体内追踪荧光脂溶性膜染料标记的人脂肪源性间充质干细胞在大鼠膝骨关节炎模型中的分布

摘要

本方案描述了一种通过关节内注射，在大鼠膝骨关节炎（KOA）模型中利用远红荧光标记高效监测人脂肪来源的间充质干细胞（haMSCs）细胞存留及生物分布的方法。

摘要

为了支持人脂肪源性间充质干细胞（haMSC）疗法在膝骨关节炎（KOA）中的临床应用，我们研究了haMSCs在动物模型中的细胞存留效果与生物分布情况。我们展示了一种利用脂溶性荧光染料标记haMSC细胞膜的方法。随后，通过活体成像系统对接受手术诱导KOA的大鼠进行标记细胞的关节腔内注射，并进行动态监测 体内 成像系统。我们采用了亲脂性碳菁染料DiD（DilC₁₈ (5))，一种远红荧光Dil（二烷基碳菁）类似物，利用红光激光激发以避免周围组织天然绿色自发荧光的干扰。此外，DiD的红移发射光谱使得在活体动物中可实现深层组织成像，且标记过程对haMSCs无细胞毒性或功能损伤。该方法已被证实为在大鼠膝骨关节炎（KOA）模型中追踪haMSCs的有效手段。此技术还可用于临床前研究中确定来自其他来源的间充质干细胞（MSCs）的最佳给药途径和剂量。

引言

膝骨关节炎（KOA）是一种由于关节软骨丧失和进行性炎症引起的退行性疾病，已成为全球老年人群中的主要慢性疾病¹。然而，目前使用抗炎药物、物理补充剂和外科手术等治疗方法仅能暂时缓解症状性疼痛²。

人脂肪来源的间充质干细胞（haMSCs）因其具有软骨再生的多向分化潜能和免疫调节特性，已成为治疗膝骨关节炎的一种有前景的再生疗法^3,4与药理学途径相比，用于研究作用机制 体内在临床应用之前，对小型KOA动物模型中活体haMSCs的追踪目前具有指导意义，可用于建立haMSC治疗的理论基础和可行性。在临床前测试中，内侧半月板切除术（MM）通过破坏关节的机械负荷稳定性以在大鼠中诱导KOA，该模型具有相对较高的可行性与一致的可重复性。⁵. 与单纯前交叉韧带切断或联合部分内侧半月板切除术相比，由MM诱导的膝骨关节炎发病更早⁶因此，通常在通过MM诱导的骨关节炎大鼠模型中评估注射的haMSCs与病变微环境之间的长期相互作用。^7,8.

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得当地机构动物护理与伦理委员会的批准，并致力于尽量减少动物痛苦。本方案已获上海交通大学医学院附属上海第九人民医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，方案编号为[2017]063。

1. 建立手术诱导的大鼠膝骨关节炎模型

1. 进行该手术时，使用8至12周龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重在250至300 g之间。
2. 通过肌肉注射给予40 mg/kg的替拉明和40 mg/kg的唑拉西泮以麻醉动物。
3. 将动物置于加热平台上，采取左侧卧位。用剃刀彻底剃除右膝部位的毛发。先用10%聚维酮碘溶液对术区进行消毒，再用70%乙醇消毒，重复此过程两次，最后再涂布一次10%聚维酮碘溶液，并用手术垫覆盖非手术区域。
4. 使用手术刀沿髌腱外侧做一条长约2 cm的切口，以暴露关节囊。
5. 使用手术刀横断内侧副韧带。将半月板向股骨方向翻起。
6. 术中持续滴加无菌0.9%氯化钠溶液于关节软骨表面，以防止软骨干燥。
7. 用镊子夹住内侧半月板，使用手术刀从胫骨附着处最窄点将其切断（图1A）。注意避免损伤软骨。
8. 使用4-0可吸收缝线缝合关节囊。
9. 密切观察手术后的大鼠，直至其恢复意识。
10. 术后通过肌肉注射给予20 mg/kg....

结果

为了建立膝骨关节炎（KOA）模型，对SD大鼠的右膝关节进行了MM手术（图3）。术后8周处死大鼠，对膝关节连续切片进行H&E染色和番红O-快绿（Safranin O/Fast Green）染色评估（图4）。H&E染色结果显示，与未手术的正常关节相比，手术侧关节的关节软骨表面边界更为粗糙。番红O-快绿染色显示，与正常关节相比，手术侧关节中蛋白聚糖（红色染色）减少，纤维化胶原（绿色染色）增加，表明手术成功诱导了退行性KOA表型的进展。为了模拟人类KOA的进展过程，分别在MM术后3周、6周和8周处死大鼠，以评估病变发生过程并确定治疗干预的时间点。

DiD标记的haMSCs通过光学成像在KOA大鼠模型中进行可视化 体内 成像系统。标记1小时后，DiD标记的haMSCs呈圆形 体外标记效率达到约.......

讨论

在将再生性干细胞治疗从实验室推向临床应用之前，迫切需要开展干细胞治疗的安全性标准和生物分布研究。然而，疾病所处的病理环境在移植的haMSCs持久性及生物分布中起着重要作用¹⁰。近期，我们课题组证实，在病理性的膝骨关节炎（KOA）环境中，关节腔内注射的haMSCs比在正常条件下注射具有更长的存留时间⁸。炎症性和退行性的微环境可能募集间充质干细胞参与修复过程，从而有利于注射后haMSCs的滞留^1,21。此外，haMSCs的安全性和有效性可能受到细胞输注时机以及KOA严重程度的影响，因此优化实验动物模型中KOA的进展将为支持临床试验提供宝贵数据。为了模拟人类KOA轻度至中度的病情严重程度，采用MM法诱导的大鼠允许其KOA发展3至8周。本研究中，在术后8周通过组织病理学评分评估软骨的形态学变化，该模型提供了中等程度KOA的相对可行方案，可用于评估haMSCs的有效性和安全性⁸。本文展示了.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Matrx VMR 动物麻醉系统	Midmark	VIP3000
4-0 缝合线	上海金环	KC439
剃刀	Pritech	LD-9987
庆大霉素	浙江金大康动物保健品有限公司	无
0.9% 氯化钠溶液	湖南科伦制药有限公司	H43020455
青霉素	上海康福化工制药有限公司	无
丁丙诺啡	天津药物研究院药业有限公司	无
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	16005	用 PBS 稀释至终浓度为 10%
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	用 PBS 稀释至终浓度为 20%
0.1% Mayer’s 苏木精溶液	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% 醇溶性伊红 Y 溶液	Sigma-Aldrich	HT110116
沙黄 O	Sigma-Aldrich	S8884
快绿	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ES 组织处理机	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 组织包埋中心	Thermo Fisher	B64100010
全自动旋转式切片机	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM 高糖培养基	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	Invitrogen	25200-114
10 cm 培养皿	Corning	V118877
离心机	Beckman	Optima MAX-TL
荧光显微镜	Olympus	BX53
0.4% 台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	93595
替替胺	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
唑拉西泮	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
一次性无菌皮下注射器 26G	上海美事瓦医疗器械工业有限公司	无
IVIS Spectrum 活体成像系统	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 软件	PerkinElmer	无