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方法文章

利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs

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DOI：

10.3791/56260

⸱

2017年11月8日

 ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Animal Bioscience and Biotechnology Laboratory, ARS, USDA, 3NIH Stem Cell Unit, Bethesda, National Institutes of Health, 4RenOVAte Biosciences Inc

本文内容

摘要

本方案详细描述了在无饲养层条件下，从人胰腺细胞生成无足迹诱导多能干细胞（iPSCs）的过程，随后利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白进行基因编辑，并对经修饰的单细胞克隆进行表征分析。

摘要

胚胎干细胞和诱导性多能干细胞具有自我更新能力，并可分化为机体多种细胞类型。因此，这类多能细胞在再生医学研究中备受关注，目前正用于眼科疾病、糖尿病、心脏病及其他疾病的临床试验。由于其具备向特化细胞类型分化的潜能，加之近年来基因组编辑技术（包括CRISPR/Cas系统）的进展，为定制化改造iPSC基因组以实现多种应用（如疾病建模、基因治疗以及调控分化通路等）提供了更多机遇。在现有的基因编辑技术中，源自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统已成为真核生物基因组位点特异性编辑的首选工具。CRISPR技术易于获取、成本低廉且在实现靶向编辑方面效率极高。该系统需要一种Cas9核酸酶以及一段20个核苷酸长度的向导序列，该序列需与基因组靶位点相邻并紧邻一个3个核苷酸的"NGG"原间隔序列邻近基序（PAM），以引导Cas9定位至目标基因组位点，同时还需要一段通用的Cas9结合骨架RNA（两者合称为单链向导RNA或sgRNA）。本文提供了一套高效生成无饲养层依赖且无痕迹残留的iPSC的逐步操作方案，并介绍了利用Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物对iPSC进行基因组编辑的方法。该基因组编辑方案高效可靠，可通过将针对多个靶点的sgRNA预先与Cas9蛋白形成复合物，并同时导入细胞，从而轻松实现多重编辑。最后，我们描述了一种简化的策略，用于鉴定和表征携带目标编辑的iPSC。综上所述，这些所概述的策略有望显著简化iPSC的制备与编辑流程，以支持其在多种应用场景中的广泛使用。

引言

通过过表达重编程因子将人类体细胞重编程为多能状态，已在疾病建模、再生医学和药物开发等领域彻底改变了干细胞研究。目前已有多种非病毒性重编程方法可用于递送重编程因子并生成诱导多能干细胞（iPSCs），但该过程劳动强度大且效率较低1。病毒性方法虽然效率较高，但存在病毒整合和致瘤性的风险2,3,4。在本研究中，我们报道使用细胞质内的仙台病毒递送重编程因子，建立无基因组整合痕迹的诱导多能干细胞系，其基因组中不含有任何病毒载体序列5。仙台病毒是一种RNA病毒，在感染后约经过10代传代即可从细胞质中被稀释清除，同时能高效表达重编程因子，从而实现快速而高效的重编程6,7。所建立的诱导多能干细胞可轻松转换至无饲养层培养基 ，以避免使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层细胞8。

本文除了概述仙台病毒介导的重编程方法外，还描述了一种改进的诱导多能干细胞（iPSC）编辑方案，该方案有望为研究提供具有特定基因修饰的无限量人类细胞。我们采用CRISPR/Cas9技术对iPSC进行基因修饰，该技术目前已被广泛应用于多种领域，包括基因敲入和敲除、大规模基因组删除、基因发现的文库筛选、多种模式生物的遗传改造以及基因治疗9,10,11。该技术涉及由酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）来源的Cas9核酸酶与20个核苷酸长度的向导RNA形成复合物，通过与原间隔序列相邻基序（PAM）3'端附近的基因组靶序列进行碱基配对，实现靶点识别。Cas9核酸酶在PAM位点上游约3个核苷酸处诱导产生双链断裂，随后主要通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复，导致开放阅读框中发生插入或缺失，从而实现基因的功能性敲除12。

我们改进的实验方案包含了人胰腺细胞的培养细节，以及在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上进行重编程以提高重编程效率的方法，随后将细胞适应于无饲养层的Matrigel培养体系，对建立的诱导多能干细胞（iPSCs）进行表征，设计并制备CRISPR引导RNA，以核糖核蛋白（RNP）复合物形式递送至iPSCs中，通过单细胞分选获得基因编辑iPSC的克隆系，简便地筛选和鉴定基因编辑事件，并对单细胞克隆进行表征。本研究中，通过导入Cas9蛋白和两个CRISPR sgRNA RNP复合物，诱导产生双链断裂（DSBs），从而高效地实现了基因组片段的删除。该方法利用两个向导RNA靶向开放阅读框区域以生成缺失，依赖非同源末端连接（NHEJ）的高效率，从而显著减少需要表征的克隆数量，并可通过自动化毛细管电泳仪（fragment analyzer）对克隆进行快速的初步筛选。这些高效的基因组编辑方法将人干细胞疾病模型的构建推进为干细胞实验室中的标准和常规操作。最终，精确的基因组编辑将使研究超越干细胞疾病建模的范畴，并有望推动细胞治疗的发展。

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方案

1. 重编程方案

  1. 从人原代胰腺细胞生成人诱导多能干细胞（iPSC）
    1. 用1.5 mg/mL的冷胶原蛋白包被6孔板，并在37 °C下凝胶化1小时。
    2. 在转导前第-2天，将早期传代的人原代胰腺细胞以约1 - 1.5 × 105个细胞接种于胶原蛋白包被的6孔板中，使用Prigrow III培养基，使转导当天（第0天）每孔细胞数达到约2.5 × 105个或汇合度至少为60%。首次实验时，至少接种2-3孔，以确保第0天有一孔达到理想汇合度。至少保留一孔作为对照用于细胞计数。
    3. 在转导当天（第0天），将每孔所需的1 mL Prigrow III培养基在水浴中预热至37 °C。用1 mL含10%胎牛血清（FBS）的培养基重悬一孔对照细胞，加入1 mL胰蛋白酶/EDTA消化5分钟或直至细胞脱落，进行细胞计数。配制10% FBS培养基的方法：在DMEM中加入10% FBS、1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠和1%非必需氨基酸。
    4. 使用细胞计数仪计数并检测细胞活力，根据细胞数量和病毒滴度计算每种病毒所需体积。对胰腺细胞使用以下感染复数（MOI）：KOS = 5，hc-Myc = 5，hKlf4 = 3。
    5. 将一组保存于-80 °C的仙台病毒载体管置于冰上解冻，小心地将三种仙台病毒载体按计算体积加入1 mL已预热至37 °C的Prigrow III培养基中，轻轻吹打混匀。一个6孔板中的单孔足以用于仙台病毒载体转导以生成重编程细胞。
    6. 吸除细胞中的Prigrow III培养基，缓慢加入重编程病毒混合液至含细胞的孔中。将细胞置于37 °C、5% CO2湿化培养箱中过夜培养。
    7. 次日（转导后24小时），小心弃去病毒混合液，更换为新鲜Prigrow III培养基。继续培养5天，每隔一天更换一次培养基。
    8. 第5天，在预先用0.1%明胶包被的10 cm培养皿中接种MEFs（1.3 × 106个细胞/皿）。在T175培养瓶中培养MEFs至第4天，然后在第5天接种前，用γ射线源对细胞进行6,000拉德照射13，或使用商业来源的MEFs。
    9. 第6天，使用1 mL细胞解离液处理10分钟以解离转导后的细胞，将所有细胞接种至含ROCK抑制剂（5 mM母液，终浓度10 µM）的Prigrow III培养基中的MEF培养皿中，并在37 °C、5% CO2湿化培养箱中过夜培养。
    10. 次日将Prigrow III培养基更换为hESC培养基。配制500 mL hESC培养基：加入DMEM/F-12、20%（v/v）无血清替代物（KOSR）、5 ng/mL bFGF、1 mM L-谷氨酰胺、100 µM非必需氨基酸和100 µM 2-巯基乙醇。此后每天轻柔更换培养基。
    11. 定期观察培养皿，注意出现提示重编程细胞的细胞团或克隆。转化后的细胞形成具有铺路石样形态、大细胞核和明显核仁的克隆性聚集体。标记可能的“iPSC”克隆，并定期检查其生长情况。
    12. 转导后约四周，当克隆已适合挑取或转移时，按此前方法接种1.3 × 106个细胞/明胶预包被皿，制备用于单克隆转移的24孔MEF培养板。
      1. 根据分析证书上的稀释因子分装基质膜（例如，Matrigel）。取一份加入25 mL DMEM/F-12中，用于包被四个6孔板（每孔1 mL），室温（RT）孵育至少1小时后使用。使用无菌移液枪头手动挑取12-24个克隆，吸出后转移至含500 µL hESC培养基的MEF培养板中。
      2. 吸除孔中培养基，轻柔破坏或打散克隆。同时在基质膜包被的24孔板上挑取24-48个克隆。对于膜包被的培养板，使用mTeSR1培养基（添加10 µM ROCK抑制剂）培养24小时，并每日更换。挑取克隆后6-10天内，克隆即可转移至新的24孔和/或12孔 膜包被培养板进行克隆扩增。
    13. 如有需要，使用1 mg/mL胶原酶处理20分钟解离MEF上的克隆，用hESC/mTeSR1培养基洗涤两次，转移至 膜包被的12孔或24孔板中。若步骤1.1.12中已有足够数量且状态良好的克隆在基质膜上生长，可按照制造商说明使用iPSC冻存培养基将MEF上的克隆冻存。
    14. 使用500 µL分散酶处理20分钟，解离步骤1.1.12中接种于膜上的健康克隆，并再次接种至基质膜包被的12孔板中。手动刮除任何已分化的细胞或污染的MEF饲养层细胞，以富集膜上的多能性克隆。 
    15. 6-8天后，通过分散酶溶液解离，在 膜包被的培养板上扩增克隆，并将小细胞聚集体接种至新鲜的 膜包被的6孔或12孔板中。每日更换mTeSR1培养基。通过碱性磷酸酶染色、多能性标志物（OCT3/4和NANOG）免疫染色、多能性表面标志物的FACS分析以及分化实验对重编程克隆进行表征。除非特别注明使用其他包被溶液，所有实验（包括CRISPR编辑）均应在膜包被的培养板上进行培养和扩增。
  2. 人iPSC的表征
    1. 碱性磷酸酶染色
      注：此处使用商业试剂盒。参见材料表。
      1. 将疑似人iPSC接种于24孔板中，每日更换培养基，培养4-5天。
      2. 开始染色程序时，吸除培养基，用1 mL含0.05% Tween 20的1× PBS（PBST）洗涤细胞一次。
      3. 向细胞中加入0.5 mL试剂盒中的固定液，室温孵育2至5分钟。吸除固定液后，用PBST洗涤固定后的细胞。注意不要让孔干燥。
      4. 通过混合溶液A、B和C，新鲜配制碱性磷酸酶底物溶液，每孔加入0.5 mL。将细胞置于避光环境（用铝箔包裹或放入暗盒）中室温孵育5至15分钟。
        注：密切观察颜色变化，当颜色变得明亮时即终止反应，以避免非特异性染色。
      5. 吸除碱性磷酸酶底物溶液，用2 mL 1× PBS洗涤孔两次以终止反应。
      6. 在显微镜下观察克隆，并使用带相机的明场显微镜以4倍或10倍放大倍数拍摄图像。
    2. 免疫染色
      1. 将人iPSC接种于24孔板中，每日更换培养基，培养4-5天。
      2. 用PBS短暂洗涤细胞一次，随后用PBS中的4%多聚甲醛（PFA）固定20分钟。
      3. 室温下用PBS洗涤三次，每次10分钟（3×10分钟）。
      4. 用含10%正常山羊或驴血清（NS，根据二抗来源动物选择）的PBS在室温下封闭非特异性位点40分钟。若仅检测胞内表位，则在PBS中加入0.3% TX-100（TX/PBS）以实现通透。
      5. 室温下用PBS洗涤三次，每次5分钟（3×5分钟）。
      6. 将OCT4、NANOG、TUJ1、NKX2-5和SOX17抗体用新鲜配制的含5% NS的PBS稀释，在室温下孵育2小时或4 °C过夜。
      7. 室温下用PBS洗涤三次，每次5分钟。
      8. 将适当的Alexa Fluor 488或568二抗用含5% NS的PBS稀释，室温孵育1小时。
      9. 室温下用PBS洗涤三次，每次5分钟。
      10. 用含DAPI的PBS孵育10分钟，室温下洗涤两次，每次5分钟。使用荧光显微镜拍照。
    3. 荧光激活细胞分选（FACS）
      1. 将人iPSC接种于6孔板中，每日更换mTeSR1培养基，培养至克隆汇合度达80%（每样本至少105个细胞）。
      2. 实验当天，按上述方案分离细胞并解离为单细胞悬液。用含10% FBS的培养基洗涤。
      3. 对于表面标志物检测，将细胞重悬于0.5-1 mL含10% FBS的培养基中，置于冰上。
      4. 对于胞内标志物检测，将细胞重悬于1 mL含4% PFA的PBS中，室温孵育10分钟。用含10% FBS的培养基洗涤。再重悬于含0.1% TX的PBS中，冰上孵育15分钟。再次用含10% FBS的培养基洗涤。最后重悬于0.5-1 mL含10% FBS的培养基中，置于冰上。
      5. 取50 µL细胞悬液加入含推荐量TRA-1-60、TRA-1-81或SSEA-4抗体的50 µL含10% FBS的培养基中，孵育30分钟至1小时。
      6. 用含10% FBS的培养基洗涤两次。
      7. 重悬于含荧光标记二抗的100 µL含10% FBS的培养基中，孵育30分钟。再次用含10% FBS的培养基洗涤两次，重悬于适当体积的含10% FBS的培养基中。可通过加入<1 µg/mL的碘化丙啶染料区分活细胞与死细胞，以评估过程中细胞凋亡情况。<
    4. 三胚层分化
      1. 在含10 µM ROCK抑制剂的mTeSR1培养基中，向两个6孔板中每孔接种1.5-2 × 106个iPSC。
      2. 每日更换mTeSR1培养基，培养2-3天，直至孔内细胞汇合度达80-90%。
      3. 对于外胚层诱导，在6孔板的2-3个孔中加入神经诱导培养基（NIM），具体操作按制造商说明进行。
      4. 对于中胚层诱导，在板中2-3个孔中将培养基更换为含2% B27补充剂（不含胰岛素）和12 µM CHIR99021的RPMI培养基14。接下来24小时仅使用含2% B27补充剂（不含胰岛素）的RPMI培养基。再接下来24小时，在含2% B27补充剂（不含胰岛素）的RPMI培养基中加入5 µM IWP4。72小时后，更换为含2% B27补充剂的RPMI培养基，2-3天内可观察到跳动的心肌细胞。
      5. 对于内胚层诱导，将6孔板中部分孔的培养基更换为MCDB 131培养基，并补充1.5 g/L碳酸氢钠、1× Glutamax、10 mM葡萄糖、0.5% BSA、100 ng/mL GDF8和5 µM CHIR99021，培养24小时。随后在不含CHIR99021的相同培养基中继续培养2-3天15。
      6. 对所有三个胚层均按照步骤2的免疫染色方案进行操作，并检测相关标志物的表达。

2. 利用 CRISPR-Cas9 对人类iPSC进行基因组编辑

  1. Cas9蛋白与sgRNA的制备
    1. 在无菌条件下将Cas9蛋白分装至微量离心管中，并将分装样品于-80 °C冷冻保存。
    2. 根据麻省理工学院提供的软件（http://www.genome-engineering.org/crispr/）或其他CRISPR向导RNA设计工具，为每个基因设计两条靶向引导RNA。为实现基因敲除，应靶向基因的第一或第二外显子（基于开放阅读框）。选择两条切割位点相近（相距约30–100 bp）的向导RNA，以便使用同一对筛选引物清晰观察到缺失片段。从软件输出结果中选择质量评分较高且脱靶位点较少的向导RNA。使用Primer-Blast程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计筛选引物。筛选引物应距离Cas9切割位点至少100 bp，PCR产物大小最好在400–700 bp之间，以利于PCR扩增。
    3. 设计两条互补的sgRNA寡核苷酸DNA（长度为19–22个核苷酸，取决于向导序列），并在每条末端包含BsaI酶切位点。这些寡核苷酸DNA可由商业公司合成并退火形成双链DNA。退火反应体系为：各取1 µL 100 µM的向导RNA，加入25 µL退火缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5–8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）和23 µL水。将反应体系置于PCR仪中，程序设置为95 °C孵育2分钟，随后在45分钟内逐步降温至25 °C。
    4. 将2 µL退火产物克隆至经BsaI限制性内切酶消化的1 µL实验室自备T7启动子pCR2.1载体（含Cas9结合位点）中，使用T4 DNA连接酶，操作按照制造商说明书进行。
    5. 对克隆的DNA片段进行测序，确认序列正确后，使用T7体外转录试剂盒对阳性克隆进行in vitro转录，生成单导向RNA。使用商业化试剂盒纯化sgRNA，并用无RNase水洗脱。检测RNA浓度。
  2. hiPSCs的转染
    1. 按照前述方法，将hiPSCs在mTeSR1培养基中培养至细胞融合度为40–50%。
    2. 在核转染前2小时，更换培养基为含有10 µM ROCK抑制剂的2 mL预温mTeSR1培养基。
    3. 一小时后，准备核转染细胞的目的孔：从12孔板中吸出上述制备的 膜上培养基，更换为含10 µM ROCK抑制剂的1 mL预温mTeSR1培养基，置于37 °C孵育。
    4. 按样本数量适当放大比例，为每个样本配制核转染主混合液：每22 µL反应体系中加入16.4 µL P3原代细胞添加剂、3.6 µL核转染试剂盒中的补充剂1、0.5 µg Cas9蛋白以及每种sgRNA各0.5 µg。同时，按照制造商推荐条件将pMAX GFP质粒共转染入细胞，以粗略评估iPSC转染效率。
    5. 吸除含ROCK抑制剂的培养基后，用2 mL室温PBS洗涤每个孔。随后吸除PBS，每孔加入1 mL细胞解离液，于37 °C孵育10分钟。
    6. 用3 mL mTeSR1培养基重悬细胞，轻柔吹打数次以获得单细胞悬液。将解离后的细胞转移至含5 mL mTeSR1培养基的15 mL离心管中。
    7. 使用细胞计数仪计数细胞，并计算每转染样本所需总体积，以达到0.5 × 106 个细胞/转染。将所需数量的细胞置于15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，吸除上清液。
    8. 将每份0.5 × 106个细胞重悬于22 µL步骤4中配制的转染主混合液中。迅速将细胞转移至核转染杯条带的一个孔中央腔室中，将条带插入核转染仪，使用CB150程序进行核转染。
    9. 核转染后，立即向每个核转染孔中加入80 µL含10 µM ROCK抑制剂的预温mTeSR1培养基，轻柔吹打混匀。
    10. 将细胞从核转染条带中轻柔转移至步骤3中准备的、已预涂膜并含有含ROCK抑制剂mTeSR1培养基的12孔板孔中 。
    11. 转染后第1天，更换为新鲜mTeSR1培养基（不含ROCK抑制剂）。在核转染后2–3天收集细胞，用于单细胞分选。
  3. 靶向hiPSCs的单细胞分离
    1. 分选前一天，通过在明胶包被的培养板中接种2 × 106个细胞/板（使用含10% FBS的培养基）制备96孔MEF饲养层板。核转染后约有70–80%的克隆能够存活，每个基因编辑实验可准备2–3块MEF板。
    2. 过夜孵育后，更换培养基为hESC培养基（如前所述），并补充100 ng/mL bFGF、1× SMC4（添加至培养基中以增强单细胞存活率）和5 mg/mL纤连蛋白，以促进细胞贴壁。
    3. 将12孔板中hiPSCs的培养基由mTeSR1更换为添加1× SMC4的mTeSR1培养基，至少孵育2小时后再进行单细胞分选。
    4. 吸除hiPSCs培养基，用PBS轻柔洗涤细胞。吸除PBS后，每孔加入500 µL细胞解离液，于37 °C孵育10分钟。每孔加入1 mL未添加成分的mTeSR1培养基，轻柔吹打数次，形成单细胞悬液。
    5. 将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，用1 mL mTeSR1培养基重悬细胞。
    6. 在无菌条件下使用配备100 µm喷嘴的流式细胞分选仪，将细胞以每孔一个细胞的方式分选至步骤1中准备的96孔板各孔中。
    7. 分选后第4天应可见克隆形成；此时将培养基更换为添加1× SMC4的hESC培养基。
    8. 分选后第8天，更换为hESC培养基，继续培养2天。
    9. 使用1 mg/mL胶原酶消化20分钟以解离克隆，并将其转移至含ROCK抑制剂的mTeSR1培养基中的24孔膜包被板中。让单细胞克隆生长扩增后，提取其基因组DNA。使用基因特异性引物通过PCR扩增目标DNA片段。
    10. 使用片段分析试剂盒，按照制造商说明将所有克隆的PCR扩增产物在凝胶/染料混合物中电泳，进行目标基因组区域的初步筛选。在PROSize软件中将所得片段大小与同步运行的DNA标准品比较，估算片段长度。对预期“已编辑”克隆进行测序，并分析测序数据以确认编辑或缺失事件。
    11. 为区分单等位基因和双等位基因编辑克隆，对编辑序列进行PCR扩增后克隆至pJET1.2载体中。送测至少8–10个克隆，通过序列分析确认编辑发生在单个或两个等位基因上。
    12. 在通过基因分型鉴定出成功靶向的iPSC克隆后，需进一步检测以确认这些克隆未丧失多能性，也未在此过程中获得染色体异常。

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结果

本文中，我们采用了一种简单而高效的方案，利用可整合或无整合足迹的仙台病毒载体，将人胰腺细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。图1A展示了该重编程方案的示意图。人胰腺细胞为商业购买，使用Prigrow III培养基进行培养，并按前述方法用仙台病毒进行转导。在第0天转导仙台病毒后，转导后的梭形胰腺细胞在约5天内未见任何形态学变化，随后逐渐变圆，细胞核和核仁增大。转导后约一周可见少量早期克隆，但未进行挑取，因为根据我们的经验，这些克隆容易迅速解离，通常属于“早期部分重编程细胞”，无法形成稳定的克隆。转导后约10至15天，出现小而明亮的克隆，并在生长后进行挑取（图1B，右上）。人iPSC克隆结构紧凑、细胞排列紧密、边缘清晰（被认为是“完全重编程细胞”）（图1B，第23天，中下）；而“部分重编程细胞”则结构松散，克隆内存在间隙（

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讨论

将人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）极大地推动了基础生物学研究、个性化医学、疾病建模、药物开发和再生医学等领域的发展16。目前许多广泛应用的人类iPSC生成方法依赖于病毒载体，存在整合到宿主基因组的风险，或使用附加体型载体，但重编程效率较低。本文介绍一种利用仙台病毒从人类胰腺细胞高效生成无饲养层iPSC的方法，可实现无“足迹”且高效的重编程。所获得的人类iPSC不含病毒转基因，维持多能性，并避免使用未知的外源因子。在无饲养层条件下生成iPSC时重编程效率较低，因此我们先在饲养细胞上对原代胰腺细胞进行重编程，随后将形成的克隆转移至无饲养层 膜上进行扩增、培养和鉴定。该技术的结合实现了稳定、可靠且更高效的iPSC重编程。

我们还利用该方法从人成纤维细胞及其他原代细胞生成了诱导多能干细胞（iPSCs），这表明仙台病毒可用于重编程多种类型的细胞。重要注意事项包括：待重编程的原代细胞需达到最佳汇合度， 细胞数量过少或过多均会影响重编程效率；应使用处于最佳增殖状态的早期传代原代细胞；谨慎滴定病毒载体，以实现最低程度...

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披露

BT 是 RenOVAte Biosciences 公司的创始成员。

致谢

实验室工作得到了安贾莉·南达尔博士的博士后奖学金资助，以及马里兰干细胞研究基金向 BT（TEDCO）提供的探索性研究资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仙台病毒载体 - CytoTune-iPS 2.0 试剂盒InvitrogenA16517冰上解冻；货号：1
胰蛋白酶 EDTAGibco Life Tech25300-0540.05%，100 ml；货号：2
ROCK 抑制剂 (Y-27632)MiliporeSCM075使用 10 μM；货号：3
DMEM/F-12 培养基Invitrogen11330-032货号：4
血清替代物 (KSR)Gibco10828028货号：5
DMEMInvitrogen119600691X；货号：6
胎牛血清Thermo ScientificSH30071.03分装；货号：7
L-谷氨酰胺 (Glutamax, 100X)，液体Thermo Scientific350500611/100；货号：8
非必需氨基酸Gibco11140-0501/100；货号：9
2-巯基乙醇Gibco2198502355 mM，1/1,000；货号：10
Hausser 血细胞计数板Hausser Scientific02-671-54货号：11
0.1% 明胶溶液STEMCELL Technologies790337ºC 孵育 1 小时；货号：12
SSEA-4 抗体Santacruzsc-217041/100；货号：13
TRA-1-81 抗体Cell Signaling4745S1/200；货号：14
OCT4 抗体Santa Cruzsc-52791/1,000；货号：15
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源Life TechnologiesA10483-01保持低温；货号：16
Alexa Fluor 荧光染料 488/568（二抗）InvitrogenA21202/A100421/2,000；货号：17
DPBSHycloneSH30028LS1X；货号：18
100 mm 组织培养皿Falcon353003货号：20
96 孔组织培养板Falcon353078货号：21
6 孔组织培养板Falcon353046货号：22
解剖显微镜 NikonSMZ745货号：23
挑取操作罩NuAireNU-301货号：24
15 ml 离心管Greiner Bio-One188271货号：25
50 ml 离心管Greiner Bio-One227261货号：26
丙酮酸钠Invitrogen11360货号：28
β-巯基乙醇SigmaM7522货号：29
Prigrow III 培养基ABMTM003货号：31
Countess™ 细胞计数仪InvitrogenC10227货号：32
Faxitron X 射线系统FaxitronCellRad货号：33
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104货号：34
胶原酶Life Technologies171040191 mg/ml 储存液；货号：35
分散酶STEMCELL Technologies7923货号：36
适用于人胚胎干细胞的基质胶 (matrigel)BD Biosciences354277稀释时使用冷的 DMEM/F-12；货号：37
bFGFR & D233-FB储存液 10 ug/ml；货号：38
多聚甲醛EMS157104% 储存液（PBS 配制）；货号：39
TRA-1-60Santa Cruzsc-217051/100；货号：40
NANOGReproCELLRCAB0004P-F1/100；货号：41
吐温 20SigmaP9416-100ML货号：42
碱性磷酸酶检测试剂盒Stemgent00-0055货号：43
Cas9 蛋白PNA BioCP01-50解冻后分装；货号：44
山羊或驴血清SigmaD9663/G9023货号：45
Triton X-100SigmaX100-100ML货号：46
DAPIThermo ScientificD1306货号：47
TrisSigma9285-100ML货号：48
NaClSigmaS7653-250G货号：49
EDTASigmaBP2482-500货号：50
T4 DNA 连接酶NEBM0202T货号：51
Mega Shortscript T7 试剂盒Thermo ScientificAM1354货号：52
Mega Clear 试剂盒Thermo ScientificAM1908货号：53
SMC4BD Biosciences354357货号：54
纤连蛋白STEMCELL Technologies7159货号：55
CloneJET 克隆试剂盒Thermo ScientificK1232货号：56
Fragment analyzerTMAdvanced Analytical货号：57
mTeSR1 培养基试剂盒STEMCELL Technologies5850恢复至室温；货号：58
冻存培养基 mFreSR™STEMCELL Technologies5855货号：59
冻存培养基 CryoStor®STEMCELL Technologies7930货号：60
MEFsGlobalstemGSC-6301G货号：61
L-谷氨酰胺Invitrogen25030081货号：62
人胰腺细胞ABMT0159货号：63
STEMdiff™ 神经诱导培养基Stemcell Technologies5835货号：64
RPMIThermofisher11875-093货号：65
2% B27-胰岛素ThermofisherA1895601货号：66
CHIR99021Stemcell Technologies72052货号：67
IWP4Stemcell Technologies72552货号：68
2% B27Thermofisher17504044货号：69
MCDB 131Life Technologies10372019货号：70
碳酸氢钠Sigma-AldrichS8761-100ML货号：71
葡萄糖Sigma-AldrichG8270-100G货号：72
BSAProliant68700货号：73
GDF8Pepro-Tech120-00货号：74
TUJ1 抗体EMD MiliporeAB9354货号：75
NKX2-5 抗体Santa CruzSc-14033货号：76
SOX17 抗体R & D systemsAF1924货号：77
碘化丙啶Thermo ScientificP3566货号：78
Amaxa 4D-核转染仪™LonzaAAF-1002货号：79
FACSAria II（细胞分选仪）BD biosciencesSORP UV货号：80

参考文献

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利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs
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