角膜组织工程：一种 体外 人角膜基质-神经相互作用模型

摘要

本方案描述了一种新型的三维 体外 模型，其中角膜基质细胞与分化后的神经元细胞共同培养，以协助研究和理解这两种细胞类型之间的相互作用。

摘要

组织工程因对人角膜替代物的高需求而受到广泛关注，全球约有1000万人因角膜病变导致视力丧失¹。为满足对可存活人角膜的需求，三维（3D）组织工程已取得显著进展^2,3,4。这些角膜模型从简单的单层系统发展到多层结构，进而构建出三维全层角膜等效物²。

然而，在三维组织工程角膜的应用背景下 体外 迄今为止研究的疾病模型均未能模拟多层三维角膜组织结构、功能以及不同类型细胞间的网络相互作用。即神经、上皮、间质和内皮^2,3此外，对 体外 角膜组织模型的应用日益增加，旨在减少药物产品开发中的动物实验。因此，需要更复杂的模型以更好地满足人体生理需求，建立更贴近患者群体的模型势在必行。鉴于多种角膜细胞类型会受到圆锥角膜、糖尿病性角膜病变和福克斯角膜内皮营养不良等疾病和营养不良的影响，本模型包含来自健康供体的原代人角膜成纤维细胞（HCFs）与SH-SY5Y细胞系来源神经元的三维共培养体系。这使我们首次能够在人角膜组织环境中研究这两种细胞类型之间的相互作用。我们认为，该模型有望解析与表现出神经损伤的角膜疾病中基质-神经相互作用相关的基本机制。该三维模型模拟了角膜组织基本的解剖和生理特性 体内 并可在未来作为研究角膜缺陷以及在动物实验前筛选各种药物疗效的工具。

引言

在人体中，角膜是神经支配最密集的组织。这些神经负责多种感觉功能，如触觉、痛觉和温度觉，同时在伤口愈合、眨眼反射、泪液生成与分泌中也发挥着重要作用^5,6,7。角膜中的基质神经干起源于角膜缘丛，并以放射状进入周边角膜基质。基质神经的排列与胶原板层平行，并在向浅层基质延伸过程中进一步分支为更小的神经束^5,8。神经纤维进一步穿透上皮层，从而使神经支配广泛分布于整个角膜上皮和基质中。因此，神经支配在角膜的正常生理状态和疾病状态下均具有关键作用。在本实验方案中，我们介绍了一种新型的三维体外（in vitro）模型的建立进展，该模型是首个能够模拟体内（in vivo）基质-神经相互作用的模型。本研究采用了SH-SY5Y细胞系，因为它是研究神经元生长最常用且特征最明确的细胞系之一。已有文献报道，SH-SY5Y细胞系可产生贴壁生长的基质型（S-type）细胞和具有神经母细胞特性的（N-type）细胞，并能发生转分化⁹。因此，尽管该细胞系来源于N型细胞的三次连续亚克隆筛选，但仍含有少量S型细胞，可在维甲酸和脑源性神经营养因子的作用下分化为神经元⁹。这一特性为深入理解糖尿病视网膜病变（DM）及其他眼病相关的角膜并发症提供了有力工具。由于从眼病患者体内获取并培养神经元存在诸多困难，这种三维体外（in vitro）模型在研究角膜基质与神经元之间的相互作用及信号传导方面具有重要意义。

疾病状态通常会大规模影响机体的多种组织，导致生活质量下降。眼组织营养不良是常与全身性疾病相关的常见并发症，可导致视力下降甚至永久性失明。为了更好地理解疾病状态及其在基础细胞水平上的影响，通常需要进行综合性的研究。为研究此类疾病的影响，已借助组织工程技术开发出多种体内和体外模型。角膜组织工程技术在科学界的多个领域引起了广泛关注^{10,11,12,13,14}，但在实际应用中仍存在重大局限性，包括角膜移植排斥、感染和瘢痕形成^{10,11,12,13,14}。已有若干研究成功开发并建立了多种体外模型^{3,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}。其中，三维体外模型最具前景且受到广泛关注。已知三维模型能更真实地模拟在纤维化和伤口愈合过程中至关重要的体内细胞和生理事件^15,27,28,29。这些体外模型在探索治疗不同疾病（包括角膜并发症）的新疗法方面发挥着不可或缺的作用。尽管神经支配在角膜功能中具有关键作用，但目前在促进角膜组织工程构建物内周围神经增殖方面的研究仍十分有限^2,3。然而，所提出的三维体外细胞构建物旨在模拟目标组织，以实现所需的组织功能。

尽管由于神经缺陷，糖尿病性角膜病变是本模型的显而易见的应用方向，但还有其他多种角膜疾病也可从人类角膜模型中获益 体外 包括圆锥角膜和福克斯营养不良在内的模型。我们的三维模型源于这一前景，并提出开发一种 体外 角膜组织的表征以评估新型眼用药物的递送效果和安全性。

方案

本方案遵循俄克拉荷马大学健康科学中心/机构审查委员会（IRB #4509）的指南。本方案的所有部分均符合《赫尔辛基宣言》的原则。角膜样本来自国家发育与研究研究所（NDRI）和俄克拉荷马州狮子会眼库。

1. 原代细胞的分离

1. 收到人角膜组织样本后，将组织转移至含有 2 mL 无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）(1x) 的 21.5 cm² 培养皿中。
2. 将角膜隆起面朝上放置，刮除并去除角膜上皮。为确保完全去除，使用刀片以 45° 角彻底刮除上皮层。随后将角膜隆起面朝下翻转，用刀片以 45° 角彻底刮除基质层上的内皮细胞，以确保完全去除。用 DPBS 清洗基质组织。
3. 使用 10 号手术刀片将基质组织切成小块，在操作过程中始终用 DPBS 保持组织湿润。用无菌镊子夹取基质小块，放入不含培养基的 T25 培养瓶中（每瓶放置 4 至 5 块 2 × 2 mm 的组织）。
4. 将组织块置于 37 °C 条件下，使其贴附于培养瓶底部，约需 30–40 分钟。待组织块贴壁后，缓慢加入含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素/抗真菌剂的 Eagle 最低必需培养基（EMEM），避免扰动组织块。
5. 轻柔地将培养瓶放入 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中。保持组织块不受干扰，直至细胞开始从组织块中分离并迁移。大约 2–4 周后，细胞应达到 100% 汇合度。当细胞达到 100% 汇合度时，移除培养基，并用 DPBS 清洗细胞，进行传代。
6. 向细胞中加入胰蛋白酶，随后在 37°C 下孵育。约 5 分钟后，在光学显微镜下观察细胞，确认其已脱落，然后加入新鲜培养基以终止蛋白水解反应。
7. 将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 1,000 × g 条件下离心。小心移除上清液，避免扰动沉淀，将细胞重悬于含 10% FBS 和 1% 抗生素的新鲜 EMEM 培养基中。计数细胞后，将约 1 × 10⁶ 个细胞接种至 T75 培养瓶中，使用含 1% FBS 和 1% 抗生素的新鲜 EMEM 培养基进行进一步扩增。

2. 原代HCFs培养与三维结构组装

1. 从先前在 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗真菌剂中培养的组织块中分离并计数人包皮成纤维细胞（HCFs），以构建三维结构。
2. 将约 1 × 10⁶ 个原代 HCFs 接种至 3D 构建物的聚碳酸酯膜小室中，膜孔径为 0.4 µm，每孔加入 1.5 mL 新鲜的 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗真菌剂至构建物上室；同时在每个构建物下室加入 1.5 mL 相同培养基。
3. 细胞接种 24 小时后，使用 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗真菌剂培养细胞，并通过在每个构建物的上室和下室各加入 1.5 mL 含 0.5 mM 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素 C）的培养基进行刺激。
4. 将培养物置于 37 °C、5 % CO₂ 的培养箱中培养 3 周，在整个实验期间每隔一天更换新鲜培养基。无需进一步传代。

3. 细胞分化与共培养

1. 3 周后，在先前组装好的 3D 构建物顶部每孔接种 8 × 10³ 个 SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞，构建物内含有 1.5 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）、1% 抗生素/抗真菌剂和 0.5 mM 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素 C）的 EMEM 培养基。
   1. 让 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞在角膜基质细胞顶部生长至少 24 小时，然后开始细胞分化。
2. 通过在构建物顶部加入含 1% FBS 和 1.5 mL 10 µM 视黄酸的 EMEM 培养基刺激细胞，启动 SH-SY5Y 细胞分化。同时，在构建物底部加入 1.5 mL 含 10% FBS、1% 抗生素/抗真菌剂和 0.5 mM 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素 C）的 EMEM 培养基。 注意：视黄酸处理步骤应在避光条件下进行。
   1. 在此分化培养基中继续培养细胞 5 天。
3. 当细胞进入分化阶段后，将构建物顶部更换为 1.5 mL 无血清培养基，该培养基为在 EMEM 中添加 2 nM 脑源性神经营养因子（BDNF）和 1% 抗生素/抗真菌剂；同时在构建物底部加入 1.5 mL 含 10% FBS、1% 抗生素/抗真菌剂和 0.5 mM 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素 C）的 EMEM 培养基。 注意：BDNF 处理步骤也应在避光条件下进行。
4. 再继续培养细胞 2 天，之后根据 表 1 所示进行后续分析处理。

结果

图1 是工作中的3D设备的逐步代表性图像 体外 模型。第一步，从人角膜中分离细胞。随后，将细胞培养在聚碳酸酯膜上，并用维生素C刺激，以组装由细胞自身分泌的三维基质。该三维构建系统可诱导形成多层细胞结构。 体内类基质的三维基质中。随后，将神经母细胞瘤细胞接种于基质细胞之上，并诱导神经细胞分化。由此实现角膜基质细胞与分化后的神经细胞在三维环境中的共培养。 体外 模型 图2 是三维自组装结构的高倍透射电子显微镜（TEM）图像图2A) 显示聚碳酸酯膜及接种于其上的角膜基质细胞，细胞分泌出自组装基质，随后为 (图2B）接种于上层的分化神经元细胞呈现出基质样神经元细胞排列。图中箭头所示为神经元细胞。鉴于角膜基质与神经元细胞之间存在直接的相互作用，我们认为影响角膜缺损调控的关键因素存在于基质层中。...

讨论

已有若干研究致力于开发多种动物模型，以增进对角膜疾病的理解并探索治疗方法。然而，这些研究对人类的实际价值尚未得到证实。迄今为止，多种 体外 由于其显著的临床意义，相关模型已被广泛开发和研究。我们先前建立的3D 体外 模型是一种新型系统，为视觉研究领域的医学科学进步做出了重要贡献，并展现出完美重现相关生理或病理特征的能力 体内 事件 体外^28,29,30本方案旨在开发下一代此类技术 体外 可用于研究与角膜疾病（如糖尿病性角膜病变、圆锥角膜和福克斯角膜内皮营养不良）相关并发症的细胞和分子机制的角膜模型。此类进展可为发现临床上亟需的新疗法奠定坚实基础。

该模型可能有助于识别糖尿病（DM）及其他角膜疾病中发生的各种结构和细胞改变，具有重要的应用前景，包括在疾病早期阶段进行筛查，从而有助于疾病的管理。本文提出的模型虽...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
健康角膜组织	NDRI		来自无眼部外伤或全身性疾病的供体的样本
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（1X）	Gibco by Life Technologies	14190-144
无菌镊子	Fischer Scientific	13-812-42	Fisherbrand 解剖用超细尖镊子
单边剃须刀片	Personna	270100
无菌外科手术刀片 No.10	Feather Surgical Blade	2976#10
Eagle’s 最低必需培养基	ATCC	30-2003
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550	培养基配制需添加10%胎牛血清
抗生素-抗真菌素（100X）	Gibco by Life Technologies	15240-062	培养基配制需添加1%抗生素-抗真菌素
0.05% 胰蛋白酶 EDTA（1X）	Gibco by Life Technologies	25300062
带0.4-μm 孔径的聚碳酸酯膜插件	Corning Costar	3412
2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素C）	Sigma-Aldrich	SMB00390-14	实验应使用0.5 mM的浓度
石蜡块	VWR	50-949-027
SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞	ATCC	SHSY5YATCC CRL-2266
维甲酸	Sigma-Aldrich	SRP3014-10UG	终浓度需为10 μM
BDNF	Sigma-Aldrich	R2625-100MG	终浓度需为2 nM
二甲基亚砜（DMSO）	VWR-Alfa Aesar	67-68-5	应使用超纯级无菌DMSO
Thermo Scientific Nunc 细胞培养处理EasYFlasks（T25）	Fisher Scientific	12-565-351
Thermo Scientific Nunc 细胞培养处理EasYFlasks（T75）	Fisher Scientific	12-565-349