慢性炎症状态个体的单核细胞轮回和泡沫形成的定量研究

Summary

我们描述了一项协议, 以测量单核细胞在人的内皮单分子膜的轮回, 并随后成熟成泡沫电池。这提供了一种通用的方法来评估的动脉粥样硬化性质的人单核细胞分离的不同疾病的情况下, 并评估血液中的因素, 可能会提高这种倾向。

Abstract

冠状动脉疾病 (CAD) 是全球发病率和死亡率的主要原因。动脉粥样硬化是 CAD 的一个主要原因, 它是由先天免疫单核细胞的轮回所引发的, 它被称为脂肪条纹的脂质的炎症部位, 它们存在于中到大动脉的动脉壁上。动脉粥样硬化早期病变的主要致病特征是单核细胞的成熟, 它会迁移到动脉形成泡沫或脂质巨噬细胞。大量的证据支持这样的假说: 动脉粥样硬化的风险是由慢性炎症性疾病, 如类风湿关节炎和 HIV, 以及一般的老化, 以及这种风险是由单核细胞预测激活.尽管鼠标模型提供了一个很好的平台来研究单核细胞在动脉粥样硬化体内的作用, 但它们需要对天然胆固醇代谢进行基因改变和对正常小鼠饮食的剧烈改变, 并且对人类共疾病的动脉粥样硬化影响研究。这促使我们开发了一个人的体外模型, 以测量孤立于定义疾病状态的个体的单核细胞的动脉粥样硬化潜能。目前, 人类的体外模型是限制的, 他们评估单核细胞的轮回和泡沫形成的孤立。在这里, 我们描述了一个协议, 其中单核细胞从病人的血液刺字跨人的内皮细胞膜到1型胶原基质, 他们的倾向成熟成泡沫细胞存在或没有外源性脂质测量。该议定书已得到验证, 用于使用从艾滋病毒感染者和老年艾滋病毒感染者身上纯化的人单核细胞。这个模型是多才多艺的, 并且允许单核细胞的移居和泡沫形成被评估使用显微镜或流式细胞仪并且允许评估动脉粥样硬化因素存在于血清或血浆。

Introduction

单核细胞轮回是动脉粥样硬化斑块发展的关键一步, 可能导致血栓、中风和心肌梗塞。动脉粥样硬化斑块发育的脂肪条纹, 一般目前在低振荡血流在中到大的动脉, 在那里沉积脂质有助于内皮细胞活化和局部炎症¹。单核细胞通过单核趋蛋白 (如 CCL2) 和刺字进入内膜², 被吸收到脂肪条纹中的内皮。在轮回之后, 单核细胞可能形成动脉粥样硬化的、脂质的巨噬细胞, 称为脂质的摄取、脂质合成、胆固醇外流调节或上述因素的综合作用的结果。单核细胞也可以在循环中积聚脂质, 并有一个泡沫状的表型, 可能是发泡细胞形成的诱因^3,4。泡沫细胞是脂肪条纹和早期动脉粥样硬化斑块的决定性特征, 其形成受脂质和炎症介质的影响⁵。另外, 单核细胞有能力逆转刺字从动脉进入血流⁶, 从而消除脂质从内膜和行动, 以保持健康的动脉。

确定单核细胞在动脉内皮刺字的倾向, 在内膜内形成泡沫细胞, 或逆转刺字并携带脂质, 是了解细胞活化在增加动脉粥样硬化风险。小鼠模型的 cad, 如动脉粥样硬化是重要的阐明 real-time在体内信息的脂肪条纹/动脉粥样硬化斑块的发展。然而, 这些模型需要基因改变这些动物的自....

Protocol

注意: 所有使用人体生物样本的实验都是在墨尔本的阿尔弗雷德医院人类伦理委员会的伦理批准下进行的。所有实验均在第二类生物安全柜中进行, 除非指定。#34;P rewarmed 和 #34; 指在水中加热到37和 #176 的试剂; C.

1. i 型纤维状胶原凝胶的制备: 1 天

1. 通过依次添加和混合35.7 毫米氢氧化钠、0.71 x M199、4.58 mm 乙酸和1.71 毫克/毫升 i 型纤维胶原制成5毫升聚苯乙烯制备聚合胶原凝胶管按 表 1 .
   注意: 为了阻止胶原蛋白和 #39;p ockets 和 #39 的形成, 在凝胶混合物中, 确保胶原蛋白混合, 并轻轻移5倍。每测试条件为4-6 凝胶显微镜或15凝胶每测试条件流式细胞仪.
2. 一次好的混合, 分50和 #181; 胶原凝胶混合物, 每一个不育的 flat-bottomed 96-良好的组织培养板。不要使用外部行和列, 但用200和 #181 填充这些数据; 1x Dubecco 和 #39 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 以保护凝胶免受干燥。在37和 #176 孵育板; C/5%co ₂ 用于2小时, 以允许胶原蛋白聚合.
   注意: 将板材直接放在孵化箱的清洁金属架上, 以确保均匀的热量分配.
3. 以下孵育, 用150和 #181 覆盖凝胶; L 1x 补充....

Results

量化单核细胞轮回

单核细胞被添加到模型中, 如图 1所述, 每个条件都准备了六凝胶。单核细胞为6凝胶每个施主 (即, 5.0 x 10⁴单核细胞每凝胶6凝胶 = 3.0 x 10⁵单核细胞每个施主) 是悬浮到最后的容量600µL 的 M199 媒体含有所需的血清/分离脂质。细胞 (i. e, 100 µL 每凝胶 = 5.0 x 10⁴单核) 然后 aliquoted 到凝胶和孵育为 1 h, 以方便单核轮回。在轮回之后, non-transmigrated 细胞被计算为以上。在此示例中, 恢复了 1.5 x 10⁴ non-transmigrated 单元格。使用步骤5.4 中描述的公式确定了向前轮回的百分比:

Discussion

这里描述的协议提供了一个多才多艺的和生理学相关的方法来评估的 atherogenicity 单核细胞从人的临床组, 结合单核的轮回和泡沫形成。这种模式提供了比其他泡沫细胞形成的方法的优势, 因为它考虑到单核细胞的轮回对泡沫形成的影响, 并允许测量反向轮回⁶除了固有的在外源性因素存在或缺乏的情况下, 单核细胞倾向于成熟成泡沫。此外, 内皮活化的作用也被考虑到, 因为我们已经表明, 内皮细胞活化上调氧化的脂类与泡沫电池形成¹⁴。最后, 通过显微镜和流式细胞仪可以量化和表征单核的表型 (与斑块回归相关的特性)。

由于三维性质的轮回到凝胶, 识别和评分轮回细胞作为泡沫细胞或巨噬细胞可能是困难的单元格刺字到不同的水平在凝胶¹⁹。为了帮助识别泡沫细胞, 必须始终使用新鲜油红色 O 染色。另外还要注意的是, 不同的体内疾病状态或体外条件可能会改变单核细胞在凝胶中的轮回。我们使用活细胞成像技术来确定从 HIV 感染的个体.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
凝胶制备试剂
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0.1 M NaOH 在 H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM 乙酸稀释20
Cultrex 牛胶原蛋白中稀释I	研发&D Systems	3442-050-01	I 型纤维胶原蛋白
名称	公司	目录号	评论
细胞培养
M199	Life Technologies	11150-059	含有厄尔盐、L-谷氨酰胺和 2.2 g/L 碳酸氢钠的 M199 培养基。 培养基中补充有 100 &微量;g/mL L-谷氨酰胺 和 100 U/mL 青霉素/链霉素
M20			补充 M199，含有 20% 热灭活混合血清或供体血清。 可以将 LDL 等单个脂质种类添加到 M199 中。
HUVEC			原代人脐带内皮细胞 （HUVEC） 可以从知情同意和伦理批准的情况下捐献的脐带中分离出来。离体 HUVEC 也可以商业购买。
人冠状动脉内皮细胞			原代人冠状动脉内皮细胞可以从知情同意和伦理批准的情况下从捐献的动脉中分离出来。分离的细胞也可以商业购买。
EDTA	BDH Merck	10093.5V	乙二胺四乙酸 （EDTA） - 0.5 M，pH 值 8.0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	乙二醇-双（&β;-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸 （EGTA） - 1 mM，pH 值 8.0
0.05% 胰蛋白酶 EDTA	Gibco	25300-054	0.05% 胰蛋白酶/0.53 EDTA （1X）
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081	L-谷氨酰胺 （200 mM）
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122	青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 青霉素和 10,000 &微量;g/mL 链霉素）
新生小牛血清	Gibco	16010-142	新生小牛血清：新西兰原产
地 纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	纤连蛋白 - 50 & 微量;制备并储存 g/mL 等分试样
PBS （1x）	Gibco	14200-075	Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （10x）：用无菌 H20
0.1% TNF		PHC3015	重组人 TNF - 在 H20 中复溶并储存在 10 &微量中;g/mL 等分试样
低密度脂蛋白	Merck Millipore	LP2-2MG	低密度脂蛋白 （LDL）
名称	公司	目录号	评论
显微镜
1 或 2% 甲醛	Polysciences	4018	1% 或 2% 甲醛，用无菌 H20
50% 和 78% 甲醇	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% 或 78% v/v 甲醇，用 H20
油红 O 染料	Sigma-Aldrich	O0625-25G	在 22% 1M NaOH 和 78% （v/v） 甲醇显微镜
载玻片	Mikro-Glass	S41104AMK	中稀释至 2 mg/mL双磨砂 45 度地面边缘显微镜载玻片 （25 X 76 mm）
盖玻片	Menzel-Glä系列		MENCS224015GP 22 x 40 毫米 #1.5 尺寸玻璃盖玻片
双面胶带	3M Scotch	4011	超强度外部安装胶带（25.4 毫米 x 1.51 米）
吉姆萨染色	默克米利波	1.09204.0500	吉姆萨的碧蓝伊红亚甲基蓝溶液（稀释原液 1：10 in H20）
孔			手持式单孔打孔器（6.35 毫米冲头）
名称	公司	目录号	评论
流式细胞术
胶原酶 D	氏诊断	11088858001	M199 培养基中稀释至 1 mg/mL的胶原酶 D
35 µm 尼龙网帽聚苯乙烯 FACS 管	BD Biosciences	352235	35 µm 尼龙网帽聚苯乙烯 FACS 管
活/死可固定黄色死细胞染色	Life Technologies	L34959	活/死可固定黄色死细胞染色剂
FACS 洗涤			混合 1 X PBS-、2 mM EDTA 和 1% 新生小牛血清
制备名称	公司	目录号	评论
塑料器皿
96 孔板	Nunclon	167008	Delta 表面平底 96 孔板
10 cm 培养皿	TPP	93100	无菌 10 cm 培养皿
1.5 mL Eppendorf 管	Eppendorf	0030 125.150	Eppendorf 管
转移移液器	Samco Scientific	222-20S	无菌移液管（1 mL，大吸球）