转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）是一种全基因组范围检测染色质可及性的方法。本方案为针对人淋巴细胞（Th1/Th2）优化的逐步ATAC-seq实验流程，涵盖从分子实验到最终计算分析的完整步骤。该方案适用于无下一代测序方法经验的研究人员。
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本文内容
摘要
摘要
利用高通量测序的转座酶可及性染色质分析（ATAC-seq）是一种用于鉴定染色质开放（可及）区域的方法。这些区域代表调控性DNA元件（例如启动子、增强子、基因座控制区、绝缘子）结合的位点。绘制可及染色质图谱是全基因组范围内识别活性调控元件的有力方法。该信息可作为一种无偏倚的手段，用于发现调控基因表达程序的相关转录因子网络及染色质结构机制。ATAC-seq 是一种稳健且灵敏的技术，可替代 DNase I 超敏感性分析结合下一代测序（DNase-seq）和甲醛辅助分离调控元件（FAIRE-seq），用于全基因组染色质可及性分析，也可替代微球菌核酸酶敏感位点测序（MNase-seq）以确定核小体定位。本文提供了一种针对人类原代免疫细胞优化的详细 ATAC-seq 实验方案 即 CD4+ 淋巴细胞（辅助性T细胞1（Th1）和Th2细胞）。本综合性实验方案从细胞收获开始，详细描述染色质标签化（tagmentation）的分子生物学操作、下一代测序的样本制备流程，并包含用于解析结果的计算分析方法与注意事项。此外，为节省时间和成本，我们在测序前引入了质量控制步骤，以评估ATAC-seq文库的质量。重要的是，本方案所阐述的原理可适用于其他人源免疫与非免疫原代细胞及细胞系。这些操作指南对于不熟悉下一代测序技术的实验室也具有实用价值。
引言
ATAC-seq1,2 是一种稳健的方法，可用于鉴定调控性3开放染色质区域及核小体定位。该信息可用于推断转录因子的位置、身份及其活性。该方法在测量染色质结构定量变化方面的高灵敏度，使其可用于研究染色质因子（包括染色质重塑因子和修饰因子）的活性，以及RNA聚合酶II1的转录活性。因此，ATAC-seq为解析任何目标细胞类型中转录调控机制提供了一种强大且无偏倚的方法。本文描述了ATAC-seq在人原代Th1和Th2细胞中的应用。
在ATAC-seq中，携带下一代测序（NGS）接头的超活性Tn5转座酶将DNA片段化与接头标记DNA两个步骤耦合在一起即，该 "转座与片段化（tagmentation）" 过程1PCR扩增后，所获得的DNA文库即可用于下一代测序（图1通过分析ATAC-seq测序读段在局部区域的富集情况，可检测染色质可及性优先的标签化（tagmentation）现象。
与其他检测染色质可及性和核小体定位的方法（如DNase-seq4、FAIRE-seq<....
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方案
所有实验程序均经巴伊兰大学机构审查委员会批准，且实验方案遵循该委员会提供的指导方针。
1. 初始人CD4+细胞的纯化及向辅助性T细胞1（Th1）和Th2细胞的极化
注意：此处描述的实验流程从冻存的人外周血单个核细胞（PBMCs）开始。第一步是使用磁珠和分离柱分离CD4+细胞，通常可获得超过95%纯度的CD4+细胞。然而，该步骤可能因各实验室偏好的实验方案而有所不同。T细胞活化与极化方案经Jenner et al.（2009）18 的方法修改而来。从一千万个PBMCs中分离CD4+细胞，可获得400万至600万个CD4+细胞。将细胞分至两个培养瓶中，在Th1和Th2极化条件下培养，仅需一周即可分别获得300万至500万个Th1和Th2细胞。
注意：开始前将离心机冷却至 4 °C。
- 在含有10 mL RPMI培养基（添加1%青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和10%热灭活胎牛血清）的50 mL离心管中解冻1 mL人外周血单个核细胞（PBMCs，107个细胞）。在500 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用无菌25 mL移液管将细胞重悬于15 mL添加物的RPMI培养基中。用无菌25 mL移液管将细胞转移至T75培养瓶中。
- 将细胞置于加....
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结果
本实验方案的最终产物是通常浓度为 3 - 20 ng/µL 的 ATAC-seq 文库。在用于 DNA 完整性分析的系统上检测时（见材料/设备表），文库呈现梯状条带2（图 3A）。DNA 片段的平均长度通常约为 450 - 530 bp。
在进行下一代测序之前，对ATAC-seq文库进行适当的质量控制对于节省时间和成本至关重要。我们认为，当阳性对照相对于阴性对照的富集倍数分别超过25倍和75倍（引物对3和4）时，并且文库呈现出前述的核小体阶梯状条带模式，则该文库适用于下一代测序（NGS）（图3B）。在分析qPCR数据时，我们还需确认以基因组DNA为模板的反应中，阴性对照和阳性对照引物的Cq值相近，并且在不同实验中，以ATAC-seq DNA片段为模板的反.......
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讨论
本文所述的ATAC-seq方案已成功用于分析原代细胞（人Th1、Th2细胞和B细胞）以及培养细胞系（MCF10A人乳腺癌细胞和U261胶质母细胞瘤细胞）中的可及染色质。将ATAC-seq应用于其他细胞类型时，可能需要对方案进行一定优化，尤其是在裂解步骤中。若非离子型去污剂浓度过高，则可能导致线粒体DNA污染比例升高。通过降低裂解缓冲液中的去污剂浓度，可在不减少细胞核得率的前提下降低此类污染。根据我们的经验，使用含0.05%去污剂的裂解缓冲液可获得最满意的结果。此外，采用水平转子而非固定角转子离心细胞核，可将离心力降低至500 ×g，从而减少沉淀中线粒体的含量。研究人员也可尝试其他类型的去污剂，例如毛地黄皂苷17。然而，即使裂解条件已优化，线粒体DNA污染仍不可避免。为彻底去除线粒体DNA，可使用CRISPR/Cas9系统15。在此方法中，ATAC-seq文库与靶向线粒体DNA的sgRNA及Cas9核酸酶共同孵育，以消化线粒体DNA15。
本.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由以色列科学基金会（资助号 748/14）、玛丽·居里整合资助（CIG）- FP7-PEOPLE-20013-CIG-618763 以及规划与预算委员会和以色列科学基金会资助的 I-CORE 项目（资助号 41/11）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 离心管 | Lumitron | LUM-CFT011500-P | 可使用其他供应商的产品。 |
| 微量离心管 | Axygen Inc | MCT-175-C | 可使用其他供应商的产品。 |
| 25 mL 刻度吸管 | Corning Costar | 4489 | 可使用其他供应商的产品。 |
| 细胞培养瓶 | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | 可使用其他供应商的产品。 |
| Countes 自动细胞计数仪 | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin 组织提取试剂盒 | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| 外周血单个核细胞 (PBMC) | ATCC | PCS800011 | 可使用其他供应商的产品。 |
| RPMI 1640 培养基 | Biological Industries | 01-103-1A | 可使用其他供应商的产品。 |
| L-谷氨酰胺溶液 (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | 可使用其他供应商的产品。 |
| 青霉素-链霉素双抗溶液 | Biological Industries | 03-031-1B | 可使用其他供应商的产品。 |
| 胎牛血清 (FBS)， 热灭活，欧洲级 | Biological Industries | 04-127-1 | 可使用其他供应商的产品。 |
| MACS CD4 磁珠，人源 | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS 分离柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| 抗人 CD4 FITC 抗体 | Biogems | 06121-50 | |
| 小鼠 IgG1 同型对照 FITC 抗体 | Biogems | 44212-50 | |
| 抗人 CD3 抗体 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| 抗人 CD28 SAFIRE 纯化抗体 | Biogems | 10311-25 | |
| 重组人 IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| 重组人 IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| 重组人 IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| 体内应用级抗人 IL-4 抗体 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF 纯化抗人 IFN-γ 抗体 | BioLegend | 506513 | |
| 氯化钠 (NaCl)，分析纯 | Carlo Erba | 479687 | 可使用其他供应商的产品。 |
| 氯化镁六水合物，分子生物学级 | Calbiochem | 442611 | 可使用其他供应商的产品。 |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | 可使用其他供应商的产品。 |
| Tris，超纯，纯度 99.9% | MP Biomedicals | 819620 | 可使用其他供应商的产品。 |
| NP-40 替代物（壬基苯基聚乙二醇） | Calbiochem | 492016 | 可使用其他供应商的产品。 |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma | P2714 | 该蛋白酶抑制剂混合物为粉末状。配制成 100 倍溶液时，用 1 mL 分子生物学级水溶解。 |
| 磁性固相逆转固定化磁珠：AMPure XP 磁珠 | Beckman | 63881 | |
| PCR 纯化试剂盒 | HyLabs | EX-GP200 | 可使用其他供应商的产品。 |
| Nextera DNA 文库制备试剂盒（TDE1 转座酶和 TD 缓冲液） | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext 高保真 2 x PCR 预混液 | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 热启动高保真 PCR 预混液 | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测 系统 | Bio-rad | 185-5200 | 可使用其他供应商的产品。必须具备适用于微量离心管的转子。 |
| CFX Manager 软件 | Bio-rad | 1845000 | |
| qPCR 预混液：iTaq 通用 SYBR Green 超混合液 | Bio-rad | 172-5124 | 可使用其他供应商的产品。 |
| Qubit 2.0 荧光计 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | Invitrogen | Q32854 | |
| 微量离心管用磁力架 | Invitrogen | 12321D | 可使用其他供应商的产品。 |
| 带 15 mL 离心管和微量离心管转子的制冷摆动转子离心机 | Thermo Scientific | 75004527 | 可使用其他供应商的产品。必须具备适用于微量离心管的转子。 |
| 恒温混匀仪 | MRC | 可使用其他供应商的产品。 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 试剂 | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation 系统 | Agilent Technologies | G2991AA | 基于胶带的电泳平台 |
| High Sensitivity DNA 试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-4626 | 用于高灵敏度 TapeStation 分析的试剂 |
| 引物名称及序列 | 公司 | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' | IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 序列-转座酶序列-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.1_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.2_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.3_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.4_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.5_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.6_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.7_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.8_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.9_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.10_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.11_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.12_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.13_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.14_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.15_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.16_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.17_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.18_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.19_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.20_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.21_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.22_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.23_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' | IDT | Ad2.24_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
参考文献
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J.
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重印与许可
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