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激光微照射技术在哺乳动物细胞单链与双链断裂修复研究中的应用

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DOI：

10.3791/56265

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2017年9月5日

 ,  , 
1Department of Oncologic Sciences, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

本文内容

摘要

共聚焦荧光显微镜与激光显微照射技术可用于在细胞核内特定区域诱导DNA损伤，并监测DNA修复蛋白的响应。该技术极大地推动了我们对损伤识别、信号传导及蛋白募集过程的理解。本文展示了如何利用这些技术研究单链和双链断裂的修复过程。

摘要

细胞内存在高度协调的DNA修复通路，可识别、切除并替换受损的DNA碱基，同时协调DNA链断裂的修复。尽管分子生物学技术已阐明了修复蛋白的结构、酶学功能及动力学特征，但人们对修复过程在细胞核内的协调机制仍需深入理解。激光显微照射技术为诱导DNA损伤并监测修复蛋白的招募提供了强有力的工具。利用激光显微照射可在不同波长下诱导DNA损伤，使用者可稳定地通过不同剂量诱导单链断裂、碱基损伤以及双链断裂。本文中，采用激光显微照射技术研究由两种常用共聚焦激光波长（355 nm和405 nm）诱导产生的单链和双链断裂的修复过程。此外，还详细描述了针对特定损伤组合所施加激光剂量的准确表征方法，以便使用者能够可重复地进行激光显微照射实验的数据采集与分析。

引言

荧光显微镜已成为一种强大的技术，可用于观察细胞结构、分析蛋白质定位以及监测蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用。利用荧光显微镜研究在施加全局性DNA损伤剂（如紫外线（UV）照射、电离辐射、化学氧化剂或烷基化试剂和/或化疗药物）后所引发的DNA损伤应答，已为DNA修复蛋白在损伤位点的启动、信号传导及募集过程提供了新的见解1,2。然而，当需要详细了解关键DNA修复蛋白的募集顺序、结合或解离动力学及其相互关系时，这类全局性且不同步的损伤事件具有局限性。幸运的是，在过去25年中，激光扫描共聚焦显微镜技术的进步、可用于诱导损伤的激光波长范围的扩大以及荧光蛋白性能的提升，使研究人员能够通过靶向诱导DNA损伤，获得更优的工具来深入探究DNA修复的这些方面。

利用激光微束照射细胞以研究细胞及亚细胞功能，是细胞生物学和辐射生物学中一种成熟的研究工具3。当Cremer及其同事使用高度聚焦的紫外光（257 nm）激光微束系统，在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中于0.5 µm范围内诱导DNA损伤，并证实该系统可产生DNA光损伤时，这一技术开始被应用于DNA修复研究4，并确立了该系统诱导DNA光损伤的能力5。尽管相较于当时的紫外微束方法具有显著改进，但由于该损伤系统的装置高度专业化，且无法产生DNA双链断裂（DSBs），其应用受到限制6。随后多个研究团队对不同UV-B（290 - 320 nm）和UV-A（320 - 400 nm）波长进行了研究，发现根据所用激光波长和功率的不同，可诱导产生紫外线光产物、氧化碱基损伤、单链断裂（SSBs）以及双链断裂（DSBs）4,7,8,9,10（综述见3）。此外，将这些UV-B和UV-A波长与光敏剂（如补骨脂素、溴脱氧尿苷（BrdU）和Hoechst染料）联合使用，也被发现能够根据波长、功率和照射时间诱导DNA损伤，且在这些光敏剂存在的情况下，诱导损伤所需的激光功率通常更低11,12,13,14,15。这些进展拓展了微辐照技术的应用范围，但这些方法在更广泛推广时仍面临一些技术难题需要解决。

Cremer 及其同事通过精确聚焦紫外微束，将高强度损伤能量作用于细胞内高度局限的区域，从而显著推动了微辐照领域的发展。随着共聚焦显微镜和激光显微切割系统的进步，高度聚焦的光束变得更加普及；然而，将紫外光源与显微镜耦合以及处理由此引起的色差问题，对大多数用户而言仍构成重大挑战3,6,16。20世纪90年代以来，随着紫外染料日益普及，能够聚焦并采集紫外激发荧光的光学系统也变得更加广泛可用16，激光扫描技术的进步使用户能够在细胞内形成高度聚焦的紫外激发点6,17。然而，直到21世纪初，高度聚焦光束与高功率激光相结合的真正影响才得以显现：大量研究报道证实，在无需或使用增敏剂的情况下，均可在UV-A波段6,10,18,19,20、405 nm21,22,23,24,25,26，甚至在488 nm等更长的可见光波长下诱导DNA链断裂27。这些进展使得微辐照技术得以在多种商用系统上更广泛地应用。与此同时，双光子技术也逐步发展，实现了DNA损伤的精确定位诱导；尽管本文不讨论这些进展，但已有大量综述文章对这些方法进行了详细评述9,28,29,30。

随着共聚焦显微镜的普及，这些设备能够提供高度聚焦的紫外光，同时荧光蛋白也广泛可用，使得实时追踪DNA修复蛋白成为可能，微辐照技术因此发展成为研究DNA损伤应答及修复通路的有力工具。然而，使用者必须意识到，DNA损伤的产生在很大程度上依赖于激光波长以及照射核内区域时所使用的功率。使用紫外C波段（~260 nm）可直接激发DNA，并高度特异性地诱导紫外光产物7,8。紫外B和紫外A波段则会产生多种类型的DNA损伤（碱基损伤、单链断裂和双链断裂），其损伤类型取决于所施加的功率以及所使用的细胞背景7。靶向细胞内源性光敏剂和抗氧化剂水平会影响这些波长所产生的DNA损伤组合。此外，使用外源性光敏剂（如BrdU等）可能有助于降低诱导DNA损伤所需的能量。然而，这些试剂本身可能诱导DNA损伤，并可能改变细胞周期和染色质结构，因此其使用可能带来需要使用者充分考虑的非预期效应。因此，在采用微辐照技术研究DNA损伤应答与修复之前，必须仔细评估所关注的DNA修复通路、可用的激光波长以及所产生的DNA损伤类型组合。

本文采用两种常用波长（355 nm 和 405 nm）进行激光显微照射，无需致敏剂，以展示这些波长诱导的DNA损伤混合类型，以及此类损伤混合物对单链断裂（SSB）和双链断裂（DSB）修复研究的影响。使用者应意识到，这些波长并不会仅产生单一类型的链断裂或碱基损伤。为了区分不同的DNA修复通路，使用者必须精确控制照射核内特定区域的激光功率，并利用多种链断裂标志物和DNA损伤特异性抗体对所诱导的损伤进行表征。若能正确实施并充分表征，激光显微照射可在一定程度上富集某些类型的DNA损伤，从而使使用者能够相对特异性地评估碱基损伤、单链断裂或双链断裂的修复情况。因此，本文提供了一种方法，使使用者能够可重复地执行激光显微照射，表征所施加激光剂量诱导的DNA损伤混合物，并完成数据分析。

方案

1. 细胞培养与稳定细胞系的建立

  1. 在添加了10%胎牛血清的最低必需培养基中培养CHO-K1细胞。将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中维持培养。
  2. 使用商用转染试剂，按照生产商说明书，将含有C端绿色荧光蛋白（GFP）标签的人源XRCC1的1 µg质粒DNA转染至CHO-K1细胞中。
  3. 利用800 µg/mL遗传霉素筛选稳定表达人源XRCC1-GFP融合蛋白的CHO-K1细胞，并通过荧光激活细胞分选（FACS）富集XRCC1-GFP表达细胞群体。
  4. 将待进行显微照射的细胞接种于底部为盖玻片的培养容器中，使其在次日达到约75%或更高的汇合度。细胞间应保留一定间隙，特别是在使用定位回归至同一成像视野时（见第3.2节）。

2. 显微镜设置

  1. 选择配备合适激光器、光学元件及微照射/光刺激控制软件的激光扫描共聚焦显微镜。本实验所采用的系统为经过改装的激光扫描共聚焦显微镜，其中集成了355 nm激光器，并通过光纤耦合至由制造商控制与分析软件调控的检流计光激活微型扫描器。该系统可利用光激活微型扫描器（355 nm激光）或标准共聚焦检流计（405 nm激光）在用户指定的兴趣区域（ROI）内执行微照射。
  2. 选择用于微照射的波长，并确保微照射光路中的所有光学元件均适用于所选波长。
    注：本系统在进行355 nm微照射时，使用40× C-Apochromat（数值孔径（NA）1.2）油浸物镜配合355 nm紫外滤光立方体；而在405 nm微照射时，则使用20× C-Apochromat（NA 0.75）干式物镜并通过标准共聚焦光路。由于该系统中所用20×物镜不兼容355 nm波长，因此仅使用40×物镜进行355 nm照射。使用干式物镜进行损伤操作可避免浸油残留，从而在后续直接应用免疫荧光实验流程而无需清洗浸油，因此在可行情况下优先采用此物镜。
  3. 为微照射实验配置显微镜。为确保实验间的一致性，应为每种类型的微照射设定标准化的显微镜组件配置。如有可能，将这些设置保存为显微镜操作软件中的预设模式。
    注：在本系统中，细胞的微照射与成像采用单向扫描模式，扫描分辨率为1024×1024像素，扫描缩放倍数为1×，帧速率为每秒8帧（fps），针孔大小设定为约4艾里单位（AU），该值依据488 nm激光（69 µm）确定。此较宽的针孔设置旨在最大化每幅图像中采集的光信号量，从而允许使用较低的成像激光功率并减少光漂白。

3. 激光显微照射

  1. 将含有目标细胞的已制备培养皿放置于显微镜载物台上，并牢固固定。
    1. 如有条件，将带腔室载玻片置于载物台培养箱中，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 在损伤诱导过程中。此步骤对于活细胞延时成像或长时间成像尤为重要。否则，将细胞置于显微镜载物台上，在室温（约 25 ˚C）下进行辐照，然后迅速将细胞放回 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中2.
  2. 注册图像区域，以便研究人员在完成固定、染色或其他操作后能够返回到相同位置。使用带有刻蚀或标记的XY坐标网格的编码自动化显微镜载物台或细胞培养盖玻片容器，对受损区域进行图像定位注册。
    1. 若使用软件进行图像配准，应选择培养容器中易于识别的特征（例如盖玻片的角落或孔间屏障），采集图像并记录该特征的XY位置。这将有助于在样本制备后对所选视野的XY位置进行对齐与配准。
    2. 若采用手动校准，需手动记录每个视野的网格或刻蚀位置，并仔细记录培养皿在载物台上的方向和放置位置。
    3. 若细胞培养容器无可用的标识特征，可通过观察细胞形态和密度，以目视方式识别受损区域。应谨慎选择具有足够明显特征的视野，以便在后续成像过程中能够辨认。
      注意：除非严格限制培养容器的方向和面积，否则此操作可能耗时较长。
  3. 选择用于微辐照的视野并聚焦样品。对于表达荧光标记蛋白的细胞，应在目标荧光通道中选择细胞核横截面最大的焦平面。对于不表达标记蛋白或核定位不清晰的细胞，可使用相差显微成像或微分干涉差（DIC）成像来确定正确的焦平面。
    ​注意：相差和微分干涉差（DIC）成像的一个有用特性是，当焦平面在样品中移动时，同一结构可能因焦平面的相对位置不同而呈现亮或暗的外观。
    1. 选择细胞核内一个清晰的结构，例如核仁，上下移动焦平面并观察其外观变化。真实的焦平面位于由亮变暗的过渡范围内。为样本对焦时，应选择所选结构对比度最清晰的焦平面。
  4. 记录目标区域的位置。在显微镜软件中创建一个3x3像素的方形感兴趣区域（ROI），将该ROI置于待损伤细胞的细胞核上方，并将其设置为损伤ROI。
  5. 采集损伤前的图像，包括损伤区域（ROI）的位置。
    1. 对于不使用荧光蛋白的实验，应获取相差或微分干涉差（DIC）明场图像，以识别并记录细胞核的损伤情况。
    2. 对于使用荧光蛋白的活细胞实验，需采集包含明场和目标蛋白荧光通道的图像（例如，488 nm 激光线用于激发 GFP，561 nm 激光线用于激发 RFP）。在使用 CHO-K1 XRCC1-GFP 的实验中，通过 488 nm 激光线激发的荧光与透射 DIC 明场通道同时采集。
  6. 启动激光损伤。
    1. 在本系统中，通过控制激光扫描损伤ROI的总时间来调节激光剂量。由于355 nm激光的振镜以固定扫描速率运行，因此通过重复扫描选定损伤ROI的时间来控制激光剂量：在本研究呈现的数据中，355 nm的微辐照持续时间为2秒和10秒。
    2. 相比之下，通过调节扫描速率来控制405 nm激光剂量，并对选定的损伤ROI进行一次扫描。在本研究展示的数据中，使用8 fps和0.5 fps进行405 nm的微辐照。8 fps的扫描速率比0.5 fps提供的激光剂量更低，因为激光在每个像素上的照射时间更短。两种激光均以100%功率运行。有关直接测量激光功率的说明，请参见第3.7节。
      注意：每种显微镜系统在将激光功率传递至指定 ROI 的方式上可能存在差异，正如本系统中 355 nm 与 405 nm 激光之间的差异所示。用户需针对其显微镜系统确定相应操作流程，并在方法部分中报告这些参数。
    3. 进行活细胞成像时，对明场和荧光通道进行时间序列图像采集。根据实验需求调整时间序列的持续时间和采集频率，以优化数据收集，理想情况下应能够捕捉到荧光蛋白在损伤区域（ROI）的累积及其在实验时间进程中的解离过程。使用 XRCC1-GFP 的实验每 30 秒采集一次图像，持续 20 分钟。
      ​注意：延时成像的频率可能受到荧光团光漂白的限制，从而影响对积累和解离过程的分析。可通过在延时成像过程中观察未受损细胞，并调整图像采集条件以尽量减少这些未受损细胞中荧光信号的丢失，来评估光漂白程度。部分光漂白可能难以避免，因此用户可通过将每帧图像中受损细胞的荧光强度归一化到同一帧中未受损细胞的荧光强度，以补偿信号衰减。
      1. 时间过程结束后，按第4节所述，选择新的细胞区域进行损伤处理，或固定已损伤的细胞以进行后续分析。
      2. 继续进行微辐照和延时成像，直至达到所需数量的损伤细胞。
        ​注意：我们建议在每个选定条件下损伤10–25个细胞，以评估细胞间对诱导损伤反应的异质性。尽管大多数共聚焦系统允许用户在每次微辐照过程中损伤多个细胞，但这会导致损伤起始时间错开，从而可能使大量细胞的蛋白募集峰值时间或快速事件的解离时间分析变得复杂。在某些系统中，多个感兴趣区域（ROI）同时诱导损伤可能会降低每个独立ROI接收到的激光剂量。因此，除非用户已明确解决这些时间或功率相关问题，否则建议逐个损伤细胞。
    4. 用于免疫荧光（IF）分析时，进行损伤处理后，立即按照第4节所述方法固定细胞，或让细胞在选定的时间间隔（如1、5、10或20分钟）内进行修复。在所需时间结束后，按照第4节详细步骤对细胞进行固定和染色。
      1. 为增加用于免疫荧光分析的细胞总数，可在培养容器内对多个视野区域进行损伤处理，以获得损伤后反应的多视野时间序列。记录每个视野的XY位置及损伤发生的时间。在达到预期的总修复时间后，按照下文所述方法对细胞进行固定和染色。
  7. 在观察选定剂量下蛋白质募集情况后，测量并记录光纤输出端和物镜后的激光功率，以准确表征和报告激光剂量。我们使用一台紧凑型数字功率计和两个不同的光电二极管传感器探头；其中一个直接连接至激光光纤，用于测量光纤输出端的功率，另一个放置在显微镜载物台上，用于测量物镜后的输出功率。
    1. 为测量激光功率，将传感器置于目标位置（光纤后或物镜后），并按照上述方法进行显微辐照，同时记录功率计的测量值。需注意，功率计的采样速率可能不足以捕捉极快速的显微辐照事件，因此可能需要多次重复实验，以确保功率计能够准确检测所施加的剂量。
      注意：对于355 nm激光器，测量得到光纤输出端的平均峰值功率约为5 mW，物镜输出端约为19 µW。对于405 nm激光器，为克服功率计0.01秒的最大采样率限制，采用30次循环进行微辐照实验，在扫描速度分别为每秒8帧和每秒0.5帧时测得的平均峰值功率分别为1.5 mW和2.4 mW。每台功率计的性能不同，用户需根据所使用的具体功率计确定其适用的波长范围和采样率。

4. 免疫荧光染色步骤

  1. 通过免疫荧光染色分析链断裂的诱导。
    1. 用含3.7%甲醛（注意）的磷酸盐缓冲液（PBS）固定细胞10分钟。吸除甲醛溶液，用PBS洗涤3次。可在本步骤暂停实验流程，将PBS重新覆盖于细胞上，并将细胞在4 ˚C保存最多1周。
      注意：甲醛具有毒性且为致癌物。操作时应穿戴适当的个人防护装备，并按照机构环境健康与安全规程处理有毒物质。
    2. 在室温下用含0.25% Triton X-100的PBS对细胞进行透化处理10分钟，随后用PBS洗涤3次。
    3. 在含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中于室温孵育30分钟，以阻断非特异性抗体结合。
    4. 加入针对γH2AX的一抗单克隆抗体和针对53BP-1的一抗多克隆抗体，均以含1% BSA的PBS按1:750稀释，在室温孵育1小时，然后用PBS洗涤3次。
    5. 加入Alexa 488标记的山羊抗小鼠二抗和Alexa 546标记的山羊抗兔二抗，均以含1% BSA的PBS按1:2000稀释，在室温孵育1小时，然后用PBS洗涤3次。
    6. 用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，注意）染色核DNA：将10 mg/mL的DAPI溶液用PBS按1:5000稀释，孵育5分钟，或使用其他类似的核染料，随后用PBS洗涤3次。
      注意：DAPI具有毒性和致突变性。操作时应穿戴适当的个人防护装备，并按照机构环境健康与安全规程处理有毒物质。
    7. 将PBS或含0.1%叠氮化钠（注意）的PBS重新加至染色后的细胞上。可在本步骤暂停实验流程，将细胞在4 ˚C保存数天，或继续进行第5节的图像采集。
      ​注意：叠氮化钠具有毒性。操作时应穿戴适当的个人防护装备，并按照机构环境健康与安全规程处理有毒物质。
  2. 通过免疫荧光染色分析碱基损伤或DNA加合物的诱导。
    1. 在-20 °C条件下，用预冷的甲醇（注意）固定并透化细胞20分钟。
      注意：甲醇具有毒性和易燃性。操作时应穿戴适当的个人防护装备，并按照机构环境健康与安全规程处理有毒物质。
    2. 吸除甲醇，将样本在空气中干燥15分钟。可在本步骤暂停实验流程，将细胞在-20 ˚C干燥条件下保存最多3天。
    3. 用PBS重水化细胞15分钟。
    4. 在室温下用2 N HCl（注意）变性DNA 45分钟，随后用PBS洗涤3次。
      注意：HCl具有腐蚀性。操作时应穿戴适当的个人防护装备，并按照机构环境健康与安全规程处理腐蚀性物质。
    5. 用50 mM Tris-HCl（pH 8.8）中和5分钟，随后用PBS洗涤3次。
    6. 在封闭缓冲液（含5%正常山羊血清和0.1% Triton X-100的PBS）中于室温孵育1小时。
    7. 加入针对8-氧代-2'-脱氧鸟苷（8-oxodG，1:400）或环丁烷嘧啶二聚体（CPD，1:1,000）的一抗，溶于山羊血清封闭缓冲液中，在室温孵育1小时，然后用PBS洗涤3次。
    8. 加入Alexa 488标记的山羊抗小鼠二抗，按1:2000比例溶于山羊血清封闭缓冲液中，在室温孵育1小时，然后用PBS洗涤3次。
    9. 用PBS中按1:5000稀释的DAPI（10 mg/mL）染色核DNA5分钟，并用PBS洗涤3次。
    10. 若使用带腔室的盖玻片，将PBS或含0.1%叠氮化钠的PBS重新加至染色后的细胞上。可在本步骤暂停实验流程，将细胞在4 ˚C保存数天，或继续进行第5节的图像采集。
    11. 或者，可将细胞封片于合适的封片介质中，前提是可在培养容器上方加盖另一片盖玻片。封片完成后，样本可在4 ˚C长期保存。

5. 免疫荧光实验的图像采集

  1. 用乙醇清洁培养容器的玻底，并将其放回共聚焦显微镜载物台上。确保容器在载物台上的方向和位置与诱导损伤时记录的方向和位置一致。固定培养容器，以确保最佳的定位和成像效果。
  2. 使用所选的定位技术（见3.2节）找到先前成像的视野。
    1. 若采用带有蚀刻网格的玻片进行手动定位，先将网格调至焦点，找到识别标记，然后利用记录的XY坐标定位受损细胞。
    2. 若采用基于图像的自动定位方法，找到在3.2.1步骤中用作参考的结构特征，然后尽可能将当前活体显微镜视野与记录的图像对齐。对齐后，测量当前显微镜载物台的XY位置，并与参考图像的XY位置进行比较。两个位置之间的线性距离即为X和Y方向的偏移量。将此偏移量应用于每个记录的XY位置，以确定包含辐照细胞的成像视野。该偏移校正功能可在显微镜控制软件中自动完成，也可手动执行。
    3. 若无法识别合适的定位点，则通过扫描玻片并寻找先前确定的细胞特征，手动定位细胞。
  3. 使用适当的显微镜设置采集图像，以获取所有染色标记的目标信号，包括明场图像（参见2.3节的设置和3.3节的聚焦）。在本研究的实验中，多通道图像采集使用的激发激光线和荧光染料如下：405 nm（DAPI）、488 nm（Alexa 488 和透射DIC明场）、561 nm（Alexa 546）。所有激光均通过一个声光可调滤波器，以控制激光波长和功率的传输。

6. 荧光蛋白募集至显微照射位点的活细胞图像分析

  1. 在图像分析软件（例如 NIS Elements 或 ImageJ）中打开获取的图像。如有需要，将辐照前图像与时间序列图像合并，生成一个包含损伤诱导前后信息的单一图像序列。用户可通过测量辐照区域荧光强度相对于整个细胞核荧光强度的变化来展示蛋白招募情况（参见代表性结果 图1B）。
  2. 对每个待测细胞，首先生成代表细胞核的参考感兴趣区域（ROI）。在构成细胞核的荧光信号上应用阈值算法，然后将该区域转换为ROI。如有需要，可参考明场图像手动绘制ROI。在时间序列过程中调整ROI，以确保其准确覆盖细胞核区域，并报告每一帧中该ROI内荧光信号的平均荧光强度。
  3. 对每个待测细胞创建一个6×6像素的ROI，并将其放置在时间序列每一帧的损伤区域上。此较大的ROI即作为后续分析的损伤ROI。报告每一帧中该ROI的平均荧光强度。
    注意：大多数商业图像分析软件均包含2D目标追踪模块，同时ImageJ或FIJI也有多种用户开发的宏可加快工作流程并提高通量（参见 https://imagej.nih.gov/ij/plugins/）。
  4. 将每一帧中损伤ROI的平均荧光强度归一化至对应的参考ROI荧光强度。此处使用细胞核平均荧光强度作为参考ROI（参见代表性结果 图1）。 归一化可通过从损伤ROI的平均荧光强度中减去参考ROI的平均荧光强度实现，也可通过将损伤ROI的平均荧光强度除以参考ROI的平均荧光强度实现。
    注意：若参考荧光强度值极低时采用除法归一化，可能导致不可预测的结果。
  5. 对所有受损细胞重复上述步骤，同时至少对两个未受损的对照细胞进行相同操作。如有需要，可利用对照细胞结果进行进一步归一化。
  6. 将归一化后的荧光强度值随时间作图，以展示不同实验处理条件下蛋白招募动态的变化。

7. 通过免疫荧光检测的蛋白质招募图像分析

  1. 在图像分析软件中打开损伤前和损伤后的图像。损伤前的图像包含用于微辐照的损伤区域（ROI）。复制该ROI，并粘贴到损伤后的图像中，以识别被靶向的细胞。
  2. 生成一个6×6像素的ROI用于分析蛋白募集情况，并将其放置在损伤ROI的位置。此较大的ROI即作为后续分析中的损伤ROI。记录该损伤ROI的平均荧光强度。
  3. 将损伤ROI的平均荧光强度归一化至相应参照ROI的荧光强度。此处，以受损细胞的平均核荧光强度作为参照ROI（见代表性结果 图1）。通过DAPI信号使用阈值算法定义细胞核区域，然后将该区域转换为ROI。记录参照ROI的平均荧光强度。归一化可通过从损伤ROI的平均荧光强度中减去参照ROI的平均荧光强度实现，也可通过将损伤ROI的平均荧光强度除以参照ROI的平均荧光强度实现。
    注意：若参照荧光强度值极低时采用除法进行归一化，可能导致不可预测的结果。
  4. 对所有受损细胞重复上述步骤，并按照上述方法对至少两个对照细胞进行相同分析。
  5. 将每次微辐照事件测得的归一化荧光强度值对时间作图，以显示蛋白募集动态或DNA损伤类型随实验处理的变化情况。

结果

诱导DNA损伤的表征
碱基损伤和链断裂的诱导取决于施加于选定细胞核区域的激光剂量以及所用细胞模型的细胞微环境7。与修复蛋白（如XRCC1、53BP1、Ku70或Rad51）融合的荧光蛋白可作为有效的单链和双链断裂标记物，用于确定在损伤ROI内观察到荧光蛋白积累所需的最低能量，该信号需高于背景荧光水平9,19,31。一旦确定能够引发响应的实验条件，关键步骤是对该特定波长和剂量所诱导的损伤混合物进行表征。通过降低所用波长的剂量和持续时间，可帮助使用者尽量减少复杂损伤混合物的形成。已有研究表明，UV-A范围内的低激光剂量主要产生单链断裂（SSBs）以及少量碱基损伤，适用于研究单链断裂修复（SSBR）和碱基切除修复（BER）通路10,28。增加剂量则会导致更复杂的碱基损伤（包括氧化性和UV诱导的损伤），并显著增加双链断裂（DSBs）的数量7,10。尽管为研究特定DNA修复通路而仅诱导单一类型的DNA损伤是理想情况，但更常见的是使用者实际上诱导了多种DNA损伤的混合物，其中某一类特定损伤（如SSBs）的发生频率远高于碱基损伤或DSBs。这种情况类似于由化学试剂（如过氧化氢（H2O2）或甲基磺酸甲酯（MMS））所诱导的DNA损伤混合物32。使用者在报告结果时必须意识到可能存在损伤混合物，因此有必要对诱导损伤位点的剂量及损伤类型进行仔细表征，以确保实验结果的可重复性和可比性。

在微辐照研究中，XRCC1-GFP 常被用作碱基损伤和单链断裂（SSB）诱导的标记物9,28。XRCC1 是一种支架蛋白，在单链断裂修复（SSBR）和碱基切除修复（BER）中发挥重要作用，同时也参与其他修复通路，如核苷酸切除修复（NER）33,34,35。它在DNA修复过程中起重要的协调作用，可与多种关键蛋白相互作用，包括聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）、DNA聚合酶β（Pol β）和DNA连接酶III。我们利用稳定表达XRCC1-GFP的CHO-K1细胞，确定产生单链断裂和双链断裂（DSB）所需的激光剂量。我们首先确定了每种波长下可观察到XRCC1-GFP招募的最低剂量（图1）。对于355 nm波长，在定义的损伤ROI区域停留2秒即可在该区域内产生增强的荧光信号，表明已诱导出可检测到的DNA损伤，且信号高于背景水平（图1A）。对于405 nm波长，需要以8 fps的扫描速率才能在损伤ROI区域观察到明显的XRCC1-GFP招募（图1A）。随后，我们提高剂量（355 nm为10秒，405 nm为0.5 fps），以产生更强的损伤ROI区域（图1A）。

随后通过延时成像监测 XRCC1-GFP 在诱导损伤位点的招募与滞留情况。该蛋白在 DNA 损伤位点的滞留可能表明正在进行 DNA 修复，而蛋白从诱导损伤位点的解离通常被视为碱基切除修复（BER）或单链断裂修复（SSBR）完成的标志。然而，目前尚无明确证据将 XRCC1 从激光诱导的 DNA 损伤位点解离与修复完成直接关联。通过报告损伤 ROI 内荧光信号平均强度与整个细胞核内平均荧光信号的比值，来量化蛋白在损伤位点的招募情况（图 1B）。此类归一化方法有助于校正细胞核信号的强度波动，尽管也可根据目标蛋白的细胞分布采用其他归一化策略。此处 XRCC1 定位于细胞核区室，因此以细胞核区域进行归一化可反映信号向损伤 ROI 的重新分布。随后记录延时成像中每张图像（包括损伤前图像）的 ROI 平均荧光强度，并将其绘制成随时间变化的曲线（图 1C）。

随后，我们进一步表征了两种选定激光剂量所诱导的损伤，以检测DNA碱基损伤的形成。首先，通过免疫荧光检测环丁烷嘧啶二聚体（CPD）的形成——这是一种由紫外线诱导的大体积损伤，可作为核苷酸切除修复（NER）类型损伤的标志物（图2A）。接着，检测氧化性碱基损伤8-oxodG，作为碱基切除修复（BER）类型损伤的标志物（图2B）。在两种波长下（355 nm为2秒，405 nm为8帧/秒）的低剂量照射中，均未观察到CPD损伤的显著增加；而在高剂量处理下（355 nm为10秒，405 nm为0.5帧/秒），两种波长均在损伤ROI区域内显示出荧光信号的显著增强（图2A）。每个受损细胞CPD ROI平均强度的散点图显示，在两种波长和剂量条件下，损伤的形成与检测均存在异质性，表明低剂量下可能已存在少量CPD损伤，但直到施加更高剂量时才能被显著检测到。该散点图还提示，抗体检测效率的不足可能限制了对损伤混合物的准确定量。

这一点在通过标志物8-oxodG检测氧化诱导的DNA损伤时尤为明显。在所使用的两种激光波长或剂量下，均未观察到8-oxodG在损伤ROI内的荧光信号有明显增加（图2B）。本研究所用抗体与先前发表的研究一致9,10,36；但需注意的是，使用抗体检测8-oxodG的形成可能存在一定局限性37,38。此外，建议通过第二种标志物进一步验证氧化诱导损伤的缺失，例如检测8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）的募集情况，该酶负责从DNA中切除8-oxodG10。本研究未观察到OGG1向DNA损伤位点的募集；然而，仍不能完全排除存在低水平氧化诱导DNA损伤的可能性。

最后，我们通过免疫荧光法，利用两个标志物γH2AX和53BP1，在选定的激光剂量下检测了DNA双链断裂（DSBs）的形成情况。图3 & 4）。γH2AX 通常用作DNA链断裂的标记物，但其对DNA双链断裂（DSBs）的特异性已在多份报告中受到质疑39,40此外，这种磷酸化事件会从链断裂位点向外传播，因此由于信号的扩散，将信号精确定位于链断裂处可能受到限制。因此，将γH2AX与53BP1联合使用，可更准确地评估损伤ROI内DSB的形成情况。

γH2AX 和 53BP-1 对微辐照的响应具有波长和剂量依赖性。在 355 nm 波长下低剂量（2 秒）照射后，两种标记物在辐照后 5 分钟和 20 分钟均无响应，在辐照后 10 分钟仅出现微弱且不稳定的信号（图 3A）。而在 355 nm 波长下高剂量（10 秒）微辐照后，损伤区域（ROI）内的荧光信号在辐照后 5、10 和 20 分钟显著增强，并在 40 分钟时减弱（图 3B）。这些结果表明，需谨慎优化 355 nm 辐照剂量，以最大限度减少对修复通路的交叉激活；低剂量条件下早期时间点（< 20 分钟）双链断裂标记物 γH2AX 检测信号减弱，即为此现象的例证。

使用低剂量（8 fps）和高剂量（0.5 fps）的405 nm激光刺激进行了类似的实验（图4）。在此波长下，无论施加何种剂量，均在损伤ROI内观察到53BP-1和γH2AX荧光强度的显著积累，表明这些剂量在DNA损伤诱导后几乎立即产生单链和双链断裂的复杂混合物（图4）。此外，高剂量405 nm激光在损伤诱导后10分钟内引起全核γH2AX染色增强（图4B，底部），使得损伤ROI的检测难以准确报告，而53BP-1的积累则更局限于损伤ROI区域内。

这些结果清楚地表明，405 nm 微辐照不适用于监测单链断裂修复（SSBR）或碱基切除修复（BER），应联合使用多种DNA加合物和链断裂的标记物，以全面表征所诱导的损伤及DNA修复应答。

XRCC1-GFP 募集与滞留的剂量依赖性变化
在诱导的DNA损伤得到表征后，激光显微照射可成为研究DNA修复蛋白动态的理想平台。XRCC1-GFP 的滞留与解离动力学表现出剂量依赖性（图1），这并不意外，因为不同波长会诱导出不同类型的损伤混合物。最高照射剂量（10秒，0.5帧/秒）下，XRCC1-GFP 的募集强度高于较低剂量，并且在20分钟的观察时间内，XRCC1-GFP 在损伤部位的滞留时间更长（图1C）。这表明，355 nm 和 405 nm 波长在高剂量下产生的DNA损伤在实验过程中可能尚未完成修复，这一结果与双链断裂标志物 γH2AX 和 53BP-1 的出现及持续滞留现象一致（图3 和 图4）。

有趣的是，在较低损伤剂量（2 秒和 8 fps）下，XRCC1-GFP 会快速募集到损伤位点，并在实验时间过程中解离，恢复至辐照前水平（图 1C）。若未对损伤混合物进行完整表征，可能得出在此类损伤条件下单链断裂（SSBs）和碱基损伤已完全修复的结论。然而，γH2AX 和 53BP1 在 355 nm 波长下于 40 分钟时、在 405 nm 波长下于 5 分钟时仍存在，这可能导致不同的解释。对于 355 nm、2 秒剂量，损伤混合物可能主要为单链断裂，因此在 40 分钟时出现双链断裂（DSBs）标志物可能表明部分未修复的损伤正在转化为双链断裂，或该能量产生的双链断裂在更长时间尺度上才被修复。单链断裂修复（SSBR）与双链断裂修复之间的时间尺度差异此前已有报道28,41,42。类似地，405 nm 低剂量（8 fps）下的解离现象可能表明单链断裂水平较低，或单链断裂发生簇集并迅速转化为双链断裂，此类现象在此前的高强度损伤微辐照及其他 DNA 损伤剂研究中已有报道43,44,45。

综上所述，这些结果强调了表征诱导损伤混合物的重要性，并表明应利用多种DNA修复蛋白和标记物来解读DNA修复蛋白在诱导损伤位点的招募与滞留情况。

荧光恢复分析，XRCC1-GFP，355 nm 和 405 nm 紫外损伤后 ROI 强度示意图
图 1。激光微辐照诱导 XRCC1-GFP 的募集。
(A) 稳定表达 XRCC1-GFP 的 CHO-K1 细胞在诱导损伤前后进行辐照并成像。箭头指示微辐照区域位置，标尺为 10 µm。(B) 通过测定损伤 ROI 内的平均荧光强度，并将其归一化至整个细胞核的平均荧光强度来量化募集情况。(C) 可对每个时间序列图像测量募集的动力学过程。图表代表两次独立实验，误差棒表示标准误差（SEM，n=24）。请点击此处查看此图的放大版本。

发色团损伤分析；荧光图、显微镜；DNA修复；紫外线实验。
图2．激光显微照射诱导核苷酸损伤。
CHO-K1细胞接受激光显微照射，并在损伤诱导后立即固定。通过免疫荧光检测CPD和8-oxodG加合物。（A）上图，CPD染色后受损细胞中感兴趣区域（ROI）平均荧光强度的散点图。下图，CPD染色的代表性图像。箭头指示显微照射位置，比例尺为10 µm（n=12）。（B）8-oxodG染色的代表性图像。箭头指示显微照射位置，比例尺为10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜结果；53BP1/yH2AX 平均荧光强度；辐照研究；感兴趣区域（ROI）图表。
图3。DNA双链断裂标志物对355 nm微辐照的响应呈剂量依赖性。
CHO-K1细胞接受微辐照处理，并在刺激后指定时间点固定。随后进行DNA双链断裂标志物γH2AX和53BP-1的免疫荧光染色。（A）未受损细胞与受损细胞中归一化损伤区域（ROI）平均荧光强度的散点图。误差线代表标准误差（SEM，n=12）。（B）γH2AX和53BP-1染色的代表性图像。箭头指示微辐照位置，比例尺为10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA损伤反应、荧光显微镜图像及图表，53BP1和γH2AX蛋白分析。
图4. DNA双链断裂标志物对405 nm微辐照产生强烈响应。
CHO-K1细胞接受微辐照处理，并在刺激后指定时间点固定。对DSB标志物γH2AX和53BP-1进行免疫荧光染色。(A) 未损伤细胞与损伤细胞中归一化损伤ROI平均荧光强度的散点图。误差条代表标准误差（SEM，n=12）。(B) γH2AX和53BP-1染色的代表性图像。箭头指示微辐照位置，比例尺为10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

根据此处所述条件，任何配备由制造商集成或用户后期添加的紫外-A或405 nm激光器的共聚焦显微镜，均可在细胞核内诱导DNA损伤，并可监测DNA修复蛋白向诱导损伤位点的募集过程。然而，如实验方案及代表性结果中所述，波长选择、施加功率以及损伤特征的表征均为用户在研究特定DNA修复通路前必须首先解决的重要问题。此外，实验设计中还存在其他需要用户考虑的因素。

为了在显微照射后监测活细胞中蛋白质的行为，必须构建一个带有荧光标记的蛋白质。目前已有多种光谱上可区分的荧光蛋白，可用于构建蛋白质融合体，从而表征细胞对DNA损伤诱导的响应。通过瞬时转染目标荧光蛋白，可快速筛选损伤条件、突变体甚至抑制剂；而稳定转染的细胞则能更精确地控制表达水平，并可用于其他生物化学分析，以验证显微照射实验结果。在同一细胞中，还可利用光谱不同的荧光蛋白来监测同一通路或不同通路中蛋白质之间的相互作用。此外，荧光蛋白的使用避免了为每种目标蛋白制备特异性抗体的需要，并可在DNA损伤诱导后长时间实时监测活细胞中蛋白质的行为。

然而，荧光蛋白的使用也存在一些缺点。在缺乏目标蛋白遗传背景缺失的情况下，内源性蛋白会与荧光标记的蛋白发生竞争。将荧光标签连接至蛋白的N端或C端可能改变蛋白折叠、阻碍关键的蛋白-蛋白相互作用，或阻断转运信号，从而改变蛋白功能并可能影响其招募动力学。已有多个研究报告表明，通过免疫荧光染色发现，在损伤位点处内源性蛋白的招募和滞留时间与荧光标记蛋白相比存在显著差异28。使用瞬时转染或稳定克隆也可能因蛋白表达水平的差异而改变所观察到的反应。此外，在单个实验中使用多种荧光蛋白时，若蛋白表达水平未充分平衡，或较大分子量的荧光标记蛋白的招募阻碍了其他蛋白的招募，则也可能改变招募动力学。最后，荧光蛋白可作为弱致敏剂，增加活性氧物种的生成，从而可能改变所诱导的DNA损伤类型46,47。尽管存在这些缺点，荧光蛋白在利用微辐照研究DNA修复过程中仍具有诸多独特优势；只要研究人员引入适当的对照，例如本文所述的损伤特征分析，仍可为DNA损伤应答及蛋白-蛋白相互作用提供新的见解3。

如果不需要活细胞成像，可以使用免疫荧光技术来监测诱导损伤后的细胞反应。通过在损伤诱导后的特定时间点固定细胞，并使用针对目标蛋白和损伤位点的特异性抗体进行染色，可以获得损伤诱导以及修复蛋白招募与滞留的静态图像。利用抗体可同时监测多种目标蛋白的招募情况和/或DNA损伤应答所诱导的翻译后修饰。免疫荧光技术无需使用荧光蛋白，因而能够用于研究内源性蛋白的行为。然而，该方法也存在一些局限性。需要使用高度特异性的抗体，且透化和封闭步骤需优化，以确保蛋白招募信号具有足够的检测强度。固定过程并非瞬时完成，这一物理限制影响了该方法的时间分辨率。此外，在染色后重新定位损伤位点以识别先前处理的细胞，也可能带来显著的技术挑战。本研究所用的共聚焦显微镜支持基于图像的定位注册（如上所述），因此可高精度地重新定位已损伤的细胞。若缺乏载物台定位系统或刻痕盖玻片，重新寻找细胞所需的时间投入，加上损伤诱导与成像之间固有的时间延迟，可能使部分用户认为免疫荧光方法不够理想。然而，最准确且完整的微辐照实验设计应将此类方法与荧光蛋白技术并行使用，正如本方案中所述。

本研究采用活细胞成像和免疫荧光染色技术，以展示激光微辐照技术的应用价值。免疫荧光染色使我们能够精确分析不同激光功率所产生的DNA损伤混合类型，以及所诱导的蛋白募集情况，从而更准确地解读XRCC1-GFP在募集与滞留行为上的变化。根据这些结果，405 nm激光在用于碱基切除修复（BER）和单链断裂修复（SSBR）相关蛋白研究时应受到限制。此外，理想的实验设计应包括物镜后端的激光功率测定、针对所用每种细胞系的完整损伤类型表征，以及利用免疫荧光验证荧光标记蛋白所观察到的募集与滞留现象。显然，由于设备、时间和成本的限制，部分研究者可能难以实现上述最优实验设计。然而，本文已充分证明了这些要素的重要性，因此研究者在开展微辐照实验前应充分考虑这些关键因素。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢美国国家环境卫生科学研究所的 Samuel H. Wilson 博士提供本研究所用的细胞系。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
尼康 A1rsi 激光扫描共聚焦显微镜Nikon
NIS Elements 软件Nikon
355 nm 激光器PicoQuant VisUV辐射源
检流计光激活微型扫描器Bruker
显微镜载玻片光电二极管功率传感器THORLabsS170C
光纤光电二极管功率传感器THORLabsS150C
数字手持式光功率和能量计THORLabsPM100D
CHO-K1来自中国台湾 NIEHS 的 Samuel H. Wilson 博士
最低必需培养基HycloneSH3026501
胎牛血清Atlanta biologicalsS11550
XRCC1-GFPOrigeneRG204952
JetprimePolyplus transfection11407
遗传霉素ThermoFisher10131035
四孔盖玻片ThermoFisher155382
八孔盖玻片ThermoFisher155409
抗 53BP-1 抗体NovusNB100304
抗磷酸化组蛋白 H2AX Millipore05-636-I
抗环丁烷嘧啶二聚体抗体Cosmo Bio cloneCAC-NM-DND-001
抗 8-氧代-2´-脱氧鸟苷 Trevigen4354-MC-050
Alexa 488 山羊抗小鼠抗体ThermoFisherA11029
Alexa 546 山羊抗兔抗体ThermoFisherA11010
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）ThermoFisherR37606注意：有毒！
磷酸盐缓冲液ThermoFisher0780
正常山羊血清ThermoFisher31873
牛血清白蛋白（BSA）Jackson Immuno Research001-000-162
37% 甲醛ThermoFisher9311注意：有毒！
乙醇Decon Labs2716
甲醇VWRBDH1135注意：有毒！
HClFisherSA49
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002注意：有毒！
Tris 盐酸盐AmrescoO234
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

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DNA损伤诱导DNA修复蛋白共聚焦显微镜单链断裂双链断裂XRCC1-GFP募集355纳米激光405纳米激光延时成像
激光微照射技术在哺乳动物细胞单链与双链断裂修复研究中的应用
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