用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像对发光共轭吩染色的淀粉样组织的成像

淀粉样蛋白在组织中的沉积是一些疾病的病理特征, 如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、系统性淀粉样变性和朊病毒病。尽管与淀粉样蛋白相关的疾病普遍存在, 而且到目前为止, 近40种不同的蛋白质被归类为人类¹中的淀粉样前体, 但对淀粉样蛋白沉积与疾病表型之间的关系知之甚少。从人类病人的标本组织学已经被用于诊断和科学目的。已经建立了大量的动物模型来研究淀粉样蛋白负荷与行为、寿命和其他一些疾病进展的表型读出之间的相关性^2,3。在药物发现和设计方面也作出了巨大的努力, 以抗击我们最害怕的广泛疾病。然而, 对基因型、表型、淀粉样斑块负荷与药物管理之间的关系的评价并不直接。用于组织中淀粉样蛋白染色和成像的工具通常是钝性的, 并提供低分辨率的淀粉样蛋白的形成和结构信息。

刚果红双折射, 和荧光是典型的方法, 检测和分析组织样本中的淀粉样的负担, 从病人活检和验尸样本, 和动物模型的疾病⁴。这些技术已经使用了几十年 (自二十世纪二十年代以来的刚果红和自二十世纪六十年代以来的衍生品和衍生物), 虽然仪器已被提炼, 并允许详细分析, 染色程序和分析仍在执行在几乎一个世纪前的同样的方式。

在本文中, 我们描述了一种高度敏感的新的淀粉样蛋白染料的利用, hFTAA⁵, 这使得检测小未成熟蛋白质沉积高准确度, 以及检测成熟淀粉样。与传统染料相比, hFTAA 已被证明可以检测到更广泛的疾病相关蛋白聚集^5,6,7。此外, hFTAA 还可以应用于不同的聚合 morphotypes⁸的光学分配。在这里, 我们描述 hFTAA 染色和分析的组织从建立的朊病毒疾病和淀粉样β前体蛋白 (APP) 转基因小鼠的设计, 以模拟斑块发育阿尔茨海默病的研究^9,10.我们还展示了对系统性淀粉样变性患者的诊断和尸检样本的分析。这些有内在属性, 使他们能够报告在一个牌匾的构象差异;并结合两个不同的属性与绑定和荧光的性质, 差异更显着¹¹。一种荧光显微镜, 装有长通滤波器和高光谱相机头, 用于实现光谱特性的客观分类和显微谱分析的记录。以可调谐激光为激发源的共焦荧光显微镜对淀粉样蛋白的三维性质进行了更详细的评价。可调谐激光可以收集的激励频谱和一步少选择发射波长的显微镜下, 使 co-imaging 的柴油荧光和免疫荧光, 以确定共存的目标蛋白和淀粉样。电影提供了前所未有的敏感性, 对构象差异强加给了污染和揭示的差异, 可能无法检测的荧光发射光谱。

所述染色方法的主要目的是促进对小淀粉样沉积物的灵敏检测, 并在淀粉样沉积物中表征构象多态性。这些知识对于蛋白质聚集疾病的基本理解是非常重要的。

注意: 柴油合成已经在我们的实验室进行了十多年。通过对亲芳香取代、钯催化交叉、酰胺偶联和酯水解的协议的基本应用, 我们为不同用途而综合定制探头 ^{5 , 12} . 经过合成、表征和纯化后, 柴油产品在室温下冻干并贮存。一些探测器 (其中 hFTAA) 现在是商用的 (请参见 材料表 ).

1. 柴油染色液

注意: 如果 hFTAA 是从商业供应商购买的, 请按照供应商和 #39 的说明操作, 而不是1节.

1. 重2毫米氢氧化钠中的冻干 hFTAA, 以制备1毫克/毫升的储存液。把存货放在 4 #176 的玻璃瓶里。股票可以储存一年.
2. 在染色的当天, 通过稀释1:10,000 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 来制备一个工作溶液.

2。组织标本的制备

注意: 许多组织类型可以用 hFTAA 作为淀粉样标记来成像。有关示例, 请参见 图 1 。hFTAA 对骨料构象敏感。因此, 染色最好是对不的聚合体进行, 没有表位暴露。如果将组织固定保持在最低限度, 就能获得最佳的频谱质量。因此, 新鲜冰冻的材料, 轻轻地固定在酒精染色时, 是首选。然而, 有可能检测淀粉样沉积也在组织中已固定与 如 , 福尔马林。hFTAA 通常穿透组织好。选择与预期成像技术兼容的试样厚度.

1. 如果福尔马林固定, parafinembedded 部分使用, deparafinize 在二甲苯过夜。连续浸泡99% 乙醇、70% 乙醇、dH ₂ O 和 PBS, 每段10分钟。允许组织切片在环境条件下干燥.
   注意: 二甲苯总是在化学油烟罩中处理。二甲苯和其他有机溶剂是有害的。
   1. 在室温下融化 cryosections。在10% 福尔马林过夜和水化的组织切片, 浸泡在连续的99% 乙醇, 70% 乙醇, dH ₂ O, PBS, 每10分钟。允许组织切片在环境条件下干燥.
2. 将 hFTAA 工作解决方案的液滴 (大约200和 #181; L) 添加到组织部分以覆盖它。水滴应该通过表面张力保持在原地。在室温下孵育30分钟以进行染色.
3. 用500和 #181 冲洗染色液, 然后用吸管将玻片浸入 pbs 浴中10分钟. 允许该剖面在环境条件下干燥.
4. 安装使用荧光安装介质。允许安装介质过夜.
   注意: hFTAA 染色可以与其他染色方法, 如免疫荧光, 细胞或特定的器官特异标记, 等 结合使用。要执行 co-staining, 运行您的选择的完整染色协议, 并添加 hFTAA 染色在年底, 从步骤2.2 开始。有关示例, 请参见 图 2 。对于免疫荧光, 最好选择一个第二抗体, 是兴奋在 640 nm 或更高。在这个波长范围内, hFTAA 不吸收, 因此不能兴奋, 也不会荧光。这确保了 hFTAA 和抗体之间不会有流血.

3。显微镜

注意: 使用带有长通滤波器的荧光显微镜。下面的所有设置都用于在 图 4 中生成图像。可能需要根据淀粉样蛋白类型和组织样本进行调整。虽然 hFTAA 与淀粉样蛋白的结合是稳定的漂白, 它是可取的关闭光源时, 标本是不检查或成像.

1. 他的
   注意: 该实验是使用荧光显微镜与长传递发射过滤器和相机头为他 (见 材料表 ) 进行的。
   1. 使用标准荧光显微镜, 配有长通滤波器和高光谱相机。确保频谱摄像头校准.
   2. 在软件中, 命名项目、选择和 #34; 光谱图像和 #34; 开始获取.
   3. 使用 436 nm 的励磁过滤器, 通过眼睛选择感兴趣的对象, 并将光源路径移到照相机上.
   4. 在案例数据管理器 (CDM) 中, 选择样本类型光谱, 对样本进行标注, 然后按获取。将会打开 "获取" 窗口.
   5. 在购置窗口和 #34; 光谱成像和 #34; 打开 "设置" 菜单, 选择 "购置属性", 并将频谱范围设置为 460-700, 速度质量以最大速度, 在气体/激光/窄带过滤器上测量类型。关闭对话框.
   6. 在 "图像" 菜单中, 选择 "实时满"。在图标栏中, 关闭条纹。选择或调整图像的区域, 使其峰值内存值低于 800 MB。将曝光时间设置为在1000和3000之间提供总图像亮度的值。在图标栏中, 按下彩色照相机。收购将开始。当图像采集完成时, 在 #34 中按下保存; 获取光谱图像和 #34; 对话框和 #34; 新的单元和 #34; 在 "数据管理器" 对话框中.
   7. 从 CDM 中, 使用 "开始分析" 按钮打开收集的图像。将会打开 "数据分析" 窗口.
   8. 通过使用 "频谱显示" 对话框选择 roi, 可以从图像的每个像素收集光谱信息。选择和 #34;d efine 和 #34; 从图像的相关区域中选择 roi.
   9. 使用 Lib 按钮将频谱数据保存为文本文件。可以将保存的 .txt 文件导入到任何选择的分析软件中。. slb 文件可用于数据分析软件中的分析。从整个图像的高光谱数据集也可以导出为原始文件, 作为和 #34; 层作为 tif 和 #34;, 或作为和 #34; 文本格式和 #34 的层; 用于使用外部软件的数据和图像分析应用程序.
2. 共焦显微镜
   注: 共焦显微镜装有可调谐激光器作为激发源。所有的荧光发射实验将激光强度设置为 0.2% (对应于平均功率为3和 #181; W), 针孔至1通风单元, 帧大小为 1024 px x 1024 像素, 扫描速度为 7, 平均超过16扫描, 位深度为8位 (见 s阮富仲 > 材料表 )。这些设置需要调整每个单独的共焦系统, 激光源, 和样本类型。
   1. 用于发射频谱, 收集使用 lambda 模式的数据和使用氩激光的励磁设置为 488 nm。在32通道喘气探测器中使用22通道收集503和 687 nm 之间的发射。将增益设置为 755.
   2. 若要实现单个通道图像, 请使用 "智能设置" 选项。对于 FITC (绿色滤镜), 将增益设置为 750, 对于 Alexa 535 (红色滤镜) 将增益设置为 845.
   3. 收集励磁谱与可调谐的激光, 使用励磁与1毫微米步在490和545毫微米之间, 当收集放射在551和586毫微米之间。将激光强度设置为 2% (对应于平均功率为30和 #181; W), 增益为 774.
   4. 要在频谱模式下收集 Z 堆栈, 请在0.96 和 #181 的步骤中扫描剖面的深度; m。相同的激励和发射设置, 在步骤3.2.1 可以使用, 但设置增益为 730.
3. 电影
   注意: 共焦显微镜装有一个电影单元 (参见 材料表 )。
   1. 为共焦显微镜设置以下参数: 针孔, 20; 激发波长, 490 nm; 激光强度, 0.5% (对应于平均功率为7.5 和 #181; W)。在 40 MHz 时使用脉冲激光器.
   2. 在电影软件中, 设置光子计数超过 550 nm。在显示参数窗口中, 跟随光子计数, 直到最大计数是大约4000光子计数.
   3. 保存文件并将其导出为 SPC 映像.
   4. 将数据与电影软件中的2个组件的指数衰减相匹配。给出 #967 的适合; ² 和 #60; 2 是好的。y-axis 上的值是给定生存期的计数数.
   5. 选择要包括的计数的阈值, 例如 , 100。通过 T1 的颜色代码并选择生存期范围。衰变依赖于 hFTAA 的淀粉样结构。观察到300和 1000 ps 之间的荧光寿命。保存该文件.
   6. 通过使用导出选项导出原始数据, 并将所需数据保存到新文件夹中.

从人类患者和实验动物的许多不同组织类型的大量蛋白质中, 对淀粉样蛋白的敏感和选择性染色对临床诊断和科学研究至关重要。在本文中, 我们展示了如何可以实现这一点, 通过 hFTAA 的例子, 为染色和多模态成像的淀粉样蛋白从选择的组织类型。自从十年前的 thiophene-based 淀粉样体配体第一次发表13, 在各种组织中由多种蛋白质组成的淀粉样沉积物已被图像使用了6、7、11, 14,15,16 (图 1)。与抗体或其他组织学标记相结合, 该方法为诊断和科学目的提供了优秀的工具 (图 1a,图 2)。通过适当选择荧光标记, 可以在同一剖面 (图 1a、hFTAA 和 DAPI、图 2a hFTAA 在免疫荧光设置中) 对多个荧光进行成像。还可以使用明和荧光 (图 2b, hFTAA 和抗体染色) 连续的部分染色。最近, hFTAA 已被证明是一个非常有前途的补充刚果红染色在临床诊断7,15 (图 3)。

在过去的几十年中, 成像技术的发展增加了对淀粉样蛋白的需求, 这些染料可以在一分钟内辨别, 但同时在数量上对淀粉样沉积物的深度差异。柴油内的共轭系统为它提供了一种独特的能力来报告其装订方式的变化。分子的扭曲会导致共轭系统中的结合角失真, 并阻碍电子的传输 (图 4a)。这反过来又反映了柴油的荧光性质, 无论是在激发和发射波长和发射寿命。我们使用他在一个直立的荧光显微镜, 装有长通滤波器的排放。对于共焦显微镜和电影中的激发和发射谱, 我们使用脉冲激光 LSM780。为了举例说明不同的技术, 我们成像一个对象 (β淀粉样蛋白 (a) 斑块在 APP 转基因鼠标) (图 4b-e)。高光谱荧光光谱 (图 4b) 允许对斑块不同区域内的光谱位移和强度变化进行评估。共聚焦显微镜 (图 4c) 的激发谱可用于确定下游实验的最佳激发波长,如, 组合染色与几种荧光。这种方法也可以被证明是有用的, 以检测的构象差异的结合模式的柴油。共焦模式的发射光谱可用于测定 hFTAA 或多种荧光组合实验中定位的荧光发射特性, 并结合几种柴油和免疫荧光组合.hFTAA 的荧光寿命受到 hFTAA 结合方式的微小变化的影响。因此, 电影是区分绑定目标 (图 4d) 对 hFTAA 施加的差异的强大工具。这可以用于例如不同的朊病毒菌株之间的区别8。共聚焦成像和处理 Z 栈成三维图像是一个有用的工具, 探索的整体形状的淀粉样蛋白聚合 (图 4e)。再次, 使用额外的荧光可以帮助理解存款的组成。

图 1: 各种组织类型和蛋白质聚集物显示 h 自由贸易区染色: (a) 马洛里-Denk 体组成的角蛋白聚集在肝脏 (1-4 与 DAPI), (b) p62-positive r 夹杂物在散发包涵体肌炎 (s-IBM) 肌肉组织, (c) 胰岛淀粉样多肽在人的胰腺, (d) 的免疫球蛋白轻链淀粉样蛋白在人的肠道, (e) 绵羊病 (朊) 在小鼠的大脑中, (f) 慢性消瘦症 (朊) 在老鼠脑中, (g) a 斑在 APP23 鼠脑, (h) a 病理在 APP/PS1 鼠脑, 和 (i) 脂肪活检涂片从诊断样本的蛋白淀粉样蛋白在人类患者等级 1-4 根据标准刚果红 (CR) 评分。黄色区域显示 hFTAA 染色的淀粉样沉积物和蓝色是来自脂肪组织的自发荧光。在每个面板中指定刻度线长度。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 带有抗体的 co-staining 的示例.(a) 用抗淀粉样蛋白 a (aa) 免疫荧光和 hFTAA 人 aa 淀粉样在同一切片上进行联合染色。上部左: AA 抗体放射640毫微米;右上 hFTAA 在 488 nm;底部面板覆盖图像显示定位在黄色。(b) 抗体染色和 hFTAA 荧光连续切片。顶部面板: AA 抗体民建联染色, 底部面板: hFTAA 成像与 longpass 发射过滤器。缩放栏: 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 3:荧光与短通滤波器对人心脏蛋白淀粉样蛋白的比较染色与迈尔的苏木精/刚果红色 (a-d) 和迈尔的苏木精/hFTAA (e)。(a) 明图像, (b) 明 + 荧光, (c) 明 + 交叉偏振, (d) 明 + 荧光 + 交叉偏振, (e) hFTAA 荧光405nm + 480 nm 励磁 (连续的部分到a-d)。缩放栏: 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: 用 hFTAA 和几项技术成像的同一个物体用一个 a 的 APP23 老鼠的斑块来演示.(a) hFTAA 的荧光性质取决于其构象状态。给出了 hFTAA 在平面和扭转状态下的结构。(b) 用于评估连续发射谱的高光谱成像。下面板中的光谱是根据图像中有兴趣的盒装区域进行颜色编码的。(c) (i) 用于励磁成像的共焦成像和 (ii 和 iii) 光谱和发射成像在过滤模式或 (iv) 谱模式。(d) 荧光寿命成像检测淀粉样蛋白的构象差异, 在 a 斑块的外围发现较短的生存期, 而在斑块的中心处的寿命更长。下面板中的直方图显示整个斑块的生命时间分布。图像根据直方图下的刻度进行着色。(e) 在筛选模式中收集的共焦 Z 堆栈, 以显示对象的三维结构。在每个面板中指定刻度线长度。请单击此处查看此图的较大版本.

PH PN MB SN 是埃生物技术的小股东, 市场化 hFTAA 在品牌名称 Amytracker545。