器官供者与受者之间人类白细胞抗原（HLA）序列的不匹配是器官移植中抗体介导排斥反应的主要原因。本文介绍了基于个体供者HLA序列的定制抗原芯片，用于检测器官受者体内针对供者HLA的同种异体抗体。
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摘要
摘要
在器官移植中，移植物的功能和长期存活能力在很大程度上依赖于对针对人类白细胞抗原（HLA）的免疫排斥反应的有效控制。组织相容性指南基于实验室对抗HLA免疫反应的检测，这种免疫反应表现为预先存在或de novo产生的HLA抗体，构成移植的主要障碍。目前的检测方法基于单抗原珠（SAB）平台，使用一组固定的约100种预先选定的重组HLA抗原来检测移植受者的血清。然而，在人类中存在远为多样的HLA类型，除同卵双胞胎外，没有任何两个个体具有完全相同的HLA序列组合。尽管HLA分型和直接测序等先进技术能够精确捕捉供者与受者之间HLA DNA序列的任何差异，但由于SAB检测平台所涵盖的序列种类有限，无法精确检测针对供者HLA错配的特异性同种异体抗体。我们致力于开发一种基于不同技术的互补方法，以个性化方式检测和表征抗供者HLA抗体。该筛查工具是一种定制的肽阵列，包含源自供者HLA序列的多肽，用于检测器官受者移植后的血清，以评估抗体介导排斥反应的风险。针对一对供者-受者，单个阵列上可合成多达600条独特的多肽，每条多肽在15个氨基酸序列中至少含有一个错配残基。在初步实验中，我们比较了移植前后血清在这些阵列上的抗原反应模式，能够以高分辨率检测到抗HLA信号，并进一步精确定位所涉及的免疫表位。这种个性化的抗原阵列为器官移植中供者特异性HLA表位的高分辨率检测提供了可能。
引言
在全球范围内常规开展的器官替代治疗已挽救了数百万人的生命。在美国，每年每百万人中约有100人接受实体器官移植，但由于供体器官严重短缺，仍有更多患者在等待名单上（根据器官获取与移植网络OPTN/UNOS提供的信息：optn.transplant.hrsa.gov）。为了减少器官浪费并挽救生命，器官移植受到严格监管，但用于支持这些监管决策的科学工具在有效性方面仍存在局限。例如，科学界已充分认识到HLA分子的高度多态性，并且近年来已开发出利用高分辨率分型和基于序列的分型（SBT）对DNA进行准确基因检测的技术1,2。然而，同种异体抗体检测方法尚未能够将大量个体化的HLA序列作为抗原探针加以利用。目前的标准检测使用一个固定的约包含100种等位抗原的检测组，这些抗原由人类群体中常见的HLA-A、B、C、DQ、DP和DR序列变异体组成3,4,5,6。通常情况下，实际供体的HLA序列并未包含在该检测组中，迫使移植医生和外科医生只能根据供体实际序列与检测组中"标准"序列之间的相似性来推断供体特异性的免疫反应性7
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方案
本文所述所有方法均已获得西北大学机构审查委员会批准（IRB 方案编号：STU00104680）。本方案的整体工作流程见图1。
1. 供体与受体 HLA 序列的生物信息学分析
- 从 IMGT/HLA 数据库中获取序列15。
- 获取器官供者及其受者的 HLA 分型报告。
注意：必须采用适当的程序保护机密医疗记录。通常，根据机构审查委员会（IRB）的指南，研究方案或实验测试需获得 IRB 批准。如果 HLA 报告来自基于 PCR 的分型（高分辨率或低分辨率）或基于测序的分型（SBT），则直接进入步骤 1.1.3。如果序列来自基因组/HLA 测序，并且序列完整，则直接使用这些序列。偶尔，当仅获得不完整的分型或测序结果时，请遵循附加步骤 1.1.2，通过步骤 1.1.2 中描述的网络工具为"缺失"等位基因进行分配。 - 打开以下网页链接中的“模糊等位基因组合”页面 - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html，使用“模糊等位基因组合搜索工具”功能搜索并获取假想等位基因。然后进入步骤 1.1.3，输入等位基因名称。
- 打开以下网页链接中的 IMGT/HLA 等位基因查询表单 - http://www.ebi.ac.uk/ipd/i....
- 获取器官供者及其受者的 HLA 分型报告。
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结果
在最初使用芯片筛选方法的研究中17，我们共纳入了5名肾移植受者。我们获得了该队列及其相应供者的HLA分型结果，同时掌握了他们的病史以及SAB检测中的等位基因特异性抗体滴度数据。在针对这5例患者的初步研究中，我们设计了两种不同的方法：一种是包含固定肽段组合的标准芯片，另一种是为每对供者-受者个体化定制的个性化芯片。尽管第一种方法在技术上验证了芯片平台在单个移植案例中实现高特异性的能力，但本文及配套视频重点描述了后一种方法的个性化方案，旨在对供者特异性抗体（DSA）进行全面筛查，而DSA通常与移植物不良预后相关5,25,26。
个性化肽阵列已应用于五例病例中的两例17，为说明该.......
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讨论
本文所述SPOT阵列的设计旨在对移植过程中针对器官供者HLA抗原的同种抗体特异性进行实验性研究。与目前临床广泛使用的SAB检测方法相比，抗原阵列方法具有设计灵活的主要优势，能够容纳个体供者的实际HLA序列。该新平台充分利用了快速发展的DNA测序技术的潜力，该技术即将能够无歧义地提供准确的HLA等位基因序列读数16,27，以及全球人群中HLA序列的指定数据库资源的潜力15。我们当前的阵列筛选方案是在多项移植血清小规模预实验成功的基础上建立的。在此需要强调的是，现阶段我们的原型阵列仅用于科研目的，尚不适用于临床实践中的诊断应用。
SAB 与我们的抗原阵列之间的另一个显著区别在于，后者具有更高的分辨率，可区分 HLA 序列中 15 个氨基酸片段内的潜在抗原表位，这可能为同种异体抗原性提供有价值的信息18。然而，与 SAB 展示完整蛋白质抗原并保留其折叠结构不同，抗原阵列仅包含短.......
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致谢
我们感谢加拿大西安大略大学的Shawn Li博士和Xing Li博士在SPOT阵列制备过程中提供的帮助。我们感谢西北大学组织相容性核心实验室和综合移植中心的工作人员提供的样本服务。本工作部分得到了西北纪念医院辅助委员会以及西北大学为J.J.提供的教师启动基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肽阵列 | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 丽春红S溶液 | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| 脱脂奶粉 | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| 山羊抗人IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL 底物 | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot 洗脱缓冲液 | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc 凝胶成像系统 | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
参考文献
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D.
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重印与许可
