利用多电极阵列评估内分泌干扰物对脊椎动物神经网络功能发育的影响

摘要

暴露于环境毒素可能对发育中的胚胎产生急性影响。双酚类等内分泌干扰化学物质已被证实对神经系统具有不利影响。本文介绍了一种利用 体外 用于研究毒素暴露对早期胚胎功能影响的脊椎动物（鸡胚）神经网络模型

摘要

双酚类化合物（如双酚A（BPA）和双酚S（BPS））是广泛用于塑料及多种日常用品生产中的聚合剂。这类物质被归类为具有类似雌二醇特性的内分泌干扰物（EDC）。长期暴露于EDC，即使剂量较低，也与多种健康问题相关，包括癌症、行为障碍和不育，且在早期发育阶段更易受到损害。为研究BPA对神经元功能发育的影响，我们采用了一种 体外 以早期鸡胚脑组织衍生的神经网络作为模型，我们发现双酚A（BPA）暴露会影响网络活动的发育，特别是放电活动和同步性。网络活动的改变是药物或化合物分子靶点与其行为学效应之间的重要桥梁。多电极阵列正日益成为研究药物对网络活动影响的有力工具。 体外市面上有多种系统可供选择，尽管这些系统在电极数量、电极阵列的类型与质量以及分析软件方面存在差异，但其基本工作原理和所获得的数据在不同系统之间是相同的。尽管目前仅限于二维分析 体外 培养物中，这些MEA系统正在被改进以实现 体内 脑片中的神经网络活动。本文提供了胚胎期暴露及记录神经元网络活动与同步性的详细方案，并附有代表性结果。

引言

4,4′-异亚丙基二苯酚，通常称为双酚A或BPA，是一种抗氧化添加剂，广泛存在于多种以聚碳酸酯和环氧树脂为基础的产品中，如热敏纸、光盘、防碎玻璃以及饮料罐内壁涂层。尽管已知BPA是一种可模拟雌激素的内分泌干扰物质¹，关于日常偶然接触双酚A（BPA）对其产生有害影响的研究大多发表于过去10至15年间。即使低水平的BPA暴露，其后果在早期发育阶段也最为显著，包括通过母体暴露影响胚胎发生时期^2,3. 在子宫内 雌性胚胎暴露于内分泌干扰化学物也与从阴道癌到乳腺癌等多种疾病易感性的增加相关^4,5动物研究表明，接触BPA会导致大脑结构异常和功能障碍，并表现为行为异常⁶因此，包括美国食品药品监督管理局（FDA）在内的欧美大多数监管机构已禁止在婴儿奶瓶中使用双酚A（BPA）。为符合相关法规，许多制造商已转而使用4,4'-磺酰基二酚或双酚S（BPS）。由于BPA与BPS为结构类似物，且近期研究报告显示BPS具有与BPA相当的雌激素转录活性⁷因此，研究该化合物相对于BPA的毒性至关重要。

本文介绍了一种利用脊椎动物模型——鸡胚，检测双酚A（BPA）及其他内分泌干扰物（EDCs）对神经元网络影响的实验方案。体外培养的神经元可形成突触连接并产生动作电位（也称为放电）。这些培养物的放电活动可通过多电极阵列（MEA）系统进行记录。当放电事件在5毫秒内相继发生时，即被视为同步放电。初始阶段为随机放电，随后逐渐同步，这是发育中神经元网络的关键特征^8,9。同步性可通过多种方法进行测量，文献中已描述了若干相关算法^9,10,11。在我们的分析中，采用了Paiva及其同事开发的一种算法¹²，该算法已集成于驱动MEA采集系统的记录软件中。鸡胚神经元具有稳定的放电活动，为研究BPA对神经网络功能的影响提供了理想模型¹³。通过使用多电极阵列记录放电活动，我们观察到BPA暴露会抑制神经元放电同步性的发育^9,14。本文提供了在体外培养的鸡胚神经元中研究BPA暴露影响的详细方法，并展示了鸡胚神经元培养中放电同步性发育的代表性结果。

方案

以下方案已标准化，用于检测双酚A（BPA）暴露在（早期）胚胎发生期间的影响，可根据需要进行修改后使用 使用BPS、BPF或其他环境内分泌干扰物处理鸡胚神经元。

本方案遵循特拉华州立大学的机构政策以及美国国立卫生研究院（NIH）关于禽类胚胎的政策。本方案也符合特拉华州立大学的材料与化学品安全指南。

1. 材料准备

1. 将BPA（分子量228.29）溶于10%乙醇（v/v）水溶液中，配制成1 mM的储备液（即每毫升10%乙醇溶液中含0.23 mg BPA）。随后用神经基础培养基进行稀释，得到0.1 µM、0.5 µM、1 µM、5 µM和10 µM的系列浓度。
   注意：BPA为环境毒素，操作粉末时应格外小心。
2. 将鸡胚蛋置于 commercially available 的台式孵卵器中，在37 °C条件下孵育。孵育7天以获得E7期胚胎。
3. 准备MEA（微电极阵列）。在BSLII级生物安全柜中，将所需数量的MEA浸入70%乙醇中消毒3至4小时，随后用约10 mL无菌蒸馏水冲洗三次。
   注：MEA包含64个纳米多孔铂电极，呈8 × 8阵列排列。电极直径为30 µm，电极间距为200 µm。切勿使用变性乙醇对MEA进行消毒，否则会导致MEA腐蚀。
4. 将MEA放入带盖的无菌容器中（以维持无菌状态），转移至台式孵育箱中。在55 °C下烘烤至少6小时。此步骤对充分灭菌至关重要，温度不得超过60 °C。保持无菌条件下，将装有MEA的培养皿转移至BSLII级生物安全柜中存放，待后续使用。
   注：我们使用耐高温玻璃烤盘配塑料盖，并用70%乙醇对其表面消毒后，置于BSLII级生物安全柜中干燥。
5. 分装细胞外基质（ECM）溶液。将冻存管在4 °C下过夜解冻，然后分装为100 µL每份，于-20 °C保存。
   注：ECM以冷冻状态运输。在准备包被前不应将其升至室温，因为ECM在室温下会发生聚合；一旦聚合，则无法用于包被。建议使用不含生长因子的ECM，以避免未知因子带来的额外影响。
6. 用70%乙醇对所有解剖器械（Dumont #5 镊子、弯头镊、小剪刀和弹簧剪）以及表面涂有自密封材料的解剖皿进行消毒，并在解剖罩内晾干。

2. 鸡胚神经元培养与网络活性

1. 铺板当天，从 -20 °C 冰箱中取出一管细胞外基质（ECM），喷洒 70% 乙醇消毒后置于冰上。在 BSLII 生物安全柜中，加入 300 µL 冷的 Neurobasal 培养基，将 ECM 稀释至 25%。
2. 使用P200移液器将100 µL的25% ECM加至MEA中央，注意避免触碰电极，加样后立即移开，使表面形成一层薄膜。盖上MEA盖子，置于CO₂培养箱中₂ 培养箱（37 °C 和 5% CO₂）₂直至准备接种神经元时为止。
3. 用70%乙醇对一枚E7期鸡蛋（胚胎发育第7天，于37 °C培养7天）的外壳进行灭菌。将胚胎头部切下，放入含冰冷无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS，不含钙）的Sylgard底部解剖皿中。沿眼部周围剪开并取出眼球。使用Dumont #5精细镊子和弹簧剪，在腹侧做切口，去除外层皮肤以暴露前脑和视顶盖。小心剥离并移除软脑膜。将前脑转移至另一培养皿中，用弹簧剪将其切成约2 mm大小的小块。 关键词：E7期鸡蛋，胚胎发育，灭菌，Hank's平衡盐溶液，HBSS，前脑，视顶盖，软脑膜，Dumont #5镊子，弹簧剪
   注意：去除软脑膜后，前脑不应附有任何血管。如果条件允许，最好在无菌解剖罩内进行解剖操作；但即使在罩外操作，只要器械和解剖区域已用70%乙醇彻底灭菌，也能获得较为理想的结果。
4. 使用无菌移液管将前脑组织块收集到15 mL离心管中，在前脑组织块沉降至离心管底部后，尽可能吸除HBSS。
5. 加入1 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA（预热至37 °C），于37 °C孵育15分钟。
6. 使用巴斯德移液管，小心吸除胰蛋白酶，避免扰动组织块，加入1 mL神经基础培养基。待组织块沉降至底部后，吸除培养基。重复此洗涤步骤一次。此步骤旨在洗去胰蛋白酶/EDTA。
7. 加入2 mL神经基础培养基并开始吹打。吹打操作需使用无菌火焰抛光的巴斯德吸管，将组织轻轻反复吹过吸管数次，直至肉眼不可见组织块。若经多次吹打后仍有组织块残留，可静置使其沉降至管底。
   注意：研磨时避免产生泡沫——若已形成泡沫，应立即停止操作，并通过抽吸去除。
8. 将重悬的细胞用神经基础培养基按1:10稀释，使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞。取50 µL稀释后的细胞与50 µL台盼蓝溶液混合于0.5 mL离心管中。将混合液置于盖玻片下后，加入10 µL至血细胞计数板，计数明亮透明的细胞（蓝色细胞为死细胞，不应计数）。
   注意：单个E7视顶盖组织通常可获得的细胞数量在1至5 x 10之间⁷ cells/mL
9. 将解离的细胞以每平方毫米2,200个细胞的密度接种于包被有细胞外基质的多电极阵列（MEA）上。对于本实验所用的MEA系统，该密度相当于每张MEA约接种130,000个细胞。加入神经基础培养基（neurobasal medium），使MEA中的终体积为1 mL，并将MEA置于CO₂培养箱中₂ 孵育过夜以促进细胞贴壁和神经突延伸（图1).
   注意：对于不同区域和电极数量的多电极阵列（MEA），可尝试不同的细胞密度——通常情况下，较高的细胞密度会增强网络活性，但也会导致培养物存活时间缩短。
10. 第二天，将步骤1.1中配制的1 mM BPA储备液加入处理组MEA的Neurobasal培养基中，使BPA终浓度为10 µM。向对照组MEA中加入等体积的10%乙醇水溶液（v/v）。
11. 每隔一天用含有10 µM BPA的Neurobasal培养基替换旧培养基，持续至第7天 体外 （7天后体外培养）及此后每一天，随着网络活动的增加。
    注意：随着网络活动的增强，代谢活动也会增加，需要更频繁地更换培养基。切勿让培养基变橙。

3. 记录神经元网络活动

1. 在采集当天，将培养基更换为新鲜的神经基础培养基，并将微电极阵列（MEA）放回 CO₂ 培养箱中至少孵育 2 小时后再开始记录。启动记录软件，通过点击温度图标将 MEA 的温度设置为 37 °C（补充图 3.1a-b）。
   注意：记录最早可在铺板后第 3 天开始，只要细胞培养物存活即可持续进行。
2. 通过右键点击左侧窗口面板“Streams”下的 "Muse" 图标，选择 "Add Processing" 和 "Spike Detector"，然后在弹出窗口中点击“确定”来设置采集参数。"Spike Detector (6 x STD)" 将显示在文件名下方（补充图 3.2a-b）。
3. 接着右键点击 Spike Detector，选择 "Add Processing" 和 "Burst Detector"，然后在弹出窗口中点击“确定”。"Burst Detector"（ISI）将出现在 Muse 图标下方（补充图 3.3a-b）。
4. 接着右键点击 Burst Detector，选择 "Add Processing" 和 "Neural Statistics Compiler”。在弹出窗口中，确保选中“File Header”、“Aggregated Well Statistics”和“Synchrony”选项，然后点击“确定”。"Statistics Compiler" 将出现在其下方（补充图 3.4a-b）。
   注意：此设置将采用自适应阈值交叉法（6 倍标准差滤波器），设定峰间间隔为 100 ms，最小峰数量为 5；平均放电率检测时间窗为 10 秒，同步性参数为 20 ms，最小放电率为每分钟 0.083333 个峰。
5. 通过点击底部的时钟图标，设置每次记录时长为 5 分钟（300,000 ms）的定时记录。具体操作为在设置区域修改参数，使系统每 5.1 分钟记录一次，每次记录持续 5 分钟。该任务将立即启动并仅执行一次（补充图 3.5）。
6. 在移动 MEA 前，确认其温度已达到 37 °C。从培养箱中取出 MEA，将其放置在记录单元上并锁定。在定时记录区域点击“开始记录”按钮，或在 "File Play" 窗口中点击记录图标，以开始记录神经网络活动。通常 5 分钟（300,000 ms）的记录时间已足够，但也可获取最长至 10 分钟的记录数据。
7. 记录完成后，将 MEA 放回培养箱。
   注意：操作过程中必须注意保持无菌状态，并尽量减少 MEA 在培养箱外的暴露时间。

4. 数据分析

1. 可以使用记录软件离线分析原始数据。点击文件下拉菜单并打开记录，选择要分析的原始数据文件。重放原始记录以捕获所需的放电参数。
2. 要获得平均放电次数，请使用放电检测模块；要获得同步性指数，请使用神经统计编译器模块。
3. 加载放电检测器、簇状放电检测器和统计编译器模块，方法与之前相同（第3节）。
4. 在放电检测器、簇状放电检测器和统计编译器模块窗口的下拉菜单中，分别选择放电列表、网络簇状放电列表和高级指标。
5. 点击记录按钮以开始记录数据文件，这将在指定文件夹中生成一个 .csv 文件。放电参数——总放电次数和同步性指数——将被记录在该 .csv 文件中。
   注意：不建议在记录原始数据的同时进行实时分析，因为这可能会占用处理器时间和计算资源。

结果

我们研究了双酚A（BPA）对鸡胚神经元培养物同步发育的影响。放电活动的同步性是神经网络正常发育的指标 体外当两个峰电位在5毫秒内相继发生时，被视为同步放电。 体外 神经元培养物最初表现出随机的放电活动——放电事件随机发生，且峰电位间期呈正态分布。随着培养物的成熟，放电活动逐渐趋于同步，峰电位间期趋于恒定。通过记录软件对放电时间进行互相关分析，量化培养物的同步放电活动。¹² 以计算同步性指数（Synchrony Index, SI）。我们发现，双酚A（BPA）暴露通过降低放电活动和同步性指数，对神经网络活动的发育产生不利影响。图2a 和 2b综上所述，我们已证明双酚A暴露对胚胎的有害影响会波及其发育过程，包括可通过培养的鸡神经元同步性发育来评估的神经功能。

图1：本实验方案的示意图，展示从鸡前脑解剖、细胞分离、接种培养到记录神经网络活动的各个步骤。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2： (A) 与对照组相比，经BPA处理的E7鸡胚前脑培养物的平均放电次数显著降低。平均放电次数由记录软件提取。两组均值（对照组：14,890 ± 949.0，N = 15；BPA组：5,624 ± 465.9，N = 22）差异具有统计学意义（非配对t检验，p <0.0001）。(B) 与对照组相比，经BPA处理的E7鸡胚前脑培养物的平均同步性指数（SI）显著降低。SI值通过记录软件中的神经统计编译器模块提取。两组SI均值（对照组：0.5159 ± 0.06547，N = 15；BPA组：0.1140 ± 0.01840，N = 22）差异具有统计学意义（非配对t检验，p <0.0001）。误差条表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

快速生长和发育阶段（如胚胎发生）特别容易受到包括双酚A（BPA）在内的多种内分泌干扰物的有害影响。我们提供了详细的研究方案，用于分析BPA暴露在一种 体外 脊椎动物神经元网络模型。利用该方案，我们证实双酚A（BPA）会降低发育中神经元网络的动作电位发放率以及同步性指数图2a-b).

我们的方法旨在研究早期胚胎发生期间双酚A（BPA）的暴露效应，且可轻松调整用于研究其他内分泌干扰物（EDC）的影响。相较于大鼠或小鼠等其他脊椎动物模型，鸡胚神经元培养体系相对易于建立。此外，该实验无需专门的动物房——仅需实验室台面上的一台普通培养箱即可完成检测。本文描述了采用多电极阵列系统（MEA）评估内分泌干扰物BPA对神经网络活动影响的方法。此处所述方案可适用于其他系统。本实验方案的关键环节在于无菌操作的维持：包括在无菌条件下进行胚胎解剖，使用70%乙醇对器械进行消毒，以及使用无菌的Hank's平衡盐溶液即已足够。由于数据采集周期长达数周，因此在操作过程中必须始终保持MEA的无菌状态。一旦神经元培养建立成功，即可进行长期培养（最长可达三个月），因此该体系适用于研究EDC及其他化合物对神经网络的长期暴露效应。本方案另一重要环节是从解剖到接种的时间控制。最佳时间为30分钟，包含组织与胰蛋白酶孵育的时间。时间越长，细胞存活率越低。

我们在此描述了一种基本实验方案，可用于评估任何影响行为和神经功能的化学物质或药物。本实验中，我们采用的细胞密度为每平方毫米2,200个细胞²；然而，该参数可进行调整，也可使用其他细胞密度。通常情况下，我们发现增加细胞密度会提高网络活性——在更短时间内出现更多动作电位。尽管上述方法在评估化学物质对网络活性的影响方面非常有用，但仍存在局限性。其中最主要的局限性在于这些 体外培养 是二维的，可能无法反映脊椎动物大脑的三维结构。这一局限可通过脑片记录技术加以克服。另一种替代方法是通过在鸡蛋钝端切开的小窗，将处理因素施加于发育中的鸡胚¹⁵在治疗方案结束时解剖大脑，使用振动切片机切成厚片，并将其放置于多电极阵列（MEA）上以记录神经网络活动。

本方案的重要意义在于能够检测环境内分泌干扰物（EDCs）对神经网络活动发育的影响，并探索这些化学物质作用的潜在机制基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#5 镊子	Fine Science Tools	11251-10
Axion Muse MEA	Axion Biosystems	M64-GL1-30Pt200	在文稿中将称为MEA系统
Axis Software	Axion Biosystems		在文稿中将称为记录软件
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
弯头镊子	Fine Science Tools	11272-50
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
受精鸡卵	来自任何本地农场或Spafas
HBSS	Fisher	14170112
血细胞计数板	Fisher	02-671-6
生长因子减少型、无酚红Matrigel	BD Biosciences	356231	在文稿中将称为细胞外基质（ECM）
Neurobasal培养基	BrainBits	Nb4-500
Neuroexplorer统计软件	Nex Technologies	Neuroexplorer version 5
巴斯德吸管	Fisher	13-678-20A
弹簧剪	Fine Science Tools	15514-12
底部涂有Sylgard的解剖皿	Living Systems Instrumentation	DD-90-S-BLK-3PK
台盼蓝染料	Fisher	15-250-061
胰蛋白酶-EDTA	Fisher	15400054