20个核苷酸长度的向导序列，该序列需与基因组靶位点相邻并紧邻一个3个核苷酸的"NGG"原间隔序列邻近基序（PAM），以引导Cas9定位至目标基因组位点，同时还需要一段通用的Cas9结合骨架RNA（两者合称为单链向导RNA或sgRNA）。本文提供了一套高效生成无饲养层依赖且无痕迹残留的iPSC的逐步操作方案，并介绍了利用Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物对iPSC进行基因组编辑的方法。该基因组编辑方案高效可靠，可通过将针对多个靶点的sgRNA预先与Cas9蛋白形成复合物，并同时导入细胞，从而轻松实现多重编辑。最后，我们描述了一种简化的策略，用于鉴定和表征携带目标编辑的iPSC。综上所述，这些所概述的策略有望显著简化iPSC的制备与编辑流程，以支持其在多种应用场景中的广泛使用。

引言

通过过表达重编程因子将人类体细胞重编程为多能状态，已在疾病建模、再生医学和药物开发等领域彻底改变了干细胞研究。目前已有多种非病毒性重编程方法可用于递送重编程因子并生成诱导多能干细胞（iPSCs），但该过程劳动强度大且效率较低¹。病毒性方法虽然效率较高，但存在病毒整合和致瘤性的风险^2,3,4。在本研究中，我们报道使用细胞质内的仙台病毒递送重编程因子，建立无基因组整合痕迹的诱导多能干细胞系，其基因组中不含有任何病毒载体序列⁵。仙台病毒是一种RNA病毒，在感染后约经过10代传代即可从细胞质中被稀释清除，同时能高效表达重编程因子，从而实现快速而高效的重编程^6,7。所建立的诱导多能干细胞可轻松转换至无饲养层培养基 ，以避免使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层细胞⁸。

本文除了概述仙台病毒介导的重编程方法外，还描述了一种改进的诱导多能干细胞（iPSC）编辑方案，该方案有望为研究提供具有特定基因修饰的无限量人类细胞。我们采用CRI....

方案

1. 重编程方案

1. 从人原代胰腺细胞生成人诱导多能干细胞（iPSC）
   1. 用1.5 mg/mL的冷胶原蛋白包被6孔板，并在37 °C下凝胶化1小时。
   2. 在转导前第-2天，将早期传代的人原代胰腺细胞以约1 - 1.5 × 10⁵个细胞接种于胶原蛋白包被的6孔板中，使用Prigrow III培养基，使转导当天（第0天）每孔细胞数达到约2.5 × 10⁵个或汇合度至少为60%。首次实验时，至少接种2-3孔，以确保第0天有一孔达到理想汇合度。至少保留一孔作为对照用于细胞计数。
   3. 在转导当天（第0天），将每孔所需的1 mL Prigrow III培养基在水浴中预热至37 °C。用1 mL含10%胎牛血清（FBS）的培养基重悬一孔对照细胞，加入1 mL胰蛋白酶/EDTA消化5分钟或直至细胞脱落，进行细胞计数。配制10% FBS培养基的方法：在DMEM中加入10% FBS、1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠和1%非必需氨基酸。
   4. 使用细胞计数仪计数并检测细胞活力，根据细胞数量和病毒滴度计算每种病毒所需体积。对胰腺细胞使用以下感染复数（MOI）：KOS = 5，hc-Myc = 5，hKlf4 = 3。
   5. 将一组保存于-80 °C的仙台病毒载体管置于冰上解冻，小心地将三种仙台病毒载体按计算体积加入1 mL已预热至37 °C的Prigrow III培养基....

结果

本文中，我们采用了一种简单而高效的方案，利用可整合或无整合足迹的仙台病毒载体，将人胰腺细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。图1A展示了该重编程方案的示意图。人胰腺细胞为商业购买，使用Prigrow III培养基进行培养，并按前述方法用仙台病毒进行转导。在第0天转导仙台病毒后，转导后的梭形胰腺细胞在约5天内未见任何形态学变化，随后逐渐变圆，细胞核和核仁增大。转导后约一周可见少量早期克隆，但未进行挑取，因为根据我们的经验，这些克隆容易迅速解离，通常属于“早期部分重编程细胞”，无法形成稳定的克隆。转导后约10至15天，出现小而明亮的克隆，并在生长后进行挑取（图1B，右上）。人iPSC克隆结构紧凑、细胞排列紧密、边缘清晰（被认为是“完全重编程细胞”）（图1B，第23天，中下）；而“部分重编程细胞”则结构松散，克隆内存在间隙（

讨论

将人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）极大地推动了基础生物学研究、个性化医学、疾病建模、药物开发和再生医学等领域的发展¹⁶。目前许多广泛应用的人类iPSC生成方法依赖于病毒载体，存在整合到宿主基因组的风险，或使用附加体型载体，但重编程效率较低。本文介绍一种利用仙台病毒从人类胰腺细胞高效生成无饲养层iPSC的方法，可实现无“足迹”且高效的重编程。所获得的人类iPSC不含病毒转基因，维持多能性，并避免使用未知的外源因子。在无饲养层条件下生成iPSC时重编程效率较低，因此我们先在饲养细胞上对原代胰腺细胞进行重编程，随后将形成的克隆转移至无饲养层 膜上进行扩增、培养和鉴定。该技术的结合实现了稳定、可靠且更高效的iPSC重编程。

我们还利用该方法从人成纤维细胞及其他原代细胞生成了诱导多能干细胞（iPSCs），这表明仙台病毒可用于重编程多种类型的细胞。重要注意事项包括：待重编程的原代细胞需达到最佳汇合度， 细胞数量过少或过多均会影响重编程效率；应使用处于最佳增殖状态的早期传代原代细胞；谨慎滴定病毒载体，以实现最低程度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仙台病毒载体 - CytoTune-iPS 2.0 试剂盒	Invitrogen	A16517	冰上解冻；货号：1
胰蛋白酶 EDTA	Gibco Life Tech	25300-054	0.05%，100 ml；货号：2
ROCK 抑制剂 (Y-27632)	Milipore	SCM075	使用 10 μM；货号：3
DMEM/F-12 培养基	Invitrogen	11330-032	货号：4
血清替代物 (KSR)	Gibco	10828028	货号：5
DMEM	Invitrogen	11960069	1X；货号：6
胎牛血清	Thermo Scientific	SH30071.03	分装；货号：7
L-谷氨酰胺 (Glutamax, 100X)，液体	Thermo Scientific	35050061	1/100；货号：8
非必需氨基酸	Gibco	11140-050	1/100；货号：9
2-巯基乙醇	Gibco	21985023	55 mM，1/1,000；货号：10
Hausser 血细胞计数板	Hausser Scientific	02-671-54	货号：11
0.1% 明胶溶液	STEMCELL Technologies	7903	37ºC 孵育 1 小时；货号：12
SSEA-4 抗体	Santacruz	sc-21704	1/100；货号：13
TRA-1-81 抗体	Cell Signaling	4745S	1/200；货号：14
OCT4 抗体	Santa Cruz	sc-5279	1/1,000；货号：15
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源	Life Technologies	A10483-01	保持低温；货号：16
Alexa Fluor 荧光染料 488/568（二抗）	Invitrogen	A21202/A10042	1/2,000；货号：17
DPBS	Hyclone	SH30028LS	1X；货号：18
100 mm 组织培养皿	Falcon	353003	货号：20
96 孔组织培养板	Falcon	353078	货号：21
6 孔组织培养板	Falcon	353046	货号：22
解剖显微镜	Nikon	SMZ745	货号：23
挑取操作罩	NuAire	NU-301	货号：24
15 ml 离心管	Greiner Bio-One	188271	货号：25
50 ml 离心管	Greiner Bio-One	227261	货号：26
丙酮酸钠	Invitrogen	11360	货号：28
β-巯基乙醇	Sigma	M7522	货号：29
Prigrow III 培养基	ABM	TM003	货号：31
Countess™ 细胞计数仪	Invitrogen	C10227	货号：32
Faxitron X 射线系统	Faxitron	CellRad	货号：33
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104	货号：34
胶原酶	Life Technologies	17104019	1 mg/ml 储存液；货号：35
分散酶	STEMCELL Technologies	7923	货号：36
适用于人胚胎干细胞的基质胶 (matrigel)	BD Biosciences	354277	稀释时使用冷的 DMEM/F-12；货号：37
bFGF	R & D	233-FB	储存液 10 ug/ml；货号：38
多聚甲醛	EMS	15710	4% 储存液（PBS 配制）；货号：39
TRA-1-60	Santa Cruz	sc-21705	1/100；货号：40
NANOG	ReproCELL	RCAB0004P-F	1/100；货号：41
吐温 20	Sigma	P9416-100ML	货号：42
碱性磷酸酶检测试剂盒	Stemgent	00-0055	货号：43
Cas9 蛋白	PNA Bio	CP01-50	解冻后分装；货号：44
山羊或驴血清	Sigma	D9663/G9023	货号：45
Triton X-100	Sigma	X100-100ML	货号：46
DAPI	Thermo Scientific	D1306	货号：47
Tris	Sigma	9285-100ML	货号：48
NaCl	Sigma	S7653-250G	货号：49
EDTA	Sigma	BP2482-500	货号：50
T4 DNA 连接酶	NEB	M0202T	货号：51
Mega Shortscript T7 试剂盒	Thermo Scientific	AM1354	货号：52
Mega Clear 试剂盒	Thermo Scientific	AM1908	货号：53
SMC4	BD Biosciences	354357	货号：54
纤连蛋白	STEMCELL Technologies	7159	货号：55
CloneJET 克隆试剂盒	Thermo Scientific	K1232	货号：56
Fragment analyzerTM	Advanced Analytical		货号：57
mTeSR1 培养基试剂盒	STEMCELL Technologies	5850	恢复至室温；货号：58
冻存培养基 mFreSR™	STEMCELL Technologies	5855	货号：59
冻存培养基 CryoStor®	STEMCELL Technologies	7930	货号：60
MEFs	Globalstem	GSC-6301G	货号：61
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030081	货号：62
人胰腺细胞	ABM	T0159	货号：63
STEMdiff™ 神经诱导培养基	Stemcell Technologies	5835	货号：64
RPMI	Thermofisher	11875-093	货号：65
2% B27-胰岛素	Thermofisher	A1895601	货号：66
CHIR99021	Stemcell Technologies	72052	货号：67
IWP4	Stemcell Technologies	72552	货号：68
2% B27	Thermofisher	17504044	货号：69
MCDB 131	Life Technologies	10372019	货号：70
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S8761-100ML	货号：71
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-100G	货号：72
BSA	Proliant	68700	货号：73
GDF8	Pepro-Tech	120-00	货号：74
TUJ1 抗体	EMD Milipore	AB9354	货号：75
NKX2-5 抗体	Santa Cruz	Sc-14033	货号：76
SOX17 抗体	R & D systems	AF1924	货号：77
碘化丙啶	Thermo Scientific	P3566	货号：78
Amaxa 4D-核转染仪™	Lonza	AAF-1002	货号：79
FACSAria II（细胞分选仪）	BD biosciences	SORP UV	货号：80