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磁共振显微成像采集过程中对离体活体脑组织的代谢支持

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DOI：

10.3791/56282

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2017年10月18日

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1Department of Neuroscience, University of Florida, 2McKnight Brain Institute, University of Florida, 3Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 4Center for Functionally Integrative Neuroscience, Aarhus University, 5Department of Radiology, University of Florida, 6National High Magnetic Field Laboratory, Florida State University

本文内容

摘要

本方案描述了一种方法，用户可通过该方法在采集磁共振显微成像数据期间维持急性海马和皮层脑片制备物的活性。

摘要

本方案描述了在采集磁共振（MR）显微成像数据期间，维持急性脑片制备物正常代谢功能所必需的操作步骤。尽管对活体、离体的哺乳动物组织进行MR成像在技术上是可行的，但此类实验传统上受限于分辨率，因而无法可视化组织的微细结构。相反，能够实现显微成像分辨率的MR方案则需要使用固定样本，以满足长时间扫描过程中对静态、稳定条件的要求。本方案首次报道了一种可在显微分辨率下对活体哺乳动物组织样本进行成像的MR技术。此类数据对于理解基于病理的微观层面对比度变化如何影响临床常用的宏观MR扫描结果具有重要意义。一旦实现这一理解，将有望开发出灵敏度更高、准确性更强的诊断方法，从而直接促进疾病的早期治疗、更精确的疗效监测以及改善患者的预后。

尽管所述方法主要针对脑组织切片制备，但该方案可适用于任何离体组织切片，只需调整气体和灌注液的配制以满足特定组织的代谢需求即可。成功实施该方案后，应获得存活状态良好的急性组织切片，其磁共振扩散信号稳定性可持续长达15.5小时。与其它磁共振兼容的灌注装置相比，本系统的主要优势在于其与磁共振显微成像硬件的兼容性，可实现更高分辨率的成像，并能够提供持续、不间断的灌注流，且灌注液条件可精确调控。该设计的局限性在于样本通量较低，因每次仅能对一个组织切片进行成像。

引言

随着磁共振成像（MRI）系统持续向更高场强发展，人们对活体组织的组成和状态的了解日益深入。尽管硬件不断进步，但在临床实践中，仍无法实现足以可视化组织细胞结构的磁共振成像分辨率。因此，在分析临床扫描图像内容时，必须推断组织在细胞水平上的特征。此类推断依赖于从可在模型系统中直接观测的数据中获得的等效过程知识。传统上，这些模型包括来自水生生物的细胞，例如Xenopus laevis卵母细胞和Aplysia californica L7神经元1,2。由于这些细胞异常巨大——直径分别约为1000 μm和300 μm——它们成为最早可用于磁共振方法观察的动物细胞。近年来，硬件设计的进步使得哺乳动物中体积最大的细胞之一——α-运动神经元——能够在固定组织上通过磁共振显微成像技术进行成像3,4。尽管这些研究证明了利用磁共振技术直接可视化哺乳动物细胞物质的可行性，但所使用的固定样本在磁共振特性上与活体组织存在显著差异，因此不能作为等效的代表性模型5,6。更重要的是，要观察伴随复杂生物过程同步发生的磁共振对比度变化，必须使用可在成像实验过程中施加干预并进行连续测量的活体样本。

为了促进对活体组织的磁共振显微研究，本文介绍了一种实验方案，该方案结合了商用微成像硬件7与一种专门设计的、与磁共振兼容的腔内氧合及灌注装置，后者此前已有描述8。此设计的独特优势包括可在哺乳动物组织中实现细胞水平的分辨率，并能精确调控组织灌注部位的溶解气体含量和pH值。此外，与大多数在图像采集期间中断灌注以避免流动伪影的离体磁共振研究不同，该设计支持在数据采集过程中持续灌注，已有研究表明持续灌注可改善离体组织的生理状态9,10。最后，其封闭式记录腔室和脑片固定装置有助于降低在长时间图像采集过程中可能出现的运动伪影风险。

尽管当前方案描述了适用于急性海马和皮层脑片的实验操作，但通过精确控制灌流液中的代谢物，该系统能够适应多种不同类型的组织和实验条件。该设计的局限性包括与多脑片灌流室相比，样本通量有所降低11；然而，未来可通过使用多线圈阵列克服这一限制。

此外，尽管所述系统可用于水平或垂直配置，但本方案描述的是其在垂直取向的600 MHz谱仪中的应用。任何能够进行磁共振显微成像研究的系统——通常为窄孔径（≤6 cm）、高磁场（≥500 MHz）的谱仪——均可兼容本文所述的氧合器和灌注设备。然而，若更换成像线圈、梯度系统、探头系统或其他关键成像硬件，可能需要对灌注设备和磁共振扫描参数进行相应调整。

方案

所有所述动物实验均遵循美国国家科学院制定的指南 实验动物护理和使用指南 并经佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准。开展涉及动物受试者的科研工作时，须遵守所有适用的法规和规定。

1. 中枢神经系统组织维持用灌注液的制备

  1. 配制新鲜的人工脑脊液（aCSF）。
    1. 为制备2 L碳酸氢盐缓冲的人工脑脊液灌流液，量取1,500 mL经双重蒸馏或反渗透纯化的水至4 L烧瓶中。将磁力搅拌子放入烧瓶，并使用搅拌器搅拌液体。
    2. 向纯化水中溶解以下量的盐类：14.03 g（120 mM）氯化钠、4.37 g（26 mM）碳酸氢钠、0.41 g（1.5 mM）一碱磷酸钾、0.69 g（1.4 mM）七水合硫酸镁、0.59 g（2 mM）二水合氯化钙、0.45 g（3 mM）氯化钾以及3.6 g（10 mM）葡萄糖。
      注：灌流液的化学成分将根据组织的特定代谢需求和实验所需的条件而有所不同。
    3. 充分混合溶液，直至所有盐类完全溶解。用额外的纯化水定容至2 L。
    4. 使用冰点下降渗透压计测定aCSF的渗透压。使用山梨醇调节至300 mOsm/kg。向2 L渗透压为299 mOsm/kg的aCSF灌流液中加入324 mg山梨醇，可使渗透压升高至300 mOsm/kg（约每324 mg增加1 mOsm）。
      注：aCSF可在密封、密闭的瓶中于4 °C保存，但不得超过24小时。

2. 设置灌注系统

  1. 制备人工脑脊液（aCSF）灌流液。
    1. 将 aCSF 通入 95% 碳合气（95% O₂，5% CO₂）并平衡至室温（约 23 °C）2，5% CO₂2；1/16 升/分钟）通过直接鼓泡，持续不少于 1 小时。
      注意：不同的组织类型或所需的实验条件可能需要调整灌注液的温度或气体成分。通过调节供气中各组分气体的百分比浓度，可精确控制灌注液中溶解气体的含量。图1).
    2. 当人工脑脊液（aCSF）达到所需温度并充分饱和碳氧混合气后，确认其pH值处于生理范围（7.3 - 7.4）。在整个实验过程中，持续将气体以1/16 L/min的流速直接通入灌流液储液罐，以维持适当的溶解氧含量和利于组织正常代谢的pH条件。
  2. 预灌注灌流管路。
    1. 将连接至蠕动式微泵的进液管浸入已准备好的人工脑脊液（aCSF，300 mOsm，pH 7.3–7.4，持续通气）中。
    2. 通过氧合器装置（图2）以及灌注管路穿过磁体孔径和梯度线圈组（从上到下），并将线圈暂置一旁，待探头组装时使用。将氧合器悬挂在烧杯上方，以收集任何流出的aCSF。
      注意：根据MRI系统的具体设计，在使用aCSF对系统进行预充之前，可能需要先将灌注管路穿过磁体孔径、梯度线圈或探头主体基座。在开始预充操作前，请确认灌注管路的布设不会影响探头主体的组装或探头插入磁体孔径。
    3. 确认已选择目标流速（2 mL/min），然后启动泵以开始填充灌注管路。
    4. 将空的在线气泡捕集器倒置，使aCSF置换其中所含的空气。
    5. 将氧合器的气体接口连接至第二个碳合气气源（可为集管或备用碳合气钢瓶），并设置流速为1/16 L/min。
    6. 通过将氧合器顶部的排气口浸入水中，确认碳合气正在流经氧合器的气体交换膜。
    7. 一旦观察到灌流室内有aCSF滴出，通过手动震荡清除进液管路中可见的气泡。
    8. 通过将氧电极浸入灌流室流出的人工脑脊液（aCSF）中，确认氧合器是否正常工作。
      注意：氧气计的读数应接近所提供气体中的氧气百分比。

3. 组织制备

  1. 安乐死
    1. 将一只大鼠（125–150 g）放入麻醉机的诱导室中，以1 L/min的流速吸入4%异氟烷与氧气混合气体，持续4分钟。
    2. 将失去意识的大鼠从麻醉舱中取出。
    3. 通过将大鼠置于仰卧位来执行翻正反射测试。观察是否存在任何运动——如头部转动、抬腿、脊柱弯曲等——这些动作表明动物正在翻转至俯卧姿势。
    4. 使用棉签触碰动物睁开的眼睛，进行眨眼反射测试。观察动物对此感觉刺激是否存在反应，如眼睑闭合、肌肉抽动等。
    5. 最后，使用镊子或止血钳夹住大鼠伸展的后肢脚趾间的皮肤，进行肢体回缩反射测试。观察腿部是否出现屈曲反应。
      注意：若反射试验结果为阳性， 请勿继续 实施安乐死。
    6. 如果三项反射测试中的任何一项出现反应，立即将大鼠放回麻醉舱，并额外暴露于4%异氟烷2分钟。
    7. 完整重复全部三项反射测试。根据需要再次进行2分钟的麻醉暴露，只有在观察到对全部三项反射测试均完全无反应时，方可继续下一步操作。
    8. 通过断头器斩首处死大鼠。
  2. 脑切除术
    1. 通过大体解剖移除大鼠脑组织。将头部置于俯卧位，使用剪刀从颈部后方沿皮肤向吻侧剪至鼻部，暴露颅骨。
    2. 使用钝头探针去除颅骨表面的软组织。
    3. 从尾端开始，使用咬骨钳去除颅骨的枕骨、顶骨和额骨。
    4. 用显微剪刀沿大脑纵裂剪开，将硬脑膜从两侧半球剥离并回缩。
    5. 将头部转至仰卧位，从腹侧切断颅神经，然后将脑组织从颅腔中取出。
  3. 组织切片分离
    1. 将脑组织恢复至俯卧位，通过去除横裂后方及穹窿前方的所有组织，分离出包含海马的中央部分。沿横断面进行两次切割（即 冠状切片）使用直刃剃刀进行切割。
    2. 将脑组织最尾侧的平面用氰基丙烯酸酯胶水固定在振动切片机切割槽的中央。
    3. 向振动切片机切割槽中加入冰冷且通入碳合气的aCSF，并将尼龙固定装置放入其中。
    4. 切取300 μm厚的切片，以获得每半球3至4个可用的切片样本（共6至8个）。
    5. 从一个半球分离出海马或皮层切片，并修剪切片使其适配微线圈直径为5 mm的组织孔。

4. 样品定位与灌注系统组装

  1. 线圈准备
    1. 使用移液管从振动切片机的切片浴中吸取充氧的人工脑脊液（aCSF），填充微线圈的组织腔室。
    2. 取修整好的脑组织样本，在解剖显微镜下将感兴趣区域（例如：锥体细胞层）置于微线圈上方。
    3. 插入组织固定装置（固定在尼龙垫圈上的尼龙网），以确保在整个成像实验过程中保持样本位置稳定。
      注意：应迅速完成样本定位操作，以尽量减少强光照射。必要时可使用移液管补充充氧的人工脑脊液（aCSF）。
  2. 组装腔内氧合器、微线圈与探头
    1. 将改装后的微线圈组件（图3）固定在台式夹具上，并通过将乙缩醛支撑销插入线圈顶部的孔中，安装腔内氧合器装置。
    2. 将灌流室置于微线圈的组织孔上方，使用微型扎带将两者紧密捆合，以密封灌流系统。
    3. 使用剪线钳剪除扎带多余的长度。
      注意：成功密封后，应观察到灌流液从流出管路排出，且灌流室的硅胶密封处无任何泄漏。若在探头组装前未确认上述条件，可能导致成像设备严重损坏。
    4. 当观察到人工脑脊液（aCSF）开始滴入废液储液罐时，取下微线圈与氧合器组件，并将其连接至成像探头本体的顶部。
    5. 将梯度线圈组件滑过上述组装结构，并将其稳固地安装在探头顶部。附图展示了线圈、氧合器与探头硬件组件的相对位置及正确连接方式（图4）。

5. 进行 MR 图像采集

  1. 将组装好的探头插入磁体孔径
    1. 将探头本体放置在磁体底部磁体孔径开口附近。
    2. 从磁体顶部的孔径开口处收回灌注管路多余的长度。
    3. 当灌注管路的所有松弛部分均已拉紧后，从磁体底部将探头本体推进磁体孔径，同时从孔径顶部继续拉紧灌注管路以消除更多松弛。
    4. 将探头底部的两个固定螺钉旋入匀场线圈组对应的槽口中。
    5. 在继续操作前，需确认灌注液是否正常从灌注管路流出至废液储液罐，以确保管路在插入过程中未被压扁或弯折。
      注意：若未确认灌注液流出，可能导致灌注管路永久性损坏，并可能对磁共振成像设备造成灾难性损害。
    6. 若未观察到灌注液从回流管路排出至废液储液罐，应取出探头本体，确认灌注液流动已恢复后再尝试重新插入。此前已有文献描述了组装完成的灌注系统与成像谱仪的示意图布局8。
  2. 连接探头本体
    1. 连接来自梯度冷却器的进水和出水管路。
    2. 启动梯度冷却器的泵，并确认水温设定（19 °C）。
    3. 使用软管夹将空气冷却装置的气管连接至探头本体。
    4. 将空气冷却装置上的流量旋钮调至 "1" 位置。
    5. 将热电偶导线连接至探头本体。
    6. 将前置放大器的同轴电缆连接至探头本体质子（H）通道的射频（RF）输入/输出端口。
    7. 将梯度放大器的电源线连接至探头本体。
    8. 在射频机柜内，开启B0补偿单元、三个梯度放大器（x、y、z）以及主控单元的电源。
  3. 准备谱仪
    1. 使用控制台上的变温调节模块设定目标孔径温度。
    2. 通过调节探头内部的可变电容器，对射频电路进行匹配（阻抗）和调谐（频率）。此操作通过操控探头本体底部的调节杆完成。
    3. 调节谱仪匀场线圈的电流设置，以最大化样品位置处的磁场均匀性。
  4. 开始图像采集
    1. 采集定位像以确定样品在磁体孔径内的空间位置。二维梯度回波的典型参数如下（TR/TE = 100/4 ms，平均次数 = 1，脉冲角度 = 30o，时间 = 6 秒，矩阵 = 64 × 64，视野 = 0.3 × 0.3 cm，分辨率 = 47 × 47 μm）。
    2. 采集扩散加权定位像，以确认扫描几何参数和组织位置（如适用）。二维扩散加权定位扫描的典型参数如下（TR/TE = 2000/11.6 ms，时间 = 4.3 分钟，Δ = 6 ms，δ = 1 ms，平均次数 = 1，b = 1200（有效值 1860）s/mm2，矩阵 = 64 × 64，视野 = 0.2 × 0.2 cm，分辨率 = 31 μm）。
    3. 采集扩散加权时间序列图像，以评估急性脑片制备的稳定性特征。二维扩散加权图像的典型参数如下（TR/TE = 2000/11.6 ms，时间 = 1.5 小时，Δ = 6 ms，δ = 1 ms，平均次数 = 42，b = 1200 s/mm2，矩阵 = 64 × 64，视野 = 0.2 × 0.2 cm，分辨率 = 31 μm）。注意：在特定系统中表征稳定性的方法可能因多种因素而异，包括所使用的磁共振对比机制（如T1、T2、扩散、磁敏感性）、所研究的物理扰动类型，以及由该扰动引起的单位时间内磁共振信号变化。

结果

灌注液制备

成功使用腔内氧合装置后，所供给的碳合气中的气体将在aCSF灌流液中达到100%的饱和状态。可通过改变供给气体的氧浓度，并使用氧含量测定仪测量灌流室中aCSF灌流液内溶解氧含量的变化来验证这一点（图1）8。根据亨利定律，在温度保持恒定的条件下，溶解于液体样品中并与其达到平衡的气体量与该气体的分压成正比12。利用这一原理及精确的气体标准品，可对aCSF样品中溶解氧的含量进行定量分析。具体方法是：使用已知气体成分（一种为高氧浓度气体，如碳合气（95% O2），另一种为低氧浓度气体，如氮气（0% O2））持续鼓泡（直接鼓泡1小时或更长时间）使aCSF溶液达到饱和，以此校准氧含量测定仪。随后，将氧电极探头浸入样品中进行测量。通过测量灌流井的流出液，可确认腔内氧合器是否正常工作。氧含量测定仪测得的溶解氧百分比应与供气中输送的氧气浓度百分比一致。若测得数值低于供气中的氧浓度，则提示可能存在硬件故障，进而导致脑片组织的代谢不足。

样品外观与行为

急性脑片制备后，若灌注条件足以提供必要的代谢物并清除代谢废物，则脑片会很快达到一种相对稳定的状态。在此基础上，可对急性脑片施加外界干预，并测量其对这些变化的反应，以用于科学研究。在磁共振（MR）实验中，随时间追踪目标信号是常用于评估急性脑片制备稳定性的方法13。扩散加权信号对组织中水分子的流动性、含量及分布变化尤为敏感，这一点可通过该对比机制在缺血性脑卒中梗死灶检测中的应用得以体现14,15。在不同灌注条件下维持的急性皮层脑片中，绘制归一化的扩散信号随时间的变化曲线，显示在组织分离完成后具有相对稳定性（15.5 小时内波动为 2 ± 3%）（图 5）。无论灌注方式（间歇性或连续性）或磁共振成像扫描时长（短时 [4 min] 或长时 [1.5 h]）如何，扩散信号的稳定性均得以维持8。若脑片未表现出随时间的信号稳定性，例如未接受灌注的活体皮层中观察到的扩散信号急剧上升，则提示实验条件未达理想状态。在确认脑片制备的信号稳定之前，不应进行扰动实验。

除了信号稳定性外，在采集图像时还必须确认样品位置的正确性。尽管在体视显微镜下放置组织时已对样品位置进行了控制，但在灌注装置组装过程中，或在将线圈或探头插入磁体前受到粗暴操作时，样品位置仍可能发生偏移。可通过采集短时间（2 分钟）的扩散加权预扫描图像来确认海马结构是否正确放置（图 6）。由于锥体细胞层对扩散加权的敏感性高于相邻的海马分层，因此该结构在扩散加权图像中呈现为较暗的条带。若实验设置中未显示此特征性条带，则表明样品偏离中心，可能需要重新实验。

不同aCSF氧合条件下溶解氧百分比的柱状图比较。
图1：灌注液aCSF中溶解氧含量随供气中O2百分比的变化关系。 使用含不同氧浓度（95%、60% 和 19%）的碳合气体混合物作为供气源。随后从灌注槽中获取溶解氧百分比读数，并与两个已知对照进行比较：一个为直接用碳合气体（95% O2）通气的灌注液储液器，另一个为暴露于大气条件（23% O2）下的灌注液储液器。在每种情况下，组织灌注部位的氧饱和度百分比均接近所用碳合气体混合物中O2浓度的100%。误差线表示样本均值的标准差。本图经原始文献8许可转载。 请点击此处查看该图的放大版本。

灌流室示意图，显示用于生物研究设置的 aCSF 和碳合气体供应。
图2：内置式氧合器与灌流室的示意图。 该图展示了实现这些关键装置功能的详细设计结构。经泵送并通过去泡装置的新鲜灌流液，从一根10 mm核磁共振（NMR）管顶部进入氧合器。随后，灌流液流入一段高度透气的硅胶管（蓝色部分），该硅胶管缠绕在嵌套于内部的开放式5 mm NMR管外周。碳合气体通过5 mm NMR管顶部输入，从其底部开口进入腔室，并流经缠绕的硅胶管表面，随后从10 mm NMR管帽上的排气孔排出氧合器。在此过程中，流经硅胶管的灌流液被所供混合气体的化学组分充分饱和。离开氧合器后，灌流液直接进入灌流室，随后流入通向废液收集储液器的回流管路。该设计中的其他关键组件包括乙缩醛材质的支撑销钉，用于使氧合器垂直固定在经改造的射频微线圈顶部；硅胶垫圈（红色环状结构），用于在氧合器的灌流室与微线圈的组织孔之间形成液体密封；以及扎带卡槽，用于固定扎带以实现可逆密封。本图经原论文8许可修改并重印。 请点击此处查看此图的放大版本。

核磁共振探头组件示意图；前视图、后视图、顶视图；对核磁共振至关重要。
图3：微线圈组件的改进，使其能够与腔内氧合器连接。 在组件侧面加工出两个尺寸为3.0 mm × 1.5 mm的凹槽（黑色箭头），用于容纳扎带宽度，以密封灌注腔。一条通道（15 mm × 3 mm × 4 mm）贯穿线圈后表面，连接这两个凹槽。通道两侧放置两个尼龙垫片（红色箭头），用以卡住扎带头部，便于密封操作。在线圈组件顶部钻有一个孔（2 mm × 14 mm）（黄色箭头），用于连接聚甲醛支撑销，固定氧合器。本图经原文章授权修改并重印8。 请点击此处查看此图的放大版本。

色谱系统示意图；用于流体分离的管路组件。
图4：展示微线圈、氧合器和探针组件相对位置及正确组装方式的照片拼图。这些图像展示了内置式氧合器和微灌注装置的关键硬件组件，并说明了各独立部件之间的连接方式。（A） 爆炸视图照片，显示在密封组织腔室或组装探针本体之前所有组件的相对位置。已尽可能准确地呈现各部件的相对位置；然而，在本系列图像中，部分灌注管路被折叠回绕，以便所有组件均能容纳于图像范围内。（1 = 探针头部，2 = 微线圈组件，3 = 尼龙组织固定环，4 = 灌注腔室，5 = 扎带，6 = 内置式氧合器，7 = 梯度线圈，8 = 气泡捕获器）。（B） 完成线圈与氧合器组装后的组件。在此图像中，尼龙固定环已置于微线圈的组织腔室内，用于固定样品。氧合器底部的乙缩醛支撑销已插入微线圈顶部对应的孔中。灌注腔室开口端的硅胶垫圈已覆盖在组织腔室上方，并用扎带收紧以密封灌注腔。最后，微线圈底部已连接至探针头部顶部。（C） 完成探针组装后的组件。在最后一张图中，扎带的多余部分已被齐平剪除。随后，通过小心地将圆筒推向探针，同时使多余的灌注管路、氧合器和微线圈穿过梯度线圈组的中空中心，将梯度线圈组滑入到位。一旦梯度线圈连接至探针头部，即可通过将探针上的锁紧环旋紧在梯度线圈的螺纹基座上来固定其位置。请点击此处查看此图的放大版本。

标准化DWI信号图，灌注与非灌注皮层，时间依赖性扩散分析。
图5：在持续灌流的急性皮层脑片中扩散信号的稳定性。（A） 对四块急性脑片在不同灌流模式下进行长达21.5小时（自安乐死后起计）的时间序列记录，绘制其标准化扩散信号值。无论灌流是连续还是间歇进行，且不论磁共振扫描时长（1.5小时或4分钟），脑片的扩散信号在安乐死后15.5小时内均保持在其初始测量值的±5%范围内。来自甲醛固定皮层的信号记录作为阳性对照（n = 1），因其组织样本处于静态且无变化，可反映信号稳定性。相反，未接受灌流支持的活体脑片（n = 1）则作为代谢缺乏的对照。不同灌流实验的参数如下：连续灌流（灌流始终开启，每次扫描耗时1.5小时）、间歇灌流（扫描间歇期间灌流开启10分钟，每次扫描耗时1.5小时）、长间歇长扫描（扫描过程中灌流开启，但扫描之间暂停10分钟，每次扫描耗时1.5小时）、长间歇短扫描（扫描间歇期间灌流开启1.5小时，每次扫描耗时4分钟）。（B） 对A图中四种活体脑片灌流实验的分析数据，显示各组平均值。合并后的灌流皮层脑片组其扩散信号随时间变化极小（15.5小时内为2 ± 3%），而非灌流对照组（n = 1）在实验早期即表现出显著的信号不稳定性（6.5小时时达15%）。本图经修改并获原文章许可后重印8。请点击此处查看该图的放大版本。

在500µm尺度下显示细胞显微结构细节的显微图像，用于生物学研究。
图6：初步成像过程中海马脑片位置的确认。 在进行长时间的磁共振显微成像前，正确放置样本至关重要，以确保不浪费扫描机使用时间及昂贵的灌注液添加剂等资源。海马CA1区的锥体细胞层可在较快（4.3分钟）、较低分辨率（平面内31 μm × 31 μm）的初步扫描中被观察到，以确认感兴趣组织相对于微线圈的正确位置。两幅图像共用的扫描参数如下：TR/TE = 2000/11.6 ms，Δ = 6 ms，δ = 1 ms，平均次数 = 1。（A） b = 0（有效值227）s/mm2。在此初步扫描中，锥体细胞层仅表现为一条灰色的斜向条带，位于线圈激发区域的中心，勉强可见。（B） b = 1,200（有效值1,860）s/mm2。在更高的扩散加权下，层间对比度增强，锥体细胞层较相邻层（上方：始层，stratum oriens；下方：辐射层，stratum radiatum）变得更暗。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了在进行磁共振显微成像时，急性脑片制备物所需的标准代谢维持步骤。该方法是目前唯一能够以可分辨细胞水平的分辨率对活体哺乳动物组织进行磁共振成像的技术。尽管所描述的灌注液条件是针对中枢神经系统组织优化设计的，但通过调整灌注液成分、气体组成、灌注流速和温度，该方案可广泛适用于各种活体组织制备物。

在所述操作过程中可能遇到的最常见问题通常与代谢物供应失败有关。当气体供应不足导致碳酸氢盐缓冲系统失效时，可能会在aCSF中出现钙盐沉淀。此类沉淀物可堵塞灌注管路，并导致严重的设备损坏。若在探针组装完成后观察到灌注液中出现盐类沉淀，应立即关闭蠕动泵以停止灌注。确认灌注液中含有足够的碳酸氢钠（4.37 g / 2 L）、CO2 供气中的氧浓度（5.0%）以及向储液罐和氧合器通入碳合气体（1/16 L/min）。最后，确认pH值已稳定在生理范围（7.3 - 7.4）内。若氧气浓度和pH值仍无法正常调节，应更换气体交换膜。

如果脑片在预期的实验时间过程中未表现出信号稳定性，请确认人工脑脊液（aCSF）混合物中含有正确的化学成分，并维持正确的渗透压（300 mOsm）和pH值（7.3 - 7.4）。同时，确保以1/16 L/min的流速向灌流液储液器和氧合器供应碳合气（carbogen）。如果上述步骤未能纠正灌流液条件，建议更换气体交换膜。如果在排查并优化灌流液条件后仍无法实现组织稳定性，应考虑改进手术方案，重点在于尽量缩短组织取材与开始灌流之间的时间间隔。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，1R21NS094061-01A1、NIH 1R01EB012874-01、S10RR031637）以及美国国家科学基金会（国家高磁场实验室（NHMFL）先进磁共振成像与光谱（AMRIS）设施在佛罗里达大学的协作协议编号 DMR-1157490）和佛罗里达州政府的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>灌注液制备
Osmette APrecision Systems 公司5002冰点降低渗透压计
1000型搅拌器Barnstead/ThermodyneSPA1025B带加热元件的磁力搅拌器
Accumet Basic pH计Fisher ScientificAB15pH计
pH探针Fisher Scientific13-620-AP61用于pH测量的探针
氧气计Microelectrodes Inc.OM-4用于采样气体氧含量或液体灌注液中溶解氧含量的测量仪
氧电极Microelectrodes Inc.MI-730氧微探针
量程丹佛仪器公司A-160用于称量化学组分的微量天平
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>组织切片制备
Lancer 振动切片机Ted Pella 公司系列 1000振动组织切片机
体视显微镜卡尔·蔡司公司OPMI 1-FC台式双目解剖显微镜
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>灌注系统
Masterflex L/SCole-Parmer7523-50蠕动式微灌注泵
氧气调节器 × 2Victor MedicalVMG-05LY调节气体流量的装置
微型碳合气体气瓶 × 2Airgas含有碳合气体的气罐
内置氧合器自主研发负责调节灌注液pH和氧气的装置
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>磁共振成像硬件
微型表面线圈（直径200毫米，经改装）Bruker BiospinB6371/0001四匝微型（200毫米直径）表面射频线圈
Micro 5 探针主体Bruker BiospinZ3395用于600 MHz波谱仪的微成像探头
微型5梯度线圈布鲁克生物自旋M81111与 micro 5 探头主体配合使用的梯度线圈组
600 MHz 波谱仪Oxford Instruments用于磁共振成像生成的超导磁体（14.1 T）
成像控制台布鲁克生物自旋Avance III支持与控制硬件，包括梯度放大器、前置放大器 &用于生成磁共振图像的工作站
空气吹风机Bruker BiospinBCU-II, -80/60与探头加热线圈配合使用的空气冷却装置，用于调节磁体孔腔内的温度
梯度冷却器赛默飞世尔科技Neslab Merlin M33用于散去梯度线圈产生热量的水冷机

参考文献

  1. Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
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磁共振显微成像采集过程中对离体活体脑组织的代谢支持
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