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方法文章

体内追踪荧光脂溶性膜染料标记的人脂肪源性间充质干细胞在大鼠膝骨关节炎模型中的分布

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DOI：

10.3791/56273

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2017年10月8日

 ,  ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, China, 2Cellular Biomedicine Group, California, 3Department of Orthopedics, Shanghai TCM-Integrated Hospital, 4Department of Orthopedics, Shanghai East Hospital, Tongji University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种通过关节内注射，在大鼠膝骨关节炎（KOA）模型中利用远红荧光标记高效监测人脂肪来源的间充质干细胞（haMSCs）细胞存留及生物分布的方法。

摘要

为了支持人脂肪源性间充质干细胞（haMSC）疗法在膝骨关节炎（KOA）中的临床应用，我们研究了haMSCs在动物模型中的细胞存留效果与生物分布情况。我们展示了一种利用脂溶性荧光染料标记haMSC细胞膜的方法。随后，通过活体成像系统对接受手术诱导KOA的大鼠进行标记细胞的关节腔内注射，并进行动态监测 体内 成像系统。我们采用了亲脂性碳菁染料DiD（DilC18 (5))，一种远红荧光Dil（二烷基碳菁）类似物，利用红光激光激发以避免周围组织天然绿色自发荧光的干扰。此外，DiD的红移发射光谱使得在活体动物中可实现深层组织成像，且标记过程对haMSCs无细胞毒性或功能损伤。该方法已被证实为在大鼠膝骨关节炎（KOA）模型中追踪haMSCs的有效手段。此技术还可用于临床前研究中确定来自其他来源的间充质干细胞（MSCs）的最佳给药途径和剂量。

引言

膝骨关节炎（KOA）是一种由于关节软骨丧失和进行性炎症引起的退行性疾病，已成为全球老年人群中的主要慢性疾病1。然而，目前使用抗炎药物、物理补充剂和外科手术等治疗方法仅能暂时缓解症状性疼痛2。

人脂肪来源的间充质干细胞（haMSCs）因其具有软骨再生的多向分化潜能和免疫调节特性，已成为治疗膝骨关节炎的一种有前景的再生疗法3,4与药理学途径相比，用于研究作用机制 体内在临床应用之前，对小型KOA动物模型中活体haMSCs的追踪目前具有指导意义，可用于建立haMSC治疗的理论基础和可行性。在临床前测试中，内侧半月板切除术（MM）通过破坏关节的机械负荷稳定性以在大鼠中诱导KOA，该模型具有相对较高的可行性与一致的可重复性。5. 与单纯前交叉韧带切断或联合部分内侧半月板切除术相比，由MM诱导的膝骨关节炎发病更早6因此，通常在通过MM诱导的骨关节炎大鼠模型中评估注射的haMSCs与病变微环境之间的长期相互作用。7,8.

尽管人羊膜间充质干细胞（haMSCs）的治疗功效已有大量报道，但关于其 体内 通过关节内（IA）注射植入的haMSCs的存留时间较短9,10因此，已开发出多种细胞标记方法，包括免疫组织化学11，荧光素酶12绿色荧光蛋白13 转染，用于磁共振成像（MRI）的氧化铁标记14以及多种荧光细胞染料8,15,16与耗时费力的组织学分析相比， 体内 非侵入性成像利用光学设备检测带有荧光信号标记的细胞的实时分布与动态变化10,17对于功能性活细胞成像，细胞相容性荧光标记是一种复杂的非放射性示踪技术，可用于揭示干细胞移植后的细胞活动18此外，多色荧光脂溶性染料相较于氨基反应性亲水染料或荧光蛋白具有优势，包括更优的细胞通透性和更高的荧光量子产率19.

因此，本文所述方案采用红色激光激发经亲脂性碳菁类染料DiD（DilC）标记的细胞18（5），一种远红荧光Dil（二烷基碳菁）类似物20DiD 的红移激发和发射光谱可避免自发荧光干扰，从而实现对活体动物长时间的深层组织成像8. 这种细胞追踪方法 体内 用DiD标记适用于在动物模型中监测移植的干细胞（如haMSCs），这对于理解并改进现有的干细胞再生疗法至关重要。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得当地机构动物护理与伦理委员会的批准，并致力于尽量减少动物痛苦。本方案已获上海交通大学医学院附属上海第九人民医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，方案编号为[2017]063。

1. 建立手术诱导的大鼠膝骨关节炎模型

  1. 进行该手术时，使用8至12周龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重在250至300 g之间。
  2. 通过肌肉注射给予40 mg/kg的替拉明和40 mg/kg的唑拉西泮以麻醉动物。
  3. 将动物置于加热平台上，采取左侧卧位。用剃刀彻底剃除右膝部位的毛发。先用10%聚维酮碘溶液对术区进行消毒，再用70%乙醇消毒，重复此过程两次，最后再涂布一次10%聚维酮碘溶液，并用手术垫覆盖非手术区域。
  4. 使用手术刀沿髌腱外侧做一条长约2 cm的切口，以暴露关节囊。
  5. 使用手术刀横断内侧副韧带。将半月板向股骨方向翻起。
  6. 术中持续滴加无菌0.9%氯化钠溶液于关节软骨表面，以防止软骨干燥。
  7. 用镊子夹住内侧半月板，使用手术刀从胫骨附着处最窄点将其切断（图1A）。注意避免损伤软骨。
  8. 使用4-0可吸收缝线缝合关节囊。
  9. 密切观察手术后的大鼠，直至其恢复意识。
  10. 术后通过肌肉注射给予20 mg/kg的庆大霉素以预防感染，并给予0.05 mg/kg的丁丙诺啡以缓解疼痛。
  11. 将大鼠饲养于温度受控的动物设施中，维持12小时光照/12小时黑暗的循环环境，持续3至8周以诱导膝骨关节炎（KOA）的发生。若疼痛症状持续存在，动物应继续接受镇痛药物治疗，包括但不限于丁丙诺啡（0.05 mg/kg，肌内注射）和庆大霉素（20 mg/kg，肌内注射）。

2. 大鼠 KOA 模型的组织学评估

  1. 用过量的一氧化碳处死大鼠2 在手术后指定时间点（代表性结果展示为KOA诱导后8周，时间范围为3至8周）进行吸入麻醉（以每分钟约30%腔室体积的速率向腔室内已有的空气添加二氧化碳，使动物在2-3分钟内失去意识。在呼吸停止后，继续维持二氧化碳气流至少1分钟）。 
  2. 解剖膝关节周围的皮肤和肌肉，并用手术刀切断膝关节。
  3. 将膝关节在4%多聚甲醛（PFA）中固定3天，室温条件下进行。随后，在20%乙二胺四乙酸（EDTA）中于4 °C脱钙约4周，每3天更换一次EDTA溶液。
    注意：多聚甲醛具有毒性，需佩戴适当的个人防护装备（PPE），如手套和护目镜。
  4. 使用自动组织脱水机对样本进行脱水。设置程序启动冲洗循环，步骤如下：70% 乙醇处理 1 小时；随后分别用 80% 乙醇和 95% 乙醇各处理 1 小时；接着用 100% 乙醇处理 2 个循环，每个循环 1 小时；然后二甲苯处理 2 次，每次 1 小时；最后在 58 °C 下用石蜡处理 3 次，每次 1 小时。
    注意：二甲苯有毒，操作时应穿戴适当的个人防护装备，如手套和护目镜。
    注意：可选择使用Coplin瓶，采用与自动组织处理机相同的设置进行手动脱水。
  5. 将完整关节的内侧面向下放置，并将组织中心嵌入石蜡块中。
    注意：可选择使用镊子手动将样本包埋于石蜡块中。
  6. 从关节内侧边缘开始，使用旋转式切片机以30 µm间隔连续切取2个5 µm厚的矢状面切片。
  7. 将切片贴附于玻璃载片上，并用二甲苯脱蜡。在两连续切片之间，对其中一张载片进行苏木精染色。 & 伊红（H&E染色：0.1%苏木精染色15分钟，1%乙酸溶液处理10秒，0.5%伊红染色10分钟。另一张切片进行番红O/固绿染色：0.1%苏木精染色15分钟，0.02%固绿染色3分钟，1%乙酸溶液处理10秒，0.1%番红O染色3分钟。
    注意：二甲苯有毒，应穿戴适当的个人防护装备，如手套、护目镜。
  8. 使用国际骨关节炎研究学会（OARSI）大鼠组织病理学评估系统对染色切片进行评分6.

3. 使用荧光染料DiD标记人类间充质干细胞

  1. 用100%乙醇配制1 mM浓度的DiD细胞标记溶液。避光保存该细胞标记溶液，可在室温下保存长达6个月。
  2. 在含1%青霉素和链霉素以及10%胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，按照标准细胞培养程序，在10 cm培养皿中培养haMSCs。
  3. 当细胞融合度接近80%时，使用2 mL含1 mM EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并脱离haMSCs。
  4. 加入4 mL培养基中和胰蛋白酶，并在室温下以800 × g离心3分钟。
  5. 将细胞重悬于5 mL无血清培养基中，密度为1 × 106 个细胞/mL。
  6. 在37 °C条件下，向5 mL无血清培养基中加入50 µL DiD细胞标记溶液，孵育50分钟以标记细胞。
  7. 以800 × g离心标记后的细胞3分钟。
  8. 再用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，每次均以800 × g离心3分钟。
  9. 使用配备Cy5滤光片组的荧光显微镜检查标记后的haMSCs。
  10. 用台盼蓝染色计数细胞，并将2.5 × 106 个活细胞重悬于100 µL PBS中用于注射。

4. 在体 内 荧光成像追踪人脂肪间充质干细胞

  1. 手术后8周（步骤1），通过肌肉注射25 mg/kg的替来他明和25 mg/kg的唑拉西泮麻醉骨关节炎大鼠。
  2. 用剃刀彻底剃除右膝毛发，以暴露关节区域。使用70%乙醇对关节区域进行消毒。
  3. 使用26 G注射器针头，注入2.5 × 106 位于髌韧带内侧、股骨内侧髁和胫骨内侧髁所形成的三角区域中心处，将标记细胞悬浮于100 µL PBS中图1B).
  4. 打开成像软件并初始化 体内 生物发光成像系统
  5. 将大鼠仰卧位固定于成像系统中央台面上，关闭舱门。
  6. 检查 "荧光的" 复选框并选择激发波长为 640 nm、发射波长为 680 nm 的荧光滤光片组（图 2A).
  7. 选择视野至 D。将像素合并设为中等（8），光圈值设为 2，曝光时间设为自动。保持最佳曝光时间一致，以确保整个研究过程中结果具有可比性。图2A).
  8. 将动物从载物台上移开，并监测其麻醉恢复情况。
    注意：将动物放置在覆盖有2-3层毛巾的加热垫上。
  9. 选择用于测量荧光的辐射效率单位图2B). 选择用于分析的感兴趣区域（ROI），并量化每张图像中的荧光信号（图2C).
  10. 重复该步骤的操作 体内 依次对每只大鼠进行成像，以研究haMSCs在关节内的长期存留情况。
    注意： 建议在注射后的第一周内每两天使用活体成像系统对动物的荧光信号进行一次成像，之后每周成像一次，直至无法检测到信号为止。

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结果

为了建立膝骨关节炎（KOA）模型，对SD大鼠的右膝关节进行了MM手术（图3）。术后8周处死大鼠，对膝关节连续切片进行H&E染色和番红O-快绿（Safranin O/Fast Green）染色评估（图4）。H&E染色结果显示，与未手术的正常关节相比，手术侧关节的关节软骨表面边界更为粗糙。番红O-快绿染色显示，与正常关节相比，手术侧关节中蛋白聚糖（红色染色）减少，纤维化胶原（绿色染色）增加，表明手术成功诱导了退行性KOA表型的进展。为了模拟人类KOA的进展过程，分别在MM术后3周、6周和8周处死大鼠，以评估病变发生过程并确定治疗干预的时间点。

DiD标记的haMSCs通过光学成像在KOA大鼠模型中进行可视化 体内 成像系统。标记1小时后，DiD标记的haMSCs呈圆形 体外标记效率达到约...

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讨论

在将再生性干细胞治疗从实验室推向临床应用之前，迫切需要开展干细胞治疗的安全性标准和生物分布研究。然而，疾病所处的病理环境在移植的haMSCs持久性及生物分布中起着重要作用10。近期，我们课题组证实，在病理性的膝骨关节炎（KOA）环境中，关节腔内注射的haMSCs比在正常条件下注射具有更长的存留时间8。炎症性和退行性的微环境可能募集间充质干细胞参与修复过程，从而有利于注射后haMSCs的滞留1,21。此外，haMSCs的安全性和有效性可能受到细胞输注时机以及KOA严重程度的影响，因此优化实验动物模型中KOA的进展将为支持临床试验提供宝贵数据。为了模拟人类KOA轻度至中度的病情严重程度，采用MM法诱导的大鼠允许其KOA发展3至8周。本研究中，在术后8周通过组织病理学评分评估软骨的形态学变化，该模型提供了中等程度KOA的相对可行方案，可用于评估haMSCs的有效性和安全性8。本文展示了...

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披露

Meng Li、Ming Hao 和 Wen Wang 目前是中生北控生物科技股份有限公司（纳斯达克：CBMG）的员工并持有股票期权。其他作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由上海市科学技术委员会（中国）资助的上海创新基金（1402H294300）支持，资助对象为王文博士。我们感谢周广东博士（中国组织工程研究中心）在本论文撰写过程中提供的技术支持与科学指导。我们还感谢夏惠堂先生（上海第九人民医院）在动物福利方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Matrx VMR 动物麻醉系统MidmarkVIP3000
4-0 缝合线上海金环KC439
剃刀PritechLD-9987
庆大霉素浙江金大康动物保健品有限公司无
0.9% 氯化钠溶液湖南科伦制药有限公司H43020455
青霉素上海康福化工制药有限公司无
丁丙诺啡天津药物研究院药业有限公司无
多聚甲醛Sigma-Aldrich16005用 PBS 稀释至终浓度为 10%
EDTASigma-AldrichE9884用 PBS 稀释至终浓度为 20%
0.1% Mayer’s 苏木精溶液Sigma-AldrichMHS16
0.5% 醇溶性伊红 Y 溶液Sigma-AldrichHT110116
沙黄 OSigma-AldrichS8884
快绿Sigma-AldrichF7258
Shandon Excelsior ES 组织处理机Thermo FisherA78400006
Shandon Histocentre™ 3 组织包埋中心Thermo FisherB64100010
全自动旋转式切片机LeicaRM2255
DiDMolecular Probes, Life
Technologies		V-22887
D-MEM 高糖培养基Sigma-AldrichD5648
PBSGIBCO, Life Technologies14190-144
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液Invitrogen25200-114
10 cm 培养皿CorningV118877
离心机BeckmanOptima MAX-TL
荧光显微镜OlympusBX53
0.4% 台盼蓝溶液Sigma-Aldrich93595
替替胺Virbac (Zoletil 50)1000000188
唑拉西泮Virbac (Zoletil 50)1000000188
一次性无菌皮下注射器 26G上海美事瓦医疗器械工业有限公司无
IVIS Spectrum 活体成像系统PerkinElmer124262
Living Imaging 4.0 软件PerkinElmer无

参考文献

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