我们描述了一种用于测量单核细胞穿过人内皮单层并进一步成熟为泡沫细胞的跨内皮迁移实验方案。该方法可灵活评估来自不同疾病状态个体的单核细胞的致动脉粥样硬化特性，并可用于评价血液中可能增强这种倾向的各类因素。
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摘要
摘要
冠状动脉疾病（CAD）是全球发病率和死亡率的主要原因。动脉粥样硬化是导致CAD的主要病因，其起始过程为固有免疫单核细胞迁移至富含脂质的沉积部位（称为脂质条纹），这些脂质条纹存在于中等至大动脉的动脉壁内。在动脉粥样硬化的早期阶段，病变的关键致病特征是迁移至动脉内的单核细胞成熟为泡沫细胞或脂质负荷的巨噬细胞。大量证据支持以下假说：类风湿关节炎和HIV等疾病伴随的慢性炎症状态以及普遍的衰老过程会增加动脉粥样硬化的风险，而这种风险可通过单核细胞的活化来预测。尽管小鼠模型为研究单核细胞在动脉粥样硬化发生中的作用提供了良好的平台 体内，它们需要对天然胆固醇代谢进行基因改造，并大幅改变小鼠的正常饮食，因此在研究人类共病疾病对动脉粥样硬化影响方面的适用性有限。这促使我们开发一种人类 体外 用于评估来自特定疾病状态个体的单核细胞致动脉粥样硬化潜能的模型。目前，人类 体外 模型的局限性在于其仅孤立地评估单核细胞的跨内皮迁移和泡沫细胞形成。本文描述了一种实验方案，该方案中从患者血液中分离的单核细胞穿过人源内皮细胞层进入Ⅰ型胶原基质，并检测其在有或无外源性脂质存在条件下向泡沫细胞分化的倾向性。该方案已验证可用于从HIV感染者及老年非HIV感染者中纯化的单核细胞。此模型具有良好的可变性，既可通过显微镜观察也可通过流式细胞术来评估单核细胞的跨内皮迁移和泡沫细胞形成，同时还能检测血清或血浆中存在的促动脉粥样硬化因子。
引言
单核细胞跨内皮迁移是动脉粥样硬化斑块形成过程中的关键步骤，可能导致血栓、中风和心肌梗死。动脉粥样硬化斑块起源于脂质条纹，通常出现在中等至大动脉中血流缓慢且呈振荡性的部位。在这些部位，沉积的脂质可导致内皮细胞活化并引发局部炎症1。单核细胞通过单核细胞趋化蛋白（如CCL2）被募集至脂质条纹处的内皮细胞，并迁移至内膜层2。迁移完成后，单核细胞可通过摄取脂质、合成脂质、胆固醇外排下调，或上述因素的联合作用，转变为具有致动脉粥样硬化特性的富含脂质的巨噬细胞，即泡沫细胞。此外，单核细胞也可能在血液循环中积累脂质，呈现“泡沫样”表型，这可能使其更易转化为泡沫细胞3,4。泡沫细胞是脂质条纹和早期动脉粥样硬化斑块的典型特征，其形成受到脂质和炎症介质的共同影响5。此外，单核细胞还具有从动脉壁反向迁移回血液循环的能力6，从而将脂质从内膜层清除，有助于维持动脉的健康状态。
确定单核细胞向动脉内皮迁移并在内膜中形成泡沫细胞的倾向，或反向迁移并将脂质从斑块中运出的能力，是理解单核细胞活化在增加动脉粥样硬化风险中作用的关键要求。动脉粥样硬化等冠状动脉疾病（CAD）的小鼠模型对于阐明脂肪条纹/动脉粥样硬....
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方案
注意：所有使用人类生物样本的实验均经墨尔本阿尔弗雷德医院人类伦理委员会批准。除非另有说明，所有实验均在II级生物安全柜中进行。“预热”指试剂在水浴中加热至37 °C。
1. I型纤维状胶原凝胶的制备：第1天
- 按照表1所示，依次向5 mL聚苯乙烯管中加入并混合35.7 mM NaOH、0.71 × M199、4.58 mM乙酸和1.71 mg/mL I型纤维状胶原，制备聚合胶原凝胶。
注意：为防止胶原在凝胶混合物中形成“团块”，需用移液器轻柔地上下吹打5次，确保胶原充分混匀。显微镜检测每种实验条件需准备4–6个凝胶，流式细胞术每种实验条件需准备15个凝胶。 - 混合均匀后，将50 µL胶原凝胶混合物分装至无菌平底96孔组织培养板的每个孔中。不要使用最外侧的行和列，而是在这些孔中加入200 µL的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS），以防止凝胶干燥。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育2小时，使胶原聚合。
注意：将培养板直接放置在培养箱内洁净的金属架上，以确保受热均匀。 - 孵育完成后，在凝胶上覆盖150 µL的1×添加补充剂的M199培养基（见材料表），并在使用前继续孵育5天。
2. 冻存 HUVEC 的复苏与扩增：第 1 天
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结果
单核细胞迁移的定量分析
单核细胞按图1所述加入模型中，每种条件准备6个凝胶。每个供体用于6个凝胶的单核细胞（i.e.，每个凝胶5.0 × 104个单核细胞 × 6个凝胶 = 每个供体3.0 × 105个单核细胞）重悬于600 µL含指定血清/分离脂质的M199培养基中，终体积为600 µL。随后将细胞（i.e.，每凝胶100 µL = 5.0 × 104个单核细胞）分装至凝胶上，并按前述条件孵育1小时，以促进单核细胞跨膜迁移。跨膜迁移后，按前述方法计数未迁移的细胞。本示例中，回收到1.5 × 104个未迁移细胞。前向迁移百分比通过步骤5.4中所述公式计算：
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讨论
本文所述方案结合单核细胞跨内皮迁移和泡沫细胞形成，提供了一种多功能且具有生理相关性的方法，用于评估来自人类临床队列的单核细胞致动脉粥样硬化能力。与传统的泡沫细胞形成方法相比，该模型具有优势，因为它不仅考虑了单核细胞跨内皮迁移对泡沫细胞形成的影响，还可测量逆向迁移过程6，同时评估单核细胞在存在或不存在外源性因素条件下分化为泡沫细胞的固有倾向。此外，本模型还考虑了内皮细胞活化的作用，因为我们已证明内皮细胞活化可上调与泡沫细胞形成相关的脂质物种的氧化14。最后，经历外排（与斑块消退相关的特性）的单核细胞表型可通过显微镜和流式细胞术进行定量和表征。
由于细胞向凝胶内三维迁移的特性，细胞在凝胶中迁移至不同深度，导致识别和判定迁移后的细胞为泡沫细胞或巨噬细胞较为困难19为辅助鉴定泡沫细胞，必须始终使用新鲜的油红O染液。还需注意，不同 离体 疾病状态或 体外 条件可能会改变单核细胞在凝胶中的跨膜迁移行为。我们采用活细胞.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者衷心感谢 William Muller 教授和 Clare Westhorpe 博士在本模型早期版本开发过程中所发挥的关键作用。作者还要感谢 AMREP 流式细胞术核心实验室对单核细胞亚群的分选工作，以及阿尔弗雷德医院传染病科临床研究护士在部分研究中对 HIV 阳性个体的招募工作。作者衷心感谢伯内特研究所获得的维多利亚州运营基础设施支持计划对本工作的贡献。TAA 由 RMIT 大学副校长博士后奖学金资助。本研究由 NHMRC 项目资助 1108792（资助对象为 AJ 和 AH）支持。TK 由 NIH 资助项目 NIH K08AI08272 和 NIH/NCATS 资助项目 #UL1TR000124 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 凝胶制备试剂 | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH 溶于 H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM 乙酸溶于 H20 |
| Cultrex 牛 I 型胶原蛋白 | R&D Systems | 3442-050-01 | I 型纤维状胶原蛋白 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 细胞培养 | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | 含 Earle 盐、L-谷氨酰胺和 2.2 g/L 碳酸氢钠的 M199 培养基。 培养基中补充 100 µg/mL L-谷氨酰胺 和 100 U/mL 青霉素/链霉素 |
| M20 | 补充了 20% 热灭活混合或供体血清的 M199 培养基。 可向 M199 中添加 LDL 等单个脂质成分。 | ||
| HUVEC | 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）可从经知情同意和伦理批准捐赠的脐带中分离获得。分离后的 HUVEC 也可商业购买。 | ||
| 人冠状动脉内皮细胞 | 人冠状动脉内皮细胞可从经知情同意和伦理批准捐赠的动脉中分离获得。分离后的细胞也可商业购买。 | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | 乙二胺四乙酸（EDTA）— 0.5 M，pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | 乙二醇双（β-氨基乙基醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）— 1 mM，pH 8.0 |
| 0.05% 胰蛋白酶 EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% 胰蛋白酶/0.53 EDTA（1X） |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-081 | L-谷氨酰胺（200 mM） |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 青霉素和 10,000 µg/mL 链霉素） |
| 新生牛血清 | Gibco | 16010-142 | 新生牛血清：新西兰来源 |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | 纤连蛋白 — 制备并储存为 50 µg/mL 分装液 |
| PBS（1x） | Gibco | 14200-075 | 杜氏磷酸盐缓冲液（10x）：用无菌 H20 稀释至 1x |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | 重组人 TNF — 溶于 H20 并储存为 10 µg/mL 分装液 |
| 低密度脂蛋白 | Merck Millipore | LP2-2MG | 低密度脂蛋白（LDL） |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 显微镜 | |||
| 1% 或 2% 甲醛 | Polysciences | 4018 | 1% 或 2% 甲醛用无菌 H20 稀释 |
| 50% 和 78% 甲醇 | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% 或 78% v/v 甲醇，用 H20 稀释 |
| 油红 O 染色液 | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 用 22% 1M NaOH 和 78%（v/v）甲醇稀释至 2 mg/mL |
| 显微镜载玻片 | Mikro-Glass | S41104AMK | 双面磨砂 45 度斜边载玻片（25 × 76 mm） |
| 盖玻片 | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 × 40 mm #1.5 规格玻璃盖玻片 |
| 双面胶带 | 3M Scotch | 4011 | 高强度外用安装胶带（25.4 mm × 1.51 m） |
| 吉姆萨染色液 | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 吉姆萨伊红亚甲蓝溶液（将原液用 H20 稀释 1:10） |
| 打孔器 | 手持式单孔打孔器（6.35 mm 打孔直径） | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 流式细胞术 | |||
| 胶原酶 D | Roche Diagnostics | 11088858001 | 胶原酶 D 用 M199 培养基稀释至 1 mg/mL |
| 35 µm 尼龙网帽聚苯乙烯 FACS 管 | BD Biosciences | 352235 | 35 µm 尼龙网帽聚苯乙烯 FACS 管 |
| 活/死可固定黄色死细胞染料 | Life Technologies | L34959 | 活/死可固定黄色死细胞染料 |
| FACS 洗涤液 | 将 1 × PBS-、2 mM EDTA 和 1% 新生牛血清混合配制 | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 塑料器皿 | |||
| 96 孔板 | Nunclon | 167008 | Delta 表面平底 96 孔板 |
| 10 cm 培养皿 | TPP | 93100 | 无菌 10 cm 培养皿 |
| 1.5 mL Eppendorf 管 | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf 管 |
| 移液管 | Samco Scientific | 222-20S | 无菌移液管（1 mL，大球泡） |
参考文献
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重印与许可
