所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇 胚胎或解剖组织。利用96孔微孔板和酪胺信号放大技术，可实现高分辨率、高灵敏度、高通量且相对低成本的转录本检测。
本文内容
摘要
摘要
在我们致力于确定表达模式及亚细胞定位的过程中 果蝇 在全基因组范围内以及多种组织中对RNA进行分析，我们对最初的荧光方法进行了大量改进和优化 原位 杂交（FISH）实验方案。为提高通量并降低成本，从探针制备到信号检测的所有步骤均在96孔微孔板中进行。使用cDNA克隆或基因组DNA作为模板，合成地高辛（DIG）标记的反义RNA探针。组织经固定和通透处理后，探针与目标转录本杂交，随后通过一系列试剂进行检测：首先使用与生物素偶联的抗DIG抗体，接着使用与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉亲和素，最后使用荧光标记的酪胺。在HRP存在的情况下，荧光酪胺产生一种高反应活性的中间产物，可与邻近蛋白质中电子密度较高的区域共价结合。该信号放大与定位步骤可产生强而高度局限的信号，有助于实现转录本在细胞水平及亚细胞水平的精确定位。所提供的实验方案已针对多种组织类型和发育阶段进行了优化，可获得高度特异性的信号。文中还提供了相关参考文献，介绍若干改进方案，可用于同时检测多种转录本，或同时检测转录本与蛋白质。
引言
诸如RNA测序（RNA-seq）等新的全基因组RNA检测方法极大地拓展了我们对基因表达时间、表达位置以及表达水平的认识1。然而，这些方法在时间和空间分辨率上相对有限。RNA原位杂交技术能够在固定组织中直观观察转录本的空间分布，从而揭示基因表达在细胞内及亚细胞结构中的精确定位细节2。采用荧光原位杂交（FISH）技术可实现更高的空间分辨率，因为它能够结合共聚焦显微镜和光片显微镜等先进的显微成像技术进行分析3。此外，还可使用DAPI等荧光标记物来确定亚细胞结构之间的空间关系4。FISH技术还支持同时检测多种RNA和蛋白质，并清晰显示它们在亚细胞水平上的共定位情况。有关双标记实验所需的特异性试剂和操作步骤，可参见以下文献3,5。
本文所述实验流程在所有步骤中均使用96孔微孔板，包括cDNA模板制备（菌落PCR）、RNA探针制备（利用T7、T3或SP6聚合酶依赖的截短转录）、原位杂交以及荧光信号的显色。每个96孔板的孔中加入足够数量的胚胎或组织，以便评估结果的一致性和变异性。每个孔分别加入不同的探针。在信号显色完成后，将各孔中的胚胎或组织分别排列在独立的显微镜载玻片上，用于显微分析。
使用酪酰胺信号放大（TSA）进行探针检测可产生具有优异亚细胞分辨率的强信号 5,6,7,8RNA的亚细胞定位是一种重要的调控机制 9 似乎在几乎所有RNA中都会发生的现象 4,10,11这些分析还表明，许多通过RNA测序无法检测到的转录本，使用FISH可轻松检测到。 8RNA的适应性 原位 96孔板杂交可同时分析多达96个目标基因（若使用更多孔板则数量可进一步增加），使得大规模数据集的分析成为可能。通过将孔板切割为较小片段，该方法也可轻松适用于少量样本。所提供的实验方案适用于大多数类型组织中RNA分布的分析。尽管未在此展示，该方法同样可适用于非黑腹果蝇 组织也是如此。
方案
1. 从质粒中扩增cDNA模板的PCR
注意：请使用高质量的质粒或PCR扩增获得的DNA模板进行RNA探针合成。Drosophila 基因组计划（Berkeley Drosophila genome project）构建的 Drosophila 基因集合（DGC）文库覆盖了 Drosophila 基因组中大多数编码基因（见表1a）。该文库还允许使用通用引物扩增任意cDNA插入片段。这些PCR扩增反应以含有质粒的细菌培养物裂解液中的质粒DNA为模板进行。所得DNA产物随后用作体外转录的模板，以生成反义RNA探针（见表1b）。
- 设计引物以通过PCR扩增目的基因的特定外显子区域（例如（来自基因组DNA），最好在反义链末端带有T7聚合酶识别位点。
- 对于少于96个样本的实验，可将96孔板上不需要的部分剪去。所有孵育和储存步骤均需用封板膜（见材料）覆盖板孔。若使用微量离心管，应相应调整反应体积。
注意：96孔板可使用多通道移液器，以提高通量，同时减少试剂用量，节约成本。
| 表 1a | ||||
载体 | 抗生素 工作浓度 1:1000 | 引物 | RNA 聚合酶 用于 反义链 | RNA 聚合酶 用于 正义链 |
| pFLC-I | Amp | pBst_SK(-)_F/R | T3 | T7 |
| pBSt(-) | Amp | pBSt_SK(-) | T7 | T3 |
| pOT2 | Chlor | pOT2_F/R | SP6 | T7 |
| pOTB7 | Chlor | pOT2_F/R | T7 | SP6 |
| 表 1b | ||||
| 引物 | 序列 | |||
| pOT2_Forward | 5'-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3' | |||
| pOT2_Reverse | 5'-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3' | |||
| pBst_SK(-)_Forward | 5'-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3' | |||
| pBst_SK(-)_Reverse | 5'-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3' | |||
表1：A）用于扩增质粒中cDNA插入片段的DGC克隆通用信息。B）DGC质粒通用引物序列。
- 在96孔培养板中，每孔加入240 µL含适当抗生素（1000倍浓缩抗生素母液按1:1000稀释）的LB培养基，以及10 µL原始含质粒的细菌（来自甘油保存菌种），共250 µL，用于培养含质粒的细菌。用封板膜密封。
- 在37 °C、215 rpm条件下振荡培养过夜（O/N）。
注意：请制备一份新的细菌甘油cDNA质粒克隆保存液以替换原始菌种。切勿将原始细菌保存液反复冻融，以免导致细菌死亡。 - 为制备PCR模板，取过夜培养的菌液10 µL，加入90 µL经高压灭菌的ddH2O，转移至新的96孔PCR板各孔中。在PCR仪中于95 °C变性5分钟。随后立即置于冰上冷却至少5分钟。
- 根据表2提供的信息，使用相应的通用引物配制PCR反应体系。
| 试剂 | 50 μl 样本反应 | 96孔混合液 （112倍反应量） | 终浓度 |
| 2 × PCR 聚合酶混合液 | 25 μl | 2800 μl | 1 × |
| Primer_For（25 pmol/μl） | 0.5 μl | 56 μl | 0.25 pmol/μl |
| Primer_Rev（25 pmol/μl） | 0.5 μl | 56 μl | 0.25 pmol/μl |
| ddH2O | 22 μl | 2464 μl | |
| 总量 | 48 μl | 5376 μl |
表2： PCR主混合液。
- 使用移液器，将 48 µL PCR 预混液分装至新的 96 孔 PCR 板的每个孔中。每孔加入 2 µL 变性后的质粒 DNA 模板。
注意：质粒 DNA 用量应介于 1 皮克（pg）至 1 纳克（ng）之间。过量的 DNA 模板会降低 PCR 产物得率和特异性。 - 按照表 3 设置 96 孔 PCR 仪程序并进行扩增反应。
注意：72°C 延伸时间由 PCR 产物大小决定（≤2.0 kb 为 45 秒，≤3.0 kb 为 1.5 分钟，≤4.0 kb 为 3 分钟，4.0–5.0 kb 为 3.5 分钟）。退火温度（Tm）由引物序列决定。当引物长度等于或大于 20 个核苷酸时，Tm 计算公式如下：
Tm (°C) = (4 × CG 碱基数) + (2 × AT 碱基数) - 4。
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环次数 |
| 初始变性 | 95 °C | 3 min | 1 cycle |
| 扩增 变性、退火与延伸 | 95 °C | 45 sec | 30 cycles |
| 54-58 °C | 45 sec | ||
| 72 °C | 45 sec-3.5 min | ||
| 最终延伸 | 72 °C | 7 min | 1 cycle |
| 保存 | 4 °C | hold |
表3：推荐的PCR程序。
- 使用乙醇（EtOH）和乙酸钠（NaOAC）沉淀PCR产物（见表4）。
注意：如果PCR反应体积小于50 µL，用ddH2O补足至50 µL。- 为沉淀DNA，混合表4中的组分，将样品在-20 °C下过夜（O/N）或在-80 °C下放置30分钟。将96孔板在4 °C下以2,250 × g离心45–60分钟。使用8通道多通道移液器小心移除上清液。用160 µL预冷的70 % EtOH（RNase-free）在4 °C下以2,250 × g离心30分钟，洗涤一次。
注意：可在孔底部观察到沉淀的DNA。较短的PCR产物需要更长的离心时间。 - 将96孔板轻轻倒置在纸巾上，以尽可能去除每个孔中残留的液滴。在室温（RT）下将DNA沉淀空气干燥1小时。将沉淀的DNA重悬于25 µL无RNase的水中。
注意：1小时的空气干燥可确保所有残留的EtOH完全挥发。然而，每个孔中应保留极少量液体（约1 µL），以防止DNA沉淀完全干燥。对于50 µL的PCR反应，使用25 µL水重悬。此步骤中请勿使用DEPC处理的水，以免干扰后续步骤中的体外转录（in vitro transcription）。
- 为沉淀DNA，混合表4中的组分，将样品在-20 °C下过夜（O/N）或在-80 °C下放置30分钟。将96孔板在4 °C下以2,250 × g离心45–60分钟。使用8通道多通道移液器小心移除上清液。用160 µL预冷的70 % EtOH（RNase-free）在4 °C下以2,250 × g离心30分钟，洗涤一次。
| 组分 | 体积 | 比例 |
| PCR | 50 μl | |
| 100% 乙醇 | 125 μl | PCR 体积的 2.5 倍 |
| 3M NaOAc（pH=5.2，无 RNase） | 5 μl | PCR 体积的 10% |
| 总计 | 180 μl |
表4：50 µL PCR 反应体系示例。
- 通过在1×TAE缓冲液中使用1%琼脂糖凝胶电泳分析5 µL重悬的DNA溶液，检测PCR产物的大小和产量。
注意：15 µL 反应体系需要 250–500 ng 的 DNA 模板 体外 转录反应。产量较高的样品可进一步稀释。RNA 产量还取决于 DNA 模板的序列和长度。根据使用 T7 RNA 聚合酶进行 DIG-RNA 标记的一般指南，每 1 µg 线性化模板可产生约 10 µg DIG 标记的 RNA。
2. 体外 转录以生成反义探针。
注意：必须在无RNase的环境中操作。所有试剂和实验耗材都必须是无RNase的（例如经过认证的无DNase/RNase塑料制品）。
| 组分 | 储存浓度 | 体积 | 终浓度 |
| ATP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| CTP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| GTP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| UTP | 100 mM | 4.5 μl | 6.5 mM |
| Dig-11-UTP | 10 mM | 25 μl | 3.5 mM |
| 无RNase水 | 19.5 μl | ||
| 总计 | 70 μl |
表5：DIG-NTP混合液的配制。
| 组分 | 15 μl 反应体系 | 96 孔混合液 （112 倍反应） | 终浓度 |
| 5X 转录缓冲液 | 3.00 μl | 3.00 μl | 1 x |
| 地高辛标记的核苷酸混合物（Dig-NTP mix，10 mM） | 0.75 μl | 0.75 μl | 0.5 mM |
| RNase 抑制剂 | 0.25 μl | 0.25 μl | 0.67 U/μl |
| RNA 聚合酶（T7 或 T3 或 SP6） | 2.00 μl | 2.00 μl | 2.67 U/μl |
| 无 RNase 水 | 1.50 μl | 1.50 μl | |
| 总量 | 7.50 μl | 7.50 μl |
表6：2倍转录主混合液。
- 根据表5配制DIG-NTP混合液。
注意：为避免错误，始终将酶标板方向对齐，使A1孔位于酶标板的左上角。 - 在新的96孔PCR板（探针板）的每个孔中加入表6所述的组分。使用多通道移液器向每个对应的孔中加入7.5 µL PCR产物（DNA模板）。用封板膜密封酶标板。
注意：每个转录反应中加入的PCR产物最适量应在0.5至1 µg之间。如果凝胶上的条带明显较弱或较强，可相应调整加入反应体系的DNA体积。具体加入量并非关键。 - 将探针板在37 °C孵育3.5–4小时。取15 µL合成的探针与35 µL经DEPC处理的ddH2O、125 µL 100%乙醇以及5 µL 3 M NaOAc（pH=5.2，RNase-free）混合。在-80 °C保存至少30分钟。按步骤1.10.2和1.10.3所述进行离心和洗涤。
- 将沉淀的探针重悬于25 µL经DEPC处理的ddH2O中。取5 µL样品在1%琼脂糖凝胶上电泳（电泳时间< 20分钟），以检测探针的完整性和产量（图2）。
注意：琼脂糖凝胶必须使用经DEPC处理的ddH2O和TAE缓冲液配制。凝胶电泳装置应专用于RNA实验。长时间低速电泳可能导致RNA在电泳过程中降解。 - 将剩余的20 µL合成探针与100 µL杂交液（表7）混合，保存于-80 °C，待用时取出。
注意：如果条带特别强，可进一步稀释探针浓度（参见图2示例）。杂交液能非常有效地防止RNase污染。探针重悬后应立即加入杂交液，以避免RNA降解。杂交液必须经0.2 µm滤膜过滤。对于组织样本，可通过加入Triton-X-100使杂交液中去污剂的终浓度达到0.3%，以提高效果。
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| DEPC 处理的 ddH₂O | 11.85 ml | 23.7 % |
| 20 X SSC | 12.5 ml | 25 % (5 X) |
| 甲酰胺 | 25 ml | 50 % |
| 肝素 (50 mg/ml) | 0.1 ml | 0.2 % (0.1 mg/ml) |
| 鲑鱼精单链 DNA | 0.5 ml | 1.0 % |
| Tween-20 | 0.05 ml | 0.1 % |
| 总量 | 50.00 ml | 100 % |
表7：杂交溶液。
3. Drosophila 的培养及胚胎、幼虫和成体组织的收集。
注意： 无论是小规模（瓶子）还是大规模（盒子）培养果蝇，均需在25 °C条件下使用基于玉米粉的培养基，并遵循标准的果蝇实验室操作规程。保持适当的成虫和幼虫密度，并在培养基表面添加活性干酵母粉。
- 按照标准方案收集胚胎。胚胎收集的主要步骤如图所示。 图3.
注意：将脱壳后的胚胎用甲醇冲洗后，固定胚胎可在 -20 °C 下保存长达一年。胚胎通透化及再次固定步骤在 FISH 实验方案的第 1 天进行。 - 配制新鲜的40% PFA储存液。
- 配制40%的多聚甲醛（PFA）新鲜储存液：将10 mL经DEPC处理的ddH₂O与适量多聚甲醛混合2在含有小搅拌子的20 mL玻璃闪烁瓶中，加入3.68 g PFA和70 µL 2N KOH。
注意：PFA 具有高毒性，可能对健康造成急性和慢性危害。请阅读材料安全数据表（MSDS），并在使用时对眼睛、皮肤和呼吸道采取适当的防护措施。 - 在通风橱中，将离心管置于加热板上于 200 °C 加热并搅拌 3–5 分钟，直至 PFA 完全溶解。一旦 PFA 溶解，立即从热源上移开 PFA 储备液（避免过热）。
- 将溶解的40% PFA储存液置于冰上冷却5分钟，然后使用0.2 µm滤膜和10 mL注射器过滤。
- 配制40%的多聚甲醛（PFA）新鲜储存液：将10 mL经DEPC处理的ddH₂O与适量多聚甲醛混合2在含有小搅拌子的20 mL玻璃闪烁瓶中，加入3.68 g PFA和70 µL 2N KOH。
- 三龄幼虫（L3）或成体组织的固定、淬灭与通透化
注意：本方案应在一天内完成，包括组织解剖、固定、内源性辣根过氧化物酶淬灭、透化及后固定。- 根据表8配制固定液（Fix-I和Fix-II）。
注意：当组织结构精细且需要保存时，可使用苦味酸作为附加固定剂。但在需为电子显微镜（EM）保存组织超微结构时，苦味酸不是一种理想的固定剂。
警告：苦味酸不稳定，可能与其他物质反应生成爆炸性化合物。请依照安全指南进行使用和储存。 - 将幼虫或成虫果蝇放入含有10 mL冷的1×PBS和100 µL Fix-I溶液的50 mL塑料管中。冰上孵育2分钟，以降低幼虫或成虫果蝇的活动性。
- 剪去1 mL塑料枪头的尖端，形成一个2-3 mm的开口。用该1 mL枪头将10-30只幼虫或成虫从50 mL离心管（步骤3.3.2）转移至含有少量1×PBS的培养皿（直径9 cm）中。加入少量PBTT可降低表面张力。在体视显微镜下，使用一对尖头镊子小心解剖目标幼虫组织（从前端打开，并从后向前挤压组织）或成虫组织。
注意：经验丰富的操作者一天可解剖并固定约200–300个幼虫或成体睾丸。 - 使用200 µL移液器（枪头尖端剪去，形成直径为2 mm的开口）将解剖组织转移至1.5 mL离心管中，置于冰上保存。每轮解剖操作应在10–15分钟内完成，随后进行下一步实验。
注意：根据需要，在2小时内继续进行额外的轮次操作，以生成足够的材料。 - 使用800 µL Fix-I溶液在台式混合器上固定组织30分钟。用800 µL 1 X PBTT缓冲液冲洗组织一次，将离心管置于冰上，最多保存2.5小时。由于固定时间限于30分钟，需分批操作，直至收集到足够的组织。
- 将所有解剖并固定的组织汇集到一个15 mL塑料管中，管盖内含网格（参见 图4 （用于管设计）。通过管盖上的网格抽吸除去多余液体。用10 mL 1×PBTT溶液洗涤3次，每次5分钟。再用10 mL 1×PBS溶液冲洗2次，以去除洗涤剂。此步骤可防止下一步产生过多气泡。
注意：如果解剖的组织沉入管底，可在普通微量滴定板或0.5–1.5 mL微量离心管中进行操作（每管体积为300–800 µL）。 - 用 5 mL 的 0.3 % H₂O₂ 孵育以淬灭内源性辣根过氧化物酶（HRP）活性2O2 在室温下用 PBS 孵育 15 分钟。重复一次。此步骤期间保持盖子打开，不要混匀。用 10 mL 1 × PBTT 洗涤两次。每次用 10 mL 1 × PBTT 洗涤 5 分钟。
- 用10 mL预冷的80%丙酮（-20 °C）在-20 °C下透化组织10分钟，孵育期间将管子倒置两次。用10 mL 1 × PBTT溶液重悬组织，洗涤两次，每次10分钟，以重新水化组织。
- 用5 ml PBTT与5 ml杂交液（1:1）的混合液10 mL冲洗。 弃去混合液，加入10 ml杂交溶液。样品可在 -20 °C 保存直至使用。为获得最佳效果，样品储存时间不应超过一周。
- 根据表8配制固定液（Fix-I和Fix-II）。
| 组分 | 固定液 I (10 ml) | 固定液 II (10 ml) |
| 40 % PFA 储存液 | 1 ml | 1 ml |
| PBTT | 8.99 ml | 9 ml |
| 苦味酸溶液 | 10 μl | - |
表8：组织固定的固定液。
4. 原位 杂交
注意：本实验方案的这一部分至少需要2天完成，第1天进行样品制备、预杂交和杂交，第2天进行探针检测。如果样品数量较多、操作者对该方案不熟悉，或无法在一天内完成全部步骤，则建议将实验分为3天进行，将探针检测和信号放大步骤分别安排在两天内完成。大量胚胎或解剖组织样品可能还需要额外增加处理时间。对于解剖的组织样品，除非另有说明，所有步骤中均需将1× PBT 替换为1× PBTT。由于许多幼虫和成体组织（如脑和睾丸）需要更强的渗透性，因此需要额外添加洗涤剂。尽管尚未经过验证，1× PBTT也可用于胚胎。96孔板每孔使用100 µL，1.5 mL离心管使用800 µL。
- 预杂交与杂交
注意：步骤 4.1.1–4.1.6.2 适用于胚胎 原位 杂交。适用于幼虫或成体组织 原位 杂交步骤，跳过这些步骤。- 将2 mL固定胚胎（保存于-20 °C甲醇中）转移至新的15 mL离心管中。每次用10 mL甲醇洗涤胚胎，共洗涤2次，每次7分钟。用10 mL甲醇与1 X PBTT（1:1）混合液洗涤胚胎7分钟。再用10 mL 1 X PBTT溶液洗涤胚胎2次，每次7分钟，以重新水化。
- 用于胚胎通透化，通过将蛋白酶K贮存液（20 mg/mL）按1:500稀释，配制中间浓度蛋白酶K溶液（40 µL/mL），于-20 °C保存。取中间浓度蛋白酶K溶液，用1 X PBTT按1/15稀释，配制工作浓度蛋白酶K溶液，终浓度为2.667 µg/mL。
- 用10 mL工作浓度的蛋白酶K溶液对胚胎进行通透处理（胚胎数量较少时可减少用量）。将离心管在室温下孵育13分钟，孵育期间轻柔地上下倒置离心管4次。随后将样品置于冰上，在蛋白酶K溶液中孵育1小时，期间不进行混匀。
注意：使用稀释的蛋白酶K进行相对较长时间的孵育，可确保获得可重复且均匀的通透效果，以及后续染色的一致性。 - 在胚胎透化的同时，用10倍浓缩的甘氨酸储存液（20 mg/mL）在1倍PBTT中配制30 mL的2 mg/mL甘氨酸溶液。
- 移除蛋白酶K溶液，用10 mL甘氨酸溶液（2 mg/mL）冲洗，再分别洗涤两次，每次2分钟。用10 mL 1×PBTT缓冲液冲洗三次，以去除甘氨酸。
- 胚胎的固定后处理。
- 配制10 mL 4% PFA（将1 mL 40% PFA加入9 mL PBTT中，经0.45 µm滤膜过滤）。
- 将样品在 4% PFA 中孵育 20 分钟。用 PBTT 洗涤 3 次，每次 2 分钟。
- 为制备变性杂交液，将杂交液煮沸5分钟。对于完整的96孔板，使用三管各12 mL。立即在冰上冷却5分钟。
- 冲洗胚胎 用10 mL 1× PBTT:杂交液（1:1）冲洗一次，再用5 mL杂交液冲洗两次。将沉降的胚胎（30–40个胚胎）或固定组织分装至预冷的96孔PCR板中，每孔约20 µL。使用8通道多联移液器从组织或胚胎中移除杂交液图1/视频).
注意：多通道移液器设有“限位”装置，可防止吸头深入孔底而吸取样品。对于使用漂浮组织的实验，应从液面顶部小心地用100 µL移液器吸出液体。
- 向每个孔中加入100 µL变性的杂交溶液。使用含有金属珠的干浴加热装置，在56 °C下对胚胎进行预杂交，时间至少为2.5–3小时（参见材料和 图1).
- 在96孔PCR板中，使用PCR仪于80 °C对100 µL制备好的探针变性5 min，随后立即置于冰上冷却5 min。移除胚胎或组织中的预杂交溶液，将变性的基因特异性探针加入各样品中，密封膜封板，在干式加热仪中于56 °C下与金属珠共同杂交16–18 h（过夜）。
5. 探针检测
- 将表9中的溶液在56 °C加热装置中预热。从孔板中取出探针。
注意：探针若保存在-80 °C条件下，可重复使用2-3次（切勿将任何RNA样本存放在-20 °C）。杂交后，双链RNA比单链RNA更稳定，且不易受到RNase污染导致的降解。
若对组织使用多孔板真空过滤系统，应在滤膜板下方放置收集板以回收探针（组装细节请参见视频）。杂交后的组织需从用于杂交的常规96孔微孔板转移至每孔底部带有1.2 µm孔径PVDF膜的微孔板中。
| 步骤 | 预热溶液 (56 °C) | 时间 | 每孔体积 |
| 1 | 杂交溶液：PBTT (3:1) | 15 分钟 | 100 μl |
| 2 | 杂交溶液：PBTT (3:1) | 15 分钟 | 100 μl |
| 3 | 杂交溶液：PBTT (1:1) | 15 分钟 | 100 μl |
| 4 | 杂交溶液：PBTT (1:3) | 15 分钟 | 100 μl |
| 5 | PBTT 洗涤 3 次 | 5 分钟 | 100 μl |
表9：杂交后探针的洗涤。
- 若使用普通板，在加热装置中于 56 °C 按照表 9 洗涤样品。 若使用真空 manifold 系统，则在室温下使用加热的溶液配合真空装置，并立即通过真空从下方移除溶液。在使用 1 X PBTT 进行第三次洗涤后，可将普通板从加热装置中取出。
- 制备抗体。
- 将生物素标记的小鼠单克隆抗 DIG 抗体（见材料列表）用 PBTTB 缓冲液按 1:400 稀释，从原液（1 mg/mL）配制 11 mL 的一抗溶液（2.5 µg/mL）。若处理的样品较少，应相应调整体积。
- 将链霉亲和素-HRP 偶联物（见材料列表）用 PBTTB 缓冲液按 1:1000 稀释，从原液（1 mg/mL）配制 11 mL 的链霉亲和素-HRP 溶液（1 µg/mL）。若使用的样品较少，应相应调整体积。
- 在室温下，使用 PBTTB（含 1% 脱脂奶粉的 1 X PBTT）在台式混合器上封闭胚胎或组织 20 分钟。
注意：在用于 96 孔滤板前，应使用滤纸（3 号，6 µm）过滤 PBTTB，以避免堵塞滤膜。在整个实验流程中，所有组织均使用 PBTTB（即在 PBTB 基础上额外添加 0.3% Triton-X-100），而非 PBTB。 - 将胚胎或组织在抗体溶液（每孔 100 µL）中于台式混合器上孵育 2 小时。用 1x PBTTB 漂洗两次，随后用 PBTTB 洗涤 3 次，每次 5 分钟，再洗涤 5 次，每次 10 分钟。接着在台式混合器上用链霉亲和素-HRP 溶液（每孔 100 µL）孵育 1.5 小时。用 PBTTB 洗涤 2 次，每次 5 分钟。自此步骤起，样品需避光保存。
注意：在所有抗体洗涤步骤中，若因奶粉导致浑浊而造成组织丢失，可尝试不加奶粉的洗涤方式（即使用 PBTT 代替 PBTTB）。 - 将 100 X DAPI 溶液用 PBTTB 按 1:100 稀释，配制 DAPI 溶液。
- 将胚胎或组织在 DAPI 溶液（每孔 100 µL）中于台式混合器上孵育 15 分钟。用 PBTT 洗涤 4 次，每次 10 分钟。将含有样品的 96 孔板在 4 °C 过夜保存，或直接进入下一步。
注意：此步骤处可暂停实验流程。
6. 使用酪胺进行抗体检测（见图5）
注意：此处使用了自制的氰基3偶联酪胺，其制备方法依据文献12中描述的方案。若需进行大量实验或检测多个样本，与商业试剂相比（根据经验），此方法可显著节省成本且效果良好。对于实验和样本数量较少的情况，可使用市售的氰基3-酪胺（见材料部分）。
- 用 1 × PBTT 溶液洗涤样品板，每次 5 分钟，共洗 3 次。
- 配制含 0.006% H2O2 的酪胺激活缓冲液（激活缓冲液）（将 30% (w/w) 的 H2O2 原液按 1:5000 比例稀释于 PBTT 中）。
- 用激活缓冲液冲洗样品板。
- 在 15 mL 离心管中，用激活缓冲液稀释 cyanine 3-tyramide，配制 cyanine 3-tyramide 溶液。
- 对于胚胎样品，使用 1:80 稀释度（11 mL 激活缓冲液中加入 137 µL cyanine 3-tyramide）；对于幼虫组织，使用 1:150 稀释度（11 mL 激活缓冲液中加入 73 µL cyanine 3-tyramide）；对于成体睾丸，使用 1:200 稀释度（11 mL 激活缓冲液中加入 55 µL cyanine 3-tyramide）；对于成体卵巢，使用 1:300 稀释度（11 mL 激活缓冲液中加入 36 µL cyanine 3-tyramide）。
- 将样品在室温下置于样品混合仪中，与 cyanine 3-tyramide 溶液孵育 2 小时。用 PBTT 溶液冲洗 4 次，再用 PBTT 溶液洗涤 6 次，每次 10 分钟。最后用 PBS 溶液洗涤 3 次，每次 5 分钟，以去除去垢剂。
- 每孔加入 150 µL 抗荧光淬灭封片剂。将样品在 4 °C 过夜放置，使组织或胚胎沉降至管底。在显微镜载玻片上封片（组织样品可在解剖镜下操作），加盖盖玻片，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。
- 使用荧光显微镜进行成像。
注意：应首先分析阴性对照，以了解“非特异性”背景信号情况。
结果
图6 展示了使用该程序获得结果的示例。上方3个图示为早期 果蝇 胚胎（图6，图A-C），接下来的3个图展示了晚期的示例 果蝇 在不同组织中呈现信号的胚胎（分别为羊膜血清层、肌肉和中枢神经系统）图6，图 D-F）。接下来是三龄幼虫组织的示例（图6，图G-J）。图K和L分别显示成年性腺（卵巢和睾丸）的代表性图像。已有数百张图像上传至我们可搜索的“荧光”数据库并完成注释。 原位 果蝇数据库（FlyFISH（http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca））。
图1. 荧光示意图 原位 杂交（FISH）方案及关键设备 （A） cDNA 的 PCR 扩增 （B） 体外 在96孔板中进行转录以生成基因特异性的地高辛标记的反义RNA探针（b图显示该板的照片）。 (C) 和 (D)： 成虫（雌:雄比例为2:1，每瓶300–400只果蝇）允许交配3–4天。在标准玉米粉培养基上收集过夜的胚胎，用于后续实验。 25 °C 转移到通风良好的塑料盒中（容器尺寸：8" × 8" × 3" 长×宽×高，内含1 L玉米粉培养基）或转移至新瓶子中，保持适当的幼虫密度。为进行组织收集，应在产卵后24、48小时在培养基表面撒上活性干酵母粉。 （E 至 H）： 荧光 原位 连续3天进行杂交实验。对于不漂浮的胚胎或组织，使用96孔PCR板（如图b所示），并配合8通道移液器（如图c所示）进行操作。对于漂浮的组织（如大多数幼虫组织），使用带滤膜底部的板（如图d所示），并通过多通道负压抽吸装置在较低压力下从底部去除液体（如图e所示）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2. RNA探针产量的测定 新合成的反义RNA探针在1%琼脂糖凝胶上观察到（5 µL/lane）。根据条带强度，产量可分为：第3和10泳道为“低产量”，第1、4、5、6和8泳道为“典型产量”，第2、7、9、11和12泳道为“高产量”。对于“典型产量”的样品，使用10-15 µL 探针稀释于 100 µL 每份杂交溶液 原位 实验。根据探针条带强度相对于“典型探针”强度的情况，将“高产量”探针样品用额外的杂交溶液进行稀释。目标是使每个孔中的最终探针浓度大致相等。箭头指向其中一个“RNA探针”，每条泳道中较高的条带为原始DNA模板。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3. 大规模胚胎收集与固定的各个主要步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 用于去除幼虫或漂浮组织中液体的自制管装置。 某些幼虫和成体组织在固定过程中会漂浮于溶液中。该简易工具由一个200 µL截断的枪头固定尼龙滤网，并连接一个1 mL枪头作为适配器，以便连接抽吸装置。通过此方法可安全去除液体，同时不会丢失任何组织。请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 酪胺信号放大技术。 （1）DIG标记的反义RNA探针与内源性有义RNA杂交。（2）生物素偶联的一抗与DIG-UTP发生免疫亲和结合。（3）HRP标记的链霉亲和素结合生物素。（4）HRP催化Cy3-酪胺与过氧化氢反应，生成短寿命的Cy3-酪胺自由基。（5）Cy3-酪胺自由基与邻近蛋白质上的酪氨酸残基共价结合。请点击此处查看此图的放大版本。
图6. 典型示例 原位 杂交图像。 每个图板展示了一种不同的RNA（以青色显示）和用DAPI染色的细胞核（以红色显示）。（A-C）早期的示例 果蝇 胚胎。（D，F）晚期示例 果蝇 胚胎。（G-J）三龄幼虫示例 果蝇 幼虫组织（分别为马氏管、中肠、唾液腺和肌肉）。(K) 成虫卵巢。(L) 成虫睾丸。每个图示均显示探针所杂交的基因名称。比例尺 = 10 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
本方案提供了一种高度可重复、灵敏且经济的方法，用于检测固定后的黑腹果蝇（Drosophila）胚胎或组织中的大多数RNA。尽管该方法在操作上略比传统常用的碱性磷酸酶探针检测法复杂，但荧光原位杂交（FISH）所获得的分辨率显著更高，且灵敏度相当或更优7,8。通过使用完整的或部分的微孔板，该方案可适用于对目的基因进行大规模或有限范围的分析。需要注意的是，所生成的探针可能会检测到全部或多种转录本剪接形式，除非探针设计具有更高特异性（例如针对单个外显子）。尽管我们已成功使用小至200个核苷酸的探针，但更小的探针通常效果较差，且特异性可能降低。显然，本方案不适用于小内含子、外显子或成熟微小RNA（microRNA）的检测。
尽管该方法利用酶促反应步骤来增强信号强度，但信号强度在较宽范围内与靶基因表达水平呈相对线性和成比例的关系。在较高放大倍数下，信号表现为细胞和组织内的点状或斑点状结构。对于相对稀有的转录本，仅能观察到少数微小的点状信号。随着转录本丰度的增加，这些点状信号的数量和尺寸也随之增加。与单分子FISH（smFISH）类似，单个微小的点状信号也可能对应单个RNA分子，可通过成像和生物信息学软件进行便捷的定量分析。将已发表的smFISH图像与我们针对相同靶标整理的图像进行比较，表明两种方法在总体灵敏度和分辨率方面相对接近，尽管仍需更严格的比较来进一步验证。鉴于smFISH的成本显著更高，本文所提供的方法可在成本大幅降低的情况下实现相似的实验效果。然而，若目标是检测较小的转录本或转录本的不同区域，则建议使用smFISH方法。
由于某些FISH探针尺寸较小，该方法在穿透较大组织或具有显著屏障的组织方面可能更具优势。然而，我们通过提高去污剂浓度以及优化组织固定和通透步骤，似乎已解决了这一问题。最后，尽管该方法是为 果蝇 组织，此处所述用于解剖组织的高去垢剂缓冲液也应适用于 果蝇 胚胎以及其他大多数生物体和组织。
披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
本项目获得了加拿大卫生研究院（资助号 MOP 133473）向 HMK 提供的资助支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 聚丙烯圆锥形离心管 | Frogga Bio | TB15-500 | 经认证无DNase和RNase |
| 含染料的2x PCR预混液（Ambiogene） | Biomart（加拿大） | 141106-1K | 经认证无DNase和RNase |
| 50 ml 聚丙烯圆锥形离心管 | Frogga Bio | TB50-500 | 经认证无DNase和RNase |
| 96孔过滤板（1.2 μm，亲水性PVDF膜） | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | 用于移除底部带有漂浮组织的培养板中的液体 |
| 96孔PCR板（200 μl) | 丹维尔 | C18096-10 | |
| Acrodisc 注射器滤器（0.2 μ） | PALL | PN4612 | |
| Acrodisc 注射器滤器（0.45 μ） | PALL | PN4614 | |
| 琼脂糖 | Bioshop | AGA002.500 | |
| AXYGEN 96孔检测储存板 | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | 保存细菌甘油菌种 |
| AXYGEN 铝膜板封膜 | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | 封板 |
| AXYGEN 宽口吸头（200 µl） | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | 转移样品 |
| 生物素-SP（长链间隔）IgG组分单克隆小鼠抗地高辛 | 杰克逊免疫研究实验室 | 200062156 | 原位一抗（储存浓度 1 mg/ml，工作浓度 2.5 μg/ml 或 1/400 稀释度。 |
| BRAND 8通道多联管（可高压灭菌） | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | 去除96孔PCR板顶部的液体 |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C1919 | 储存浓度 34 mg/ml，溶解后经 0.2 μm 滤膜过滤μm 经 100% EtOH 过滤（使用时按 1/1000 比例稀释） |
| Cy3酪胺（Cy3-TSA） | 自制 | 可从 Perkin-Elmer 公司订购，货号 SAT704A001EA | |
| DABCO（1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷） | Sigma-Aldrich | D2522 | 封片剂中的抗荧光淬灭试剂 |
| 地高辛-11-尿苷-5’-三磷酸盐 | 罗氏 | 11-209-256-910 | |
| 胚胎收集笼 | 自制 | N/A | 尺寸：75 cm × 75 cm × 75 cm，由聚甲基丙烯酸甲酯制成 |
| Eppendorf 离心机 5804 | Eppendorf | Model 5804 | 用于A-Z-DWP转子的96孔板离心机 |
| 甲酰胺 | Bioshop | FOR001.500 | |
| 甘油 | Bioshop | GLY002.4 | |
| 甘氨酸 | Bioshop | GLN001.500 | |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | 储备液：50 mg/ml；工作浓度：在杂交溶液中为1 mg/ml |
| Lab Armor 珠 | DiaMed | LAA42370-001 | 填充加热装置 |
| Labnet Gyro M Mini 旋转混匀仪 | Fisher Scientific | 50-998-347 | 样品混匀 |
| 筛网 - 100 微米 | FlyStuff | 57-103 | 用于收集胚胎 |
| 筛网——800 微米 | SEFAR - Nytex | 06-780/53 | 用于捕获松散组织／可用于图4中的特殊管子。 |
| 微型盖玻片 | VWR | 48366-067 | 尺寸：22 × 22 mm |
| 微载玻片，frstd | VWR | 48312-003 | 尺寸：25 X 75 mm |
| 多孔板真空 manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | 从96孔滤板底部移除液体 |
| 多聚甲醛（PFA） | Bioshop | PAR070.500 | 固定 |
| PCR仪 | Bio-Rad | 型号：DNA Engine PTC-200 | 96孔板PCR及探针变性 |
| 苦味酸溶液 | Sigma-Aldrich | 80456 | 组织固定液 I 溶液 |
| 氯化钾（KCl） | Bioshop | POC308 | |
| 96孔板用聚丙烯盖，每箱100个 | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | 用于储存培养板的盖子 |
| Progene 一次性试剂储液槽（50 ml，无菌） | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | 液体处理 |
| Progene 可穿刺铝箔 | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | 密封无 DNase 和 RNase 的 96 孔板 |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | 胚胎通透化 |
| RiboLock 核糖核酸酶抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | EO0381 | 40 单位/微升 |
| 核糖核苷三磷酸（NTP）试剂组 | 罗氏 | 11277057001 | RNA探针合成 |
| RNase-free 水 | GIBCO | 10977015-500ml | RNA探针合成 |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | 去除 RNase 污染 |
| 鲑鱼精细胞来源的单链DNA | Sigma-Aldrich | D9156 | 杂交溶液 |
| 脱脂奶粉 | Bioshop | SKI400.500 | 工作浓度为1%（溶于1×PBT或PBTT）作为封闭试剂 |
| 3 M 醋酸钠（NaOAc），pH=5.2（无RN酶） | Bioshop | SAA333 | 工作浓度为10%（v/v），用于DNA或RNA沉淀 |
| SP6 RNA聚合酶 | 赛默飞世尔科技 | EP0131 | 20 单位/微升 |
| 用于沙浴的不锈钢丸粒 | VWR | 13259-274. | 填充加热装置 |
| 体视显微镜 &和鹅颈灯源 | Leica | 型号：MZ6 | 组织解剖与封片 |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）结合物 | 分子探针 | S911 | 二抗原液：1 mg/ml，使用时按1/1000稀释（1 μg/ml）用于原位。 |
| T3 RNA聚合酶 | 赛默飞世尔科技 | EP0101 | 20 单位/微升 |
| T7 RNA聚合酶 | 赛默飞世尔科技 | EP0111 | 20 单位/微升 |
| 加样站（10 μl） | Axygen | T-300-STK-S | 经认证无DNase和RNase |
| 提示站（200 μl） | 索尔比奥 | 27770T | 经认证无DNase和RNase |
| 提示（1毫升） | 索尔比奥 | 10200 | 经认证无DNase和RNase |
| TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | 工作浓度为 0.3% 的 1 X PBT 溶液，用于组织原位实验 |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510 | 工作浓度为0.1%，溶于1×PBT，用于胚胎原位杂交 |
| Whatman 定性滤纸，3号 | Sigma-Aldrich | WHA1003917 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>溶液 | <强>准备 | ||
| DABCO（1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷）甘油抗荧光淬灭封片剂 | DABCO（1.25 g）、甘油（35 ml 或 v/v 70%）和 1× PBS（15 ml 或 v/v 30%）。避光，于冷室中轻轻摇动，储存于 -20 ℃ °C | ||
| 1 × PBT（1 L） | 1 × PBS 加 1 ml 吐温 20（0.1 %） | ||
| 1 × PBTT（1 L） | 1 × PBS，含 1 ml 吐温-20（0.1%）和 3 ml 曲拉通 X-100（0.3%） | ||
| 1 X PBTB（1L） | 1 % 脱脂牛奶溶于 1 X PBT | ||
| 1 × PBTTB（1 L） | 1 % 脱脂牛奶溶于 1 X PBTT |
参考文献
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
- Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
- Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
- Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).
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