一种低剂量常压等离子体处理用于葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤的神经保护应用方案。
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方法文章
一种新型常压等离子体射流在对抗SH-SY5Y细胞葡萄糖剥夺损伤中的神经保护作用应用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
近年来，大气压等离子体射流（APPJ）因其可产生多种活性氮物种（RNS）和活性氧物种（ROS）而受到来自多个学科领域研究人员的广泛关注。我们先前的研究已证实APPJ对氧化应激所致损伤具有细胞保护作用。本研究旨在提供一份详细的体外（in vitro）治疗方案，用于描述氦气APPJ在葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的神经保护应用。人源神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系在补充有15%胎牛血清的RPMI 1640培养基中维持培养。在进行APPJ处理前，将培养基更换为无葡萄糖的RPMI 1640培养基。在细胞培养箱中孵育1小时后，使用细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit 8）测定细胞活力。结果显示，与葡萄糖剥夺组相比，经APPJ处理的细胞表现出显著更高的细胞活力，且呈剂量依赖性，其中以每孔8秒为最佳处理剂量。同时，氦气气流本身对葡萄糖剥夺引起的细胞损伤无任何影响。我们的结果表明，APPJ有望作为治疗中枢神经系统中与葡萄糖剥夺相关疾病的一种方法。该方案也可拓展应用于其他不同类型损伤的细胞保护，但需重新调整细胞培养条件和APPJ处理参数，且处理剂量应相对较低。
引言
在正常生理条件下，成年大脑几乎 exclusively 以葡萄糖作为能量代谢的底物。人类大脑仅占体重的 2%，但消耗了体内约 25% 的总葡萄糖。1众所周知，葡萄糖代谢功能障碍是缺血性脑卒中以及多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）和帕金森病（PD））中的主要病理变化之一。2,3缺乏葡萄糖，或葡萄糖摄取受损，或氧化磷酸化功能障碍，均可直接影响ATP的生成，进而诱导神经细胞死亡，这可能增加神经元功能障碍的风险，提示维持细胞活力或延缓葡萄糖剥夺后的细胞损伤可能是治疗此类疾病的一种合理策略。通过调节葡萄糖代谢来研究神经保护作用，重点关注抗炎剂、离子通道调节剂、自由基清除剂、神经营养因子 等等。 一直备受关注。然而，这些神经保护策略从实验室到临床应用的转化尚未取得成功4.
大气压等离子体射流（APPJs）是一种新型的大气压低温气体放电技术，近年来受到来自多个学科领域众多研究人员的关注。APPJs 数十年来已被应用于多种生物医学领域，如癌细胞治疗、细菌失活、血液凝固、伤口愈合、口腔医学 等等。5,6，由于其会释放多种活性氮物种（RNS）和活性氧物种（ROS）（图1)7既往的等离子体生物医学应用主要集中在对细菌、细胞和组织的氧化和/或硝化应激作用8然而，APPJ 也可能是一种 "双刃剑" 由于活性氮物种（RNS）和活性氧物种（ROS）是与多种生理及病理生理过程相关的重要细胞内信号分子9一氧化氮（NO）调控多种生物过程，在人体内具有双重作用，尤其在中枢神经系统（CNS）中表现显著。低浓度的NO已显示出其神经保护活性 体外 和 体内 通过多种信号通路10我们之前的研究首次报道了氦气常压等离子体射流（APPJ）诱导的一氧化氮（NO）生成参与了APPJ对抗氧化应激损伤的神经保护作用11然而，关于APPJs对其他类型损伤的作用尚未见报道。因此，本研究旨在提供一种 体外 关于氦气常压等离子体射流（helium APPJ）在葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤中神经保护作用的治疗方案。与以往研究不同，本方案采用低剂量等离子体处理，实现神经保护效应，同时避免了过量等离子体引发的损伤，表明APPJ处理有望作为一种新型神经保护策略 "NO供体药物" 用于未来的研究，甚至临床转化。该方案还可建议用于其他类型细胞的细胞保护应用，但需重新调整APPJ处理条件，且处理剂量应相对较低。
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方案
1. APPJ装置的制备
警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。进行所有操作时，请遵循适当的安全操作规范。 实验，包括使用通风橱和个人防护装备（安全眼镜、防护手套、实验服） 等等。）。该方案需要标准的细胞操作技术（消毒、细胞复苏、细胞传代、细胞冻存、细胞染色， 等等。).
- 选择内径为1 mm、外径为3 mm的石英管。使用抛光箔将两端的横截面打磨光滑。
- 使用直径为1.0 mm的镍镀层不锈钢针作为高压电极。将其尖端研磨至曲率半径为0.05 mm。
- 在距石英管喷嘴1 cm处，用宽2 mm的铝箔包裹石英管。将不锈钢针尖固定在铝箔另一端1 cm处。将铝箔环用作低压电极。
2. 射流的获取
- 为了提供交流信号，将高压功率放大器连接到作为电源的函数信号发生器。为了记录施加到高压电极上的电压波形，将高压探头的一端连接到数字示波器，另一端连接到电源。为保护电路，使用一个2 kΩ的电阻作为保护电阻。按图2所示连接电路。
警告：切勿触碰高压线路。 - 持续将氦气（体积分数99.999%）通入石英管中，并将气体流速稳定控制在1.4标准升每分钟（SLM）。
注意：在处理细胞培养物之前，我们不使用过滤器。实验中所用氦气的体积分数为99.999%，大多数微生物在此条件下无法存活。 - 打开示波器、信号发生器和高压功率放大器的电源。将频率调节旋钮调至5 kHz，然后逐步升高电压至峰峰值6 kV。
注意：当施加在针电极上的电压峰峰值约为6 kV时，等离子体射流长度已足够（约3 cm）。
3. SH-SY5Y 细胞的制备
- 在25 cm2培养瓶中，使用添加15%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基培养SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系。将细胞置于含5% CO2和95%空气、37 °C的湿润培养箱中维持培养。
- 当细胞融合度达到85%时，小心吸除培养液，向细胞中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶 + 0.1% EDTA。
- 室温孵育15秒后，小心吸除胰蛋白酶溶液，加入2 mL含15% FBS的RPMI 1640培养基以中和反应。
- 轻柔吹打细胞，冲洗培养瓶底部，直至SH-SY5Y单层细胞完全脱落。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，用含15% FBS的RPMI 1640培养基将细胞浓度调整至2 × 105 cells/mL，然后将100 µL细胞悬液转移至96孔板的每个孔中。
- 将细胞置于细胞培养箱中贴壁12小时后，再进行APPJ处理。
4. SH-SY5Y细胞的APPJ处理
- 调节石英管喷嘴与放置96孔板平台之间的距离至3 cm。确保等离子体束能够接触到培养基表面。
注意：该距离并非从孔板底部测量，而是首先将石英管喷嘴与用于放置96孔板的平台之间的距离调整为3 cm。 - 在进行APPJ处理前，除对照孔外，将每孔中的培养基更换为不含葡萄糖的RPMI 1640培养基。
- 将孔板置于APPJ喷嘴下方，并确保等离子体射流可垂直进入各孔中。
- 分别对不同孔中的细胞进行0 s、1 s、2 s、4 s、8 s和12 s的APPJ处理。
注意：APPJ通过电离氦气产生（图1）。为排除氦气本身对细胞的影响，对因葡萄糖剥夺而受损的细胞同时进行4 s和8 s的纯氦气流处理。所有处理均应设置三个重复。
5. 细胞活力检测
注意：此步骤中不要更换培养基。
- APPJ 处理后，将细胞在细胞培养箱中孵育 1 小时。
- 向每孔中加入 10 µL 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）溶液。
- 在 37 °C 下孵育细胞 4 小时。
注意：SH-SY5Y 细胞系对葡萄糖剥夺条件敏感12。在葡萄糖剥夺 1 小时后，细胞活力下降至约 50%，此条件适用于药效学研究中的最佳细胞活力状态。CCK-8 对细胞无细胞毒性，因此在 APPJ 处理后，细胞在葡萄糖剥夺条件下继续与 CCK-8 试剂共同孵育 4 小时以检测细胞活力。经过 8 小时葡萄糖剥夺和 APPJ 处理后，APPJ 的保护作用显著减弱，因为长时间的葡萄糖剥夺导致 SH-SY5Y 细胞受到严重损伤。在葡萄糖剥夺 24 小时后未观察到存活细胞11。 - 使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。
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结果
数据以至少三次独立实验的均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析（ANOVA）对组间结果进行方差分析。所有统计分析均使用统计分析软件 Prism 进行，以 p<0.05 作为具有统计学显著性的阈值。
在CCK-8孵育4小时后测定细胞活力。如图3所示，与对照组（在含15% FBS的RPMI 1640培养基中正常培养的细胞）相比，葡萄糖剥夺使SH-SY5Y细胞的活力降低至44.1 ± 2.6%。APPJ处理以剂量依赖性方式显著提高了细胞活力，在每孔8秒的最佳剂量下，细胞活力达到62.27 ± 3.1%。气体流量对葡萄糖剥夺引起的细胞损伤无影响（Table 1）。
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讨论
SH-SY5Y 细胞是一种来源于人神经母细胞瘤的细胞系，被广泛用作研究神经生物学和神经退行性疾病的合适细胞模型 体外 神经毒性或神经保护研究12SH-SY5Y 细胞系对葡萄糖剥夺条件敏感。在葡萄糖剥夺1小时后，细胞活力下降至近50%，此条件适用于药效学研究中的最佳细胞活力状态。此外，CCK-8试剂对细胞无细胞毒性，经APPJ处理后，细胞在葡萄糖剥夺条件下继续与CCK-8试剂共孵育4小时以检测细胞活力。本研究中，我们提供了一项详细的 体外 关于大气压等离子体射流（APPJ）在葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤中神经保护作用的治疗方案。
修改与故障排除
若各孔中颜色发生显著变化，CCK-8孵育时间可相应缩短。但若SH-SY5Y细胞密度低于1 x 104 每孔细胞，在葡萄糖剥夺和APPJ处理后细胞将死亡。建议在确保等离子体束能够接触培养基表面的前提下，降低气体流速。APPJ也可用于其他神经元相关细胞系（HT-22、neuro-2A，甚...
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披露
本文未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由北京神经外科研究所创新基金（2014-11）、国家自然科学基金（编号：11475019 和 81271286）以及北京市自然科学基金（编号：7152027）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SH-SY5Y细胞系 | 中国典型培养物保藏中心 | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 21875091 | 4℃保存 °C |
| 无葡萄糖 RPMI 1640 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11879020 | 4 ℃ 保存 °C |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 16000044 | 储存于 -20 °C |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Solarbio | T1300 | 4 ℃下保存 °C |
| 96孔板 | corning | 3599 | |
| 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | Dojindo Laboratories | CK04 | 4 ℃ 保存 °C |
| 微孔板读板机 | Tecan | M200 Pro | 用于在 450 nm 处测量吸光度 |
| 高 – 电压功率放大器 | 跋涉 | PD06087 | 用于增强功率 |
| 函数信号发生器 | MaZe Electronics Science&与技术 | AT30120 | 用于提供特异性信号 |
| 高 – 电压探针 | Tektronix | P6015A | 用于检测高电压 |
| 数字示波器 | Tektronix | DPO4104B | 用于显示信号 |
参考文献
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重印与许可
