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方法文章

通过ATAC-Seq技术绘制原代人T淋巴细胞全基因组染色质可及性图谱

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DOI：

10.3791/56313

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2017年11月13日

 ,  ,  ,  , 
1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

本文内容

摘要

转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）是一种全基因组范围检测染色质可及性的方法。本方案为针对人淋巴细胞（Th1/Th2）优化的逐步ATAC-seq实验流程，涵盖从分子实验到最终计算分析的完整步骤。该方案适用于无下一代测序方法经验的研究人员。

摘要

利用高通量测序的转座酶可及性染色质分析（ATAC-seq）是一种用于鉴定染色质开放（可及）区域的方法。这些区域代表调控性DNA元件（例如启动子、增强子、基因座控制区、绝缘子）结合的位点。绘制可及染色质图谱是全基因组范围内识别活性调控元件的有力方法。该信息可作为一种无偏倚的手段，用于发现调控基因表达程序的相关转录因子网络及染色质结构机制。ATAC-seq 是一种稳健且灵敏的技术，可替代 DNase I 超敏感性分析结合下一代测序（DNase-seq）和甲醛辅助分离调控元件（FAIRE-seq），用于全基因组染色质可及性分析，也可替代微球菌核酸酶敏感位点测序（MNase-seq）以确定核小体定位。本文提供了一种针对人类原代免疫细胞优化的详细 ATAC-seq 实验方案 即 CD4+ 淋巴细胞（辅助性T细胞1（Th1）和Th2细胞）。本综合性实验方案从细胞收获开始，详细描述染色质标签化（tagmentation）的分子生物学操作、下一代测序的样本制备流程，并包含用于解析结果的计算分析方法与注意事项。此外，为节省时间和成本，我们在测序前引入了质量控制步骤，以评估ATAC-seq文库的质量。重要的是，本方案所阐述的原理可适用于其他人源免疫与非免疫原代细胞及细胞系。这些操作指南对于不熟悉下一代测序技术的实验室也具有实用价值。

引言

ATAC-seq1,2 是一种稳健的方法，可用于鉴定调控性3开放染色质区域及核小体定位。该信息可用于推断转录因子的位置、身份及其活性。该方法在测量染色质结构定量变化方面的高灵敏度，使其可用于研究染色质因子（包括染色质重塑因子和修饰因子）的活性，以及RNA聚合酶II1的转录活性。因此，ATAC-seq为解析任何目标细胞类型中转录调控机制提供了一种强大且无偏倚的方法。本文描述了ATAC-seq在人原代Th1和Th2细胞中的应用。

在ATAC-seq中，携带下一代测序（NGS）接头的超活性Tn5转座酶将DNA片段化与接头标记DNA两个步骤耦合在一起即，该 "转座与片段化（tagmentation）" 过程1PCR扩增后，所获得的DNA文库即可用于下一代测序（图1通过分析ATAC-seq测序读段在局部区域的富集情况，可检测染色质可及性优先的标签化（tagmentation）现象。

与其他检测染色质可及性和核小体定位的方法（如DNase-seq4、FAIRE-seq5和MNase-seq6）相比，ATAC-seq具有实验流程短、起始材料需求量少的优势，因此已被广泛应用于多种生物体系，包括人类原代细胞1,7和临床样本8，以及单细胞生物9、植物10、果蝇11和多种哺乳动物12。

通过分析转录因子结合序列基序的富集情况，或将ATAC-seq与染色质免疫沉淀（ChIP）结合高通量DNA测序（ChIP-seq）技术联用，可揭示结合在可及位点上的转录因子的身份。该方法已成功用于鉴定在小鼠造血过程中起重要作用的谱系特异性转录因子13。由于ATAC-seq具有无偏性和全基因组覆盖的特点，因此可用于研究那些缺乏ChIP分析所需试剂（如特异性抗体）的生物体中的基因调控。例如，通过比较人类和黑猩猩颅神经嵴细胞的研究，发现了cis-调控区域的进化差异14；在小鼠早期胚胎发育过程中识别出调控元件的发育动态变化15；在单细胞生物C. owzarzaki的生活周期中观察到调控图景的变化9；以及跨20种哺乳动物物种的启动子和增强子的演化规律12。

ATAC-seq 还被用于测量单细胞中的染色质可及性，从而揭示细胞群体内的异质性，而这种异质性通常在全基因组研究中难以发现7,16。此外，ATAC-seq 还可用于研究在样本稀少的疾病状态下DNA调控区域发生的变化。例如，ATAC-seq 可用于研究急性髓系白血病（AML）发生过程中调控图景的变化17，或 Ras 驱动的肿瘤发生过程11。

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方案

所有实验程序均经巴伊兰大学机构审查委员会批准，且实验方案遵循该委员会提供的指导方针。

1. 初始人CD4+细胞的纯化及向辅助性T细胞1（Th1）和Th2细胞的极化

注意：此处描述的实验流程从冻存的人外周血单个核细胞（PBMCs）开始。第一步是使用磁珠和分离柱分离CD4+细胞，通常可获得超过95%纯度的CD4+细胞。然而，该步骤可能因各实验室偏好的实验方案而有所不同。T细胞活化与极化方案经Jenner et al.（2009）18 的方法修改而来。从一千万个PBMCs中分离CD4+细胞，可获得400万至600万个CD4+细胞。将细胞分至两个培养瓶中，在Th1和Th2极化条件下培养，仅需一周即可分别获得300万至500万个Th1和Th2细胞。

注意：开始前将离心机冷却至 4 °C。

  1. 在含有10 mL RPMI培养基（添加1%青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和10%热灭活胎牛血清）的50 mL离心管中解冻1 mL人外周血单个核细胞（PBMCs，107个细胞）。在500 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用无菌25 mL移液管将细胞重悬于15 mL添加物的RPMI培养基中。用无菌25 mL移液管将细胞转移至T75培养瓶中。
  2. 将细胞置于加湿培养箱中过夜（37 °C，5% CO2）。
  3. 用无菌25 mL移液管将悬浮细胞转移至50 mL离心管中。通过台盼蓝染色排除法测定细胞数量和活力。
  4. 根据生产商说明书（见材料/设备表），使用CD4+微珠和分离柱通过阳性选择法从1000万个活的非贴壁PBMCs中分离CD4+细胞，并作如下修改：将107个PBMCs用30 µL CD4微珠在120 µL含0.5% BSA的PBS中进行标记。
  5. 通过重组人IL-2（rhIL-2，10 ng/mL）、包被平板的抗CD3抗体（5 µg/mL）和可溶性抗CD28抗体（2 µg/mL）激活CD4+ T细胞，持续72小时。对于Th1极化，添加rhIL-12（20 ng/mL）和抗IL-4抗体（10 µg/mL）；对于Th2极化，添加rhIL-4（40 ng/mL）和抗IFN-γ抗体（10 µg/mL）。
  6. 在rhIL-2（10 ng/mL）和相同极化细胞因子（Th1用rhIL-12，Th2用rhIL-4）存在下，继续培养细胞7天。

2. 细胞核分离

注意：ATAC-seq 实验需使用完整细胞核。裂解缓冲液中含 0.05% 辛基苯基聚乙二醇（见材料/设备表），已针对从原代人 Th1 和 Th2 细胞中分离细胞核进行优化。建议使用本实验室的试剂和细胞对此步骤进行优化。若去污剂不足导致细胞未充分裂解，残留过多完整细胞，将降低转座反应效率。细胞裂解效率通过台盼蓝染色阳性细胞（即细胞核）数量占细胞总数的比例来确定。
注意：配制裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM NaCl，3 mM MgCl2）。将配备摆动吊篮转子的离心机预冷至 4 °C。使用摆动吊篮离心机而非固定角转子离心机进行细胞沉淀，可减少细胞或细胞核的损失。弃去上清液时应小心移液，以避免细胞核或细胞的损失。

  1. 使用前立即向冷裂解缓冲液中加入新鲜的壬基苯基聚乙二醇（终浓度为0.05%）和100倍浓度的蛋白酶抑制剂（终浓度为1倍）。将缓冲液保持在冰上。
  2. 采用台盼蓝染色法计数T细胞，以确定其数量和活力。活力低于90%会导致非特异性消化增加。
  3. 将0.5 × 106个T细胞（Th1或Th2）转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以500 × g离心5分钟。
  4. 用1 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，在4 °C下以500 × g离心5分钟。
  5. 用1 mL冷裂解缓冲液（含壬基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制剂）重悬细胞沉淀。将离心管置于冰上，轻轻吹打以避免破坏细胞核。
  6. 在微量离心管置于冰上的同时，迅速取10 µL样品，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。此步骤不得超过五分钟，以避免损伤细胞核。裂解的细胞比例应至少达到80%。
  7. 立即进行转座反应。将制备好的细胞核保持在冰上。

3. 转座反应

注意：在此步骤中，分离的细胞核与原核来源的 Tn5 转座酶（TDE1）在含有高通量测序接头的条件下进行孵育。高活性 Tn5 能够同时将 DNA 片段化，并将接头连接到基因组的开放区域（即标签化过程）。细胞核与 Tn5 转座酶的比例对于优先切割开放染色质区域至关重要。本方案针对 100,000 个细胞核在 100 μL 反应体系中进行了优化，但反应体系可按比例缩小。

  1. 将热振荡仪的温度设置为 37 °C。
  2. 将 100,000 个细胞核转移至 1.5 mL 微量离心管中。
  3. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 10 分钟，并小心去除上清液。
  4. 按照 表 1 中的规定，向细胞核中加入转座反应组分。
  5. 通过轻柔吹打重悬沉淀。
  6. 在热振荡仪中于 37 °C 孵育转座反应体系 30 分钟，同时轻柔振荡（500 rpm）。
    注意：DNA 纯化步骤使用固相可逆固定化磁珠19（见 材料/设备表）或 PCR 纯化柱进行。纯化结束后，用 20 µL 的 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）洗脱 DNA 片段。洗脱缓冲液中应避免含有 EDTA。

4. ATAC-seq 文库的 PCR 富集

注意：此步骤旨在扩增ATAC-seq文库 即， 插入接头的DNA片段。为了能够在同一高通量测序通道中混合多个ATAC-seq文库（"多重检测"使用未加索引的引物1（Ad1_noMx）1 对所有样本使用相同的引物2，并使用不同索引（带条形码）的引物2（Ad 2.1 - 2.24）1 每个样本的引物序列见补充材料 材料/设备清单.

  1. 初始PCR扩增
    注意：引物1（Ad1_noMx）和引物2的工作浓度为25 µM。所有引物均从100 µM的原始储备液稀释至25 µM。在所有PCR反应中，使用引物1（Ad1_noMx）以及一条带索引的引物2。
    1. 按照表2中指定的组分，将其加入无菌PCR管中。
    2. 将PCR管放入热循环仪中，并按照表3中详述的循环条件进行PCR扩增。
  2. 确定额外扩增循环次数
    注意：额外PCR循环次数应足以产生足够量的文库片段用于成功的下一代测序运行，同时应尽量减少以避免GC含量和片段大小偏差20。确定最佳文库片段扩增所需PCR循环次数（N）的方法是定量PCR（qPCR）。
    1. 将引物1（Ad1_noMx）和引物2（用于初始文库扩增）从25 µM稀释至6.25 µM。
    2. 按照表4中所述，将各组分加入光学PCR管或PCR板中。
    3. 将样品放入qPCR仪中，并按照表5中指定的条件进行循环反应。
    4. 为估算所需的额外扩增循环次数（N），以循环数为横轴，相对荧光强度（RFU）为纵轴作图。
    5. 所需额外扩增循环次数（N）为qPCR反应达到平台期时循环数的1/3。图2展示了三个ATAC-seq文库的示例，其平台期出现在约2,350相对荧光单位（RFU，粗绿色线）。当扩增产物达到最大值的三分之一（783 RFU，纵轴标记值）时所对应的循环数，其中两个文库为8个循环（红色和蓝色扩增曲线），第三个文库为9个循环（粉色曲线）。
  3. 最终PCR扩增
    1. 对剩余的45 µL PCR反应产物进行扩增。将步骤4.1.2中获得的含有扩增反应液的PCR管放入热循环仪中，运行表6中描述的PCR程序。使用先前确定的（步骤4.2.5）扩增循环次数（N）。

5. ATAC-Seq 文库的片段大小选择

注意：根据我们的经验，对扩增后的ATAC-seq文库进行片段大小选择可改善下一代测序结果，因为它能从最终的ATAC-seq文库中去除高分子量的文库片段。
注意：使用前将磁珠在室温下放置30分钟，使其恢复至室温。
使用无核酸酶的水新鲜配制70%乙醇。

  1. 通过混匀重悬磁珠。
  2. 向ATAC-seq文库（步骤4.3.1中获得）中加入无核酸酶水，定容至100 µL。
  3. 向100 µL扩增后的文库中加入50 µL（0.5倍体积）重悬的DNA结合磁珠。用移液器吹打至少10次以混匀。室温孵育5分钟。如有必要，短暂离心微管。
  4. 将管置于合适的磁力架上2分钟，使磁珠与上清液分离。2分钟后，将上清液转移至新的微管中。
  5. 用移液器测量上清液体积，并加入0.7倍体积的磁珠。用移液器吹打至少10次以混匀。
  6. 室温孵育5分钟，然后置于磁力架上2分钟。
  7. 孵育2分钟后，弃去上清液。在管仍置于磁力架上的情况下，加入200 µL新鲜配制的70%乙醇洗涤磁珠。
  8. 将微管保留在磁力架上30秒，然后弃去乙醇。重复步骤5.7进行最后两次乙醇洗涤。
  9. 彻底去除残留乙醇，在磁力架上让磁珠空气干燥5分钟。如有必要，短暂离心微管。用P10移液器吸头去除乙醇残留痕迹。
  10. 将微管从磁力架上取下，加入22 µL 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）。切勿使用含EDTA的缓冲液洗脱ATAC-seq文库。
  11. 室温孵育2分钟，然后将管置于磁力架上。
  12. 待溶液澄清后，将20 µL洗脱的文库转移至新的无菌微管中。
  13. 将经片段大小筛选的ATAC-seq文库储存于-20 °C。

6. ATAC-Seq 文库的质量分析

  1. 通过实时 PCR 验证 ATAC-seq 文库的质量
    注意：在进行下一代测序之前，评估 ATAC-seq 文库的信噪比非常重要。这可以通过定量 PCR（qPCR）测定来自可及和不可及位点的 DNA 片段相对量来实现。不可及位点（阴性对照，chr1:48,137,860-48,137,934 和 chr1:193,093,748-193,093,827）由引物对 1 和 2 扩增；可及位点（阳性对照，chr19:30,336,166-30,336,253 和 chr19:11546154-11546237）由引物对 3 和 4 扩增。阳性与阴性位点的定义基于人类 CD4+ 细胞的染色质可及性（DHS-seq）图谱（ENCODE 编号 ENCSR000EQE 和 ENCSR000EQG）。阴性引物 1 位于一个大的异染色质基因间区域（距离 TRADB2 230 kb，距离 FOXD2 88 kb）。阴性对照区域 2 位于 CDC73 基因的第一个内含子内。阳性引物对 3 位于 Cyclin E（CCNE1）基因下游的开放染色质区域，而阳性引物对 4 位于蛋白激酶 C 底物 80K-H（PRKCSH）基因启动子中心区域。重要的是，这些对照位点在 ENCODE 项目中其他人类细胞类型中也表现出相似的可及性模式3，表明它们可用于监测广泛人类细胞类型的 ATAC-seq 文库。所有引物对的扩增效率和特异性均通过在基因组 DNA（来自人 Th 细胞）系列稀释样本上进行 qPCR 及扩增产物的熔解曲线分析加以验证。
    1. 使用市售试剂盒提取基因组 DNA（参见 材料/设备表）。
    2. 将扩增后的 ATAC-seq 文库稀释 10 倍（1 µL 文库 + 9 µL 无核酸酶水），并将基因组 DNA 稀释至约 5 ng/µL。
    3. 为每对阳性与阴性对照引物配制反应体系（表 7），注意每个反应需设三个重复。
    4. 按照 qPCR 预混液供应商推荐的程序，在 qPCR 热循环仪中孵育。
    5. 使用 qPCR 仪器配套软件分析结果（参见 材料/设备表）。选择基因组 DNA 作为对照样本。所得数值代表可及区域（由阳性对照引物扩增）的富集程度。示例见 表 8。
      注意：文库平均大小与浓度的估算：根据制造商说明，使用高灵敏度自动电泳系统测定 ATAC-seq 文库中 DNA 片段的大小分布。建议使用 dsDNA 高灵敏度试剂盒在荧光计上测定样本浓度，并至少使用每个 DNA 样本 2 µL。
      注意：下一代测序——在文库多重化之前，使用以下公式计算每个 ATAC-seq 文库的摩尔浓度：(ng/µL × 106)/(660 × 文库片段平均长度)。为充分评估人类样本的开放染色质区域，每个 ATAC-seq 文库应达到 > 3000 万条测序读长。若需初步判断文库是否适用于 NGS 测序，可先设定目标为约 1000 万条读长（在快速运行模式下的 DNA 测序仪中占测序通道的 5%）。请注意，若要推断核小体定位，需进行成对末端测序1。

7. 下一代测序结果的分析

  1. 通过分别检查每个文库的 FastQC 文件来评估测序读段的质量。
  2. 在 Unix/Linux 环境中使用 Bowtie21 软件将读段比对至人类参考基因组（hg19 组装版本）。命令为 'bowtie -m 1 -q -S 基因组目录 reads.fastq output_aligned.sam'。其中“基因组目录”指存储 Bowtie 基因组索引的文件夹。参数 -m 1 表示不允许读段比对到基因组中的多个位点，-q 表示输入文件应为 fastq 格式，-S 表示输出为 SAM 格式。
  3. 在 Unix/Linux 环境中使用 SAMtools22 的 rmdup 选项去除重复读段。命令为 'samtools view -S output_aligned.sam -b | samtools sort -o - output_aligned > output_aligned.bam'，
    samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned_rmdup.bam'。第一条命令 view 将 SAM 格式转换为 BAM 格式，然后进行排序。rmdup 选项随后应用于排序后的 BAM 文件。可选地，可按照原始 ATAC-seq 论文1 中所述方法对转座子插入位点进行读段校正。此操作在 Unix/Linux 环境中使用 BEDtools 命令23 实现。命令为 'bamToBed -i output_aligned_rmdup.bam > output_aligned_rmdup.bed'，'shiftBed -i output_aligned_rmdup.bed -p 4 -m -5 -g 基因组 > output_aligned_rmdup_adjusted.bed'。第一条命令 bamToBed 将 BAM 格式转换为 BED 格式，以便后续使用 shiftBed 命令。基因组文件是一个以制表符分隔的文件，包含基因组中每条染色体的长度，该文件通常存放于 BEDtools 目录中。
  4. 在经位移校正的 BED 文件上，于 Unix/Linux 环境中使用基于模型的 ChIP-seq 分析软件 MACS224 进行峰呼叫（peak calling），参数设置如下：--nomodel --extsize 75 --shift -30。这些参数用于调整读段，使转座子插入位点位于每个测序读段的中心。

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结果

本实验方案的最终产物是通常浓度为 3 - 20 ng/µL 的 ATAC-seq 文库。在用于 DNA 完整性分析的系统上检测时（见材料/设备表），文库呈现梯状条带2（图 3A）。DNA 片段的平均长度通常约为 450 - 530 bp。

在进行下一代测序之前，对ATAC-seq文库进行适当的质量控制对于节省时间和成本至关重要。我们认为，当阳性对照相对于阴性对照的富集倍数分别超过25倍和75倍（引物对3和4）时，并且文库呈现出前述的核小体阶梯状条带模式，则该文库适用于下一代测序（NGS）（图3B）。在分析qPCR数据时，我们还需确认以基因组DNA为模板的反应中，阴性对照和阳性对照引物的Cq值相近，并且在不同实验中，以ATAC-seq DNA片段为模板的反...

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讨论

本文所述的ATAC-seq方案已成功用于分析原代细胞（人Th1、Th2细胞和B细胞）以及培养细胞系（MCF10A人乳腺癌细胞和U261胶质母细胞瘤细胞）中的可及染色质。将ATAC-seq应用于其他细胞类型时，可能需要对方案进行一定优化，尤其是在裂解步骤中。若非离子型去污剂浓度过高，则可能导致线粒体DNA污染比例升高。通过降低裂解缓冲液中的去污剂浓度，可在不减少细胞核得率的前提下降低此类污染。根据我们的经验，使用含0.05%去污剂的裂解缓冲液可获得最满意的结果。此外，采用水平转子而非固定角转子离心细胞核，可将离心力降低至500 ×g，从而减少沉淀中线粒体的含量。研究人员也可尝试其他类型的去污剂，例如毛地黄皂苷17。然而，即使裂解条件已优化，线粒体DNA污染仍不可避免。为彻底去除线粒体DNA，可使用CRISPR/Cas9系统15。在此方法中，ATAC-seq文库与靶向线粒体DNA的sgRNA及Cas9核酸酶共同孵育，以消化线粒体DNA15。

本...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由以色列科学基金会（资助号 748/14）、玛丽·居里整合资助（CIG）- FP7-PEOPLE-20013-CIG-618763 以及规划与预算委员会和以色列科学基金会资助的 I-CORE 项目（资助号 41/11）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 离心管LumitronLUM-CFT011500-P可使用其他供应商的产品。
微量离心管Axygen IncMCT-175-C可使用其他供应商的产品。
25 mL 刻度吸管Corning Costar4489可使用其他供应商的产品。
细胞培养瓶LumitronLUM-TCF-012-250-P可使用其他供应商的产品。
Countes 自动细胞计数仪InvitrogenC10227
NucleoSpin 组织提取试剂盒MACHEREY-NAGEL740952.5
外周血单个核细胞 (PBMC)ATCC PCS­800­011可使用其他供应商的产品。
RPMI 1640 培养基Biological Industries01-103-1A可使用其他供应商的产品。
L-谷氨酰胺溶液 (200 mM)Biological Industries03-020-1B可使用其他供应商的产品。
青霉素-链霉素双抗溶液Biological Industries03-031-1B可使用其他供应商的产品。
胎牛血清 (FBS)， 热灭活，欧洲级Biological Industries04-127-1可使用其他供应商的产品。
MACS CD4 磁珠，人源Miltenyi Biotec130-045-101
MACS MS 分离柱Miltenyi Biotec130-042-201
抗人 CD4 FITC 抗体Biogems06121-50
小鼠 IgG1 同型对照 FITC 抗体Biogems44212-50
抗人 CD3 抗体 (OKT3)Tonbo biosciences40-0037
抗人 CD28 SAFIRE 纯化抗体Biogems10311-25
重组人 IL2Peprotech200-02
重组人 IL4Peprotech200-04
重组人 IL12 p70Peprotech200-12
体内应用级抗人 IL-4 抗体 (MP4-25D2)Tonbo40-7048
LEAF 纯化抗人 IFN-γ 抗体BioLegend506513
氯化钠 (NaCl)，分析纯Carlo Erba479687可使用其他供应商的产品。
氯化镁六水合物，分子生物学级Calbiochem442611可使用其他供应商的产品。
EDTAMP Biomedicals800682可使用其他供应商的产品。
Tris，超纯，纯度 99.9%MP Biomedicals819620可使用其他供应商的产品。
NP-40 替代物（壬基苯基聚乙二醇）Calbiochem492016可使用其他供应商的产品。
蛋白酶抑制剂SigmaP2714该蛋白酶抑制剂混合物为粉末状。配制成 100 倍溶液时，用 1 mL 分子生物学级水溶解。
磁性固相逆转固定化磁珠：AMPure XP 磁珠Beckman63881
PCR 纯化试剂盒HyLabsEX-GP200可使用其他供应商的产品。
Nextera DNA 文库制备试剂盒（TDE1 转座酶和 TD 缓冲液）IlluminaFC-121-1030
NEBNext 高保真 2 x PCR 预混液New England BioLabsM0541
NEBNext Q5 热启动高保真 PCR 预混液New England BioLabsM0543
SYBR Green I InvitrogenS7585
 CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测 系统Bio-rad185-5200可使用其他供应商的产品。必须具备适用于微量离心管的转子。
CFX Manager 软件Bio-rad1845000
qPCR 预混液：iTaq 通用 SYBR Green 超混合液Bio-rad172-5124可使用其他供应商的产品。
Qubit 2.0 荧光计InvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒InvitrogenQ32854
微量离心管用磁力架Invitrogen12321D可使用其他供应商的产品。
带 15 mL 离心管和微量离心管转子的制冷摆动转子离心机Thermo Scientific75004527可使用其他供应商的产品。必须具备适用于微量离心管的转子。
恒温混匀仪MRC可使用其他供应商的产品。
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
High Sensitivity D1000 试剂Agilent Technologies5067-5585
4200 TapeStation 系统Agilent TechnologiesG2991AA基于胶带的电泳平台 
High Sensitivity DNA 试剂盒Agilent Technologies5067-4626用于高灵敏度 TapeStation 分析的试剂
引物名称及序列公司
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCGTCGGCAGCGTC
AGATGTG-3'		IDTAd1-noMx: 5'-P5 序列-转座酶序列-3'
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.1_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.2_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.3_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.4_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'		IDTAd2.5_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.6_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'		IDTAd2.7_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.8_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.9_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG
GCTCGGAGATGT-3'		IDTAd2.10_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'		IDTAd2.11_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'		IDTAd2.12_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.13_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.14_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.15_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.16_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
 Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.17_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
 Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.18_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.19_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
 Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.20_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
 Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.21_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.22_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.23_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'		IDTAd2.24_预期索引序列读取：5'-P7 序列-[索引序列]-转座酶序列-3'
F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT

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