本方案描述了一种通过肾盂将质粒DNA注射到小鼠肾脏中，以在肾脏内特异性表达外源基因的方法。
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摘要
摘要
水动力注射通过产生局部高压环境，将质粒DNA及其他物质转染到多种组织中。例如，水动力尾静脉注射是一种已建立成熟的方法，可用于肝脏的转染。本文描述了一种基于水动力原理的应用方法，即直接向小鼠肾脏注射含质粒DNA的溶液，以实现肾脏特异性的基因表达。实验过程中，小鼠经麻醉后，通过侧腹部切口暴露肾脏，并将含有质粒DNA的溶液快速注入肾盂。针头留置10秒后取出，随后缝合切口。次日可采用活体动物成像、Western blot或免疫组织化学方法检测基因表达水平，也可根据所选目的基因的特点选用其他适宜的检测方法来分析目标蛋白的表达。已有文献报道的延长基因表达的方法包括转座子介导的转基因整合以及使用环磷酰胺抑制机体对转基因的免疫反应。
引言
水动力尾静脉注射技术已成为在小鼠肝脏中实现高水平基因表达的常用方法1,2。该技术也可转染肾脏，但效率显著较低，约为肝脏的1/1003。本文所述的水动力肾盂注射方法提供了一种通过物理手段控制器官特异性表达的简便方法，其基于先前已在肝脏4,5、肌肉6及其他器官7,8中确立的水动力学原理。该方法通过压力和速度将含有DNA的液体强制导入活体动物in vivo的细胞中，从而实现细胞转染，同时会诱发器官轻微损伤，但该损伤可迅速修复9。通过成熟的外科手术技术，经侧腹切口暴露肾脏10，并使用胰岛素注射器进行单次注射，我们已成功实现了多种肾细胞类型的转染，主要包括间质成纤维细胞、肾小管和集合管11。对这些小鼠的解剖分析表明，其他器官的转染水平极低，无法通过荧光素酶成像技术检测到11。由于该技术为非病毒性方法，使用质粒DNA进行转染，可快速且简便地制备注射所需的试剂。
我们采用局部水动力注射法，在肾脏中表达了抗氧化酶谷胱甘肽S-转移酶A4、类胰岛素生长因子-1受体以及激素促红细胞生成素，均产生了预期的生物学效应11,12,13已对给药途径、注射体积、DNA剂量和启动子选择进行了详细评估11此外，两者均 piggyBac 转座子系统和/或环磷酰胺处理已被证明可通过抑制对转基因的免疫反应，改善长期基因表达效果11其他研究者已成功采用经肾静脉途径在大鼠中实现高效转染，并维持超过一个月的较长转染时间14然而，模拟人类疾病的表型进行基因校正通常首先在小鼠中进行概念验证，因为大多数哺乳动物遗传模型均为小鼠模型。我们比较了肾静脉注射与肾盂注射，发现肾盂注射在基因表达（约高出十倍）和存活率方面均优于肾静脉注射11肾盂是进入肾脏的理想途径，因为它具有足够的弹性，能够耐受尿液生成量的波动，即使在肾积水导致扩张的情况下，通常也能保持其结构完整性。此外，通过肾盂注射可避免穿刺肾脏包膜，使注入的液体能更明显地被肾脏保留，效果优于肾实质内注射。其他小鼠器官通常没有除血管系统以外的给药途径，而肾脏的尿液腔则是一个理想的注射部位。相比之下，经肾静脉注射则容易导致血液泄漏至腹腔。通过磁共振成像估算，野生型小鼠肾脏的总体积约为0.2 cm³。3因此，单个肾脏的体积约等于经肾盂水动力注射所注入的液体量（100 µL）15本文提供了实现肾脏可重复转染的水动力肾盂注射方案的全部详细技术要点。
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方案
本文所述所有方法均已获得贝勒医学院和范德堡大学医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 准备用于注射的 DNA 溶液
- 谨慎选择用于表达目的基因的质粒，以最大化有利特性，从而提高转染效率和目的基因的表达水平。
注意：通过水动力肾盂注射法递送表达荧光标记蛋白 TdTomato、激素促红细胞生成素（Epo）以及萤火虫荧光素酶的质粒已有文献报道11。若缺乏针对该目的基因的成熟转染效率检测方法，可通过向稀释后的注射用 DNA 中加入 10 µg 表达萤火虫荧光素酶（如增强型萤火虫荧光素酶）的质粒，进行活体动物荧光成像以评估转染效率。- 选择适用于实验目的的最小质粒。
注意：小质粒通常比大质粒更易实现高效细胞转染。例如，Zeomycin 抗性基因和 R6K 复制起点体积较小，因此在质粒骨架中使用这些元件可减小质粒总大小。 - 使用哺乳动物启动子驱动目的基因的表达。
注意：所选启动子将影响被转染的肾细胞类型、基因表达持续时间及表达强度。参见 Woodard et al. 对巨细胞病毒启动子（CMV；组成型病毒启动子）、延伸因子-1α（EF-1α；组成型内源启动子）、γ-谷氨酰转移酶启动子（γGT；肾小管特异性启动子）和足细胞特异性启动子（podocin，NPHS2）的比较研究11。 - 若需实现较高的长期基因表达水平，可采用非病毒整合系统（如转座子系统）11,16。对于注射后 5 天内进行早期检测的研究，无需目的基因整合。
- 选择适用于实验目的的最小质粒。
- 使用商业试剂盒（如无内毒素大提试剂盒）制备用于注射的质粒 DNA，并严格避免实验器具引入内毒素。
注意：DNA 溶液中若存在内毒素，将引发实验动物严重的免疫反应，可能破坏实验结果甚至导致动物死亡。- 完成最后一次 DNA 纯化洗涤步骤后，通过肉眼观察和气味判断是否残留乙醇。使用加样枪头移除可见液滴，并将含有 DNA 沉淀的离心管倒置于室温或 37–60 °C 烘箱中的实验室专用擦拭纸上干燥（需持续监控）。待乙醇完全挥发后立即重悬沉淀，防止沉淀过度干燥。
注意：残留乙醇会干扰分光光度计对 DNA 浓度的测定，且不适宜注入肾脏。 - 使用与注射相同的缓冲液（水动力递送缓冲液；100–300 µL）重悬 DNA 沉淀，以减少各组间 DNA 缓冲液化学成分的差异。
注意：切勿使用试剂盒配套的洗脱缓冲液重悬 DNA 沉淀。常见于“TE”缓冲液中的螯合剂 EDTA 可能影响肾脏和心血管功能。根据沉淀大小，使用 100–300 µL 水动力递送缓冲液洗脱，以获得高浓度 DNA。最终稀释后 DNA 的浓度应在 100 ng/µL（每只小鼠剂量 10 µg）至 500 ng/µL（每只小鼠剂量 50 µg）之间，因此储备 DNA 浓度应高于此范围。 - 充分重悬 DNA 沉淀。将沉淀置于原离心管中，加入水动力递送缓冲液，在室温下静置至少 1 小时，或在 4 °C 下过夜，再转移至无菌微量离心管，以确保 DNA 完全溶解。
- 使用分光光度计或其他成熟方法测定质粒 DNA 浓度。
注意：应至少进行两次重复测定，必要时增加重复次数。若 260/280 比值低于 1.8，表明制备物被 RNA 或其他物质污染，应弃用并重新制备 DNA。 - 将重悬于注射缓冲液中的质粒 DNA 储存在 -20 °C 手动除霜冰箱内的盒子中，以防止 DNA 降解。
注意：按此方式储存，DNA 制剂可保存多年。通过限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性：若电泳条带呈拖尾状，表明 DNA 已降解，不可使用；若出现清晰、大小正确的条带，则可用于注射。
- 完成最后一次 DNA 纯化洗涤步骤后，通过肉眼观察和气味判断是否残留乙醇。使用加样枪头移除可见液滴，并将含有 DNA 沉淀的离心管倒置于室温或 37–60 °C 烘箱中的实验室专用擦拭纸上干燥（需持续监控）。待乙醇完全挥发后立即重悬沉淀，防止沉淀过度干燥。
- 准备用于肾盂注射的稀释质粒 DNA 溶液。
注意：需仔细设计对照组。在多数研究中，应设置未经处理（naïve）和仅注射缓冲液的对照组，因为注射操作本身可能造成组织损伤并影响实验结果11。- 在实验台面上将溶于水动力递送缓冲液的无内毒素 DNA 在室温下解冻。
- 计算注射所需 DNA 用量，并为每组准备相应的稀释 DNA 溶液。每只小鼠注射 10–50 µg 质粒 DNA，用水动力递送缓冲液补足至总体积 100 µL。
注意：以下为示例，计算向 3 只小鼠注射每只 10 µg DNA（储备液浓度为 0.5 µg/µL）所需的溶液配制。- 准备比实际需要量多约 20% 的溶液，以补偿加样时的损耗及针头内的死体积。对于 3 只小鼠，按 3.5 倍量配制。计算溶液中应含有的 DNA 总质量（µg）：10 µg × 3.5 = 35 µg。
- 计算每只小鼠注射 100 µL 所需的总溶液体积：100 µL × 3.5 = 350 µL。
- 计算需加入的储备质粒 DNA 体积：35 µg ÷ 0.5 µg/µL = 70 µL。
- 计算需加入的缓冲液体积：用总稀释液体积（步骤 1.3.2.2）减去加入的储备 DNA 体积（步骤 1.3.2.3）：350 µL - 70 µL = 280 µL 水动力递送缓冲液。
- 在实验台面上，使用无菌技术及市售带滤芯的移液枪头，在无菌微量离心管中配制溶液。
注意：DNA 溶液可在室温下配制并存放，供当日注射使用。切勿注射低温溶液，以免降低动物体温；但无需预热。
2. 进行水动力肾盂注射手术
- 仔细选择用于手术的小鼠。
注意：目前尚未观察到品系特异性差异，但可能存在。大多数注射操作均在 C57BL/6 或 FVB 背景小鼠上进行。肾盂注射在 6–12 周龄的小鼠中效果最佳。在大于 16 周龄的小鼠中，由于不明原因，荧光素酶成像显示失败率可能高达 50%。在尾静脉水动力注射肝脏实验中也观察到类似的年龄相关失败率，提示这可能是与水动力注射原理相关的一般性限制。同理，已有研究显示，在纤维化大鼠肝脏中进行尾静脉水动力注射的效果不如健康肝脏，因此在肾纤维化情况下，肾盂水动力注射的效果也可能降低，但尚未直接验证17。 - 准备小鼠和含 DNA 的注射器用于手术。
- 使用氯胺酮和赛拉嗪对小鼠进行麻醉。
- 穿戴动物设施要求的适当个人防护装备，例如一次性实验围裙、外科口罩和丁腈手套。
- 每次处理 2–4 只小鼠，使用精度为 0.1 g 的天平，在 500 mL 塑料烧杯中称量每只小鼠的体重。根据每只小鼠的体重，计算应通过腹腔注射给予的 24 mg/mL 氯胺酮和 2 mg/mL 赛拉嗪（用 0.9% 生理盐水稀释）的正确剂量（有关腹腔注射的更多内容，请参见参考视频）18。使用公式（50 µL + (5 µL) × 体重(g)），或在与当地兽医团队和 IACUC 协商后采用其他公式进行计算。
- 采用标准技术进行腹腔注射。将小鼠置于纸桶中，直至其无法自主活动。
注意：当小鼠对脚趾夹捏测试不再产生反应时，即表示已准备好接受手术。若小鼠仍对脚趾夹捏测试有反应，则在初次注射后 20–30 分钟追加 20–60 µL 麻醉剂，追加剂量取决于反应强度。 - 将小鼠置于覆盖蓝色垫布的循环水加热垫上，并在双眼涂抹兽用眼膏，以防止角膜干燥。
- 使用专用于宠物美容的剃毛器，剃除小鼠背部左侧从肩部到臀部、侧腹至脊柱区域的毛发。清除松散的毛发和碎屑。
- 为每只麻醉后的小鼠准备一支独立的注射器，内含 100 µL 稀释后的 DNA 溶液，确保无气泡。
- 使用无安全装置、针头永久固定的无菌 29G × ½" 0.5 mL U-100 胰岛素注射器。
注意：注射器类型至关重要。该规格可实现快速注射。针头永久固定可防止溶液泄漏。若带有安全装置，将妨碍进入肾盂。材料表中指定的注射器在注射过程中比其他测试品牌更顺畅。 - 将注射器吸取至约 120 µL，然后下拉活塞在顶部留出空间。用笔轻敲注射器，使所有气泡上升至顶部。针头朝上，小心下压活塞，排出所有空气，直至针尖出现液滴。注射器内不应有任何可见气泡，否则可能导致空气栓塞，致动物死亡。
- 继续下压活塞，将注射器内液体调整至 100 µL，多余 DNA 溶液排回原微量离心管中。必要时小心标记，并将装填好的注射器置于无菌洞巾上以保持无菌状态，特别是在不允许针头回套的实验场所。
- 使用无安全装置、针头永久固定的无菌 29G × ½" 0.5 mL U-100 胰岛素注射器。
- 使用氯胺酮和赛拉嗪对小鼠进行麻醉。
- 进行注射手术。
- 准备手术区域。在加热垫上覆盖无菌洞巾，并将无菌手术器械放置于无菌洞巾上，避免触碰。取出小鼠并置于视野范围内。调节照明以充分照亮操作区域。
- 从包装中取出三片 3.15% 葡萄糖酸氯己定与 70% 异丙醇皮肤消毒棉片，并放置于动物附近。
- 更换为无菌外科手套。从切口部位开始，以环形方式使用新的氯己定/酒精棉片对动物皮肤擦拭三次。
- 根据图 1A所示定位切口位置。用镊子夹住皮肤，使用剪刀在距脊柱约 1 cm 处、肋骨下方进行皮肤层切口。当切口长度约为 1 cm 时，在肌肉层进行类似切口。
注意：切口长度应适中，使肾脏刚好能部分突出切口并由切口固定。切口过小则无法暴露肾脏；切口过大则肾脏会反复滑回腹腔。 - 定位肾脏。
注意：肾脏可能被白色脂肪组织包裹。脾脏也位于动物左侧。这些器官的颜色可直观区分：脾脏呈深紫红色，而肾脏呈深红橙色。应避免操作脾脏，因其易破裂。 - 在不触碰肾脏的前提下，用手指对腹部施加稳定而轻柔的压力，将肾脏从腹腔中轻柔推出（见图 2C）。必要时使用闭合的镊子将其他非目标器官轻柔推回腹腔。切勿使用张开的镊子，以免损伤肾脏或其他器官。
- 当肾脏暴露于腹腔外后，轻柔分离其周围脂肪组织，直至可见肾盂——一个微小白点（见图 1B）。将多余脂肪推向一侧或必要时去除。务必避免切除位于肾脏上极附近的肾上腺或肾脏包膜。
- 使用闭合的镊子轻压肾脏右侧，使肾盂保持在视野中，右手持装填好的胰岛素注射器，使其与操作台面平行，针头对准肾盂（见图 2E）。如图 1B所示，小心将针头插入固定住的肾脏的肾盂内。
- 在 3 秒内快速注入溶液。约三分之一的肾脏区域可能变浅并呈现白色。
注意：注射后常见肾脏包膜下液体积聚及血肿形成。一定程度的组织损伤是实现可检测水平 DNA 转染所必需的。 - 保持针头原位约 10 秒，以防止溶液回流。然后小心缓慢拔出针头。通过轻拉切口并使用闭合镊子，将器官复位至腹腔内。
- 使用 5-0 可吸收缝线缝合肌肉层，打 2–4 个独立结。
- 使用 5-0 或 6-0 不可吸收尼龙缝线缝合皮肤层，打 2–4 个独立结。
注意：手术器械可在无菌玻璃珠浴中灭菌并冷却后重复使用。
图1. 水动力肾盂注射的正确切口位置与针头放置方法。 A) 切口（红线）应位于小鼠脊柱约1 cm处，并在肋骨下方约1 cm处。B) 通过侧腹切口暴露肾脏后，肾盂位于肾脏中段，呈微黄色透明/白色小点。注射时应避免扰动肾静脉、肾动脉或输尿管。将胰岛素注射器针头直接插入肾盂，深度约为0.5 cm，并在2–3秒内快速推注。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 肾盂质粒DNA水动力注射的手术步骤。 A) 用镊子夹住皮肤，使外科医生能够使用手术刀在侧腹部做一处约1 cm的切口，先切开皮肤层，再切开肌肉层。
B) 使用两把闭合的镊子撑开手术切口，尽可能在腹腔内观察到肾脏。
C) 轻柔按压腹部，不直接接触任何器官，通过侧腹切口将肾脏暴露出来。
D) 轻柔分离肾脏周围的脂肪组织，尽量减少对肾脏的扰动，以获得对肾盂的通路。
E) 按压左肾的右侧以更清楚地观察肾盂，用拇指抵住注射器推杆，将针头小心而稳固地插入肾盂。
F) 随后 <3秒注射，可在接受大部分注射液的肾区观察到灌注清除现象。G) 使用无菌紫色薇乔可吸收缝线在肌层打2-4个独立结。H) 使用无菌蓝色尼龙不可吸收缝线在皮肤层打2-4个独立结。 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 术后恢复与术后监测。
- 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）关于疼痛控制的要求，为小鼠提供镇痛药物。例如，若研究中需避免非甾体抗炎药（NSAID）相关的肾损伤，则可在术后48小时内每8-12小时皮下注射一次布托啡诺。
- 将小鼠置于加热垫上，并由研究人员看护，直至其完全恢复活动能力并能以胸卧位稳定站立。完全恢复后，将小鼠放回清洁的笼子中，笼内可放入少量来自原笼的垫料以减少应激。接受手术的小鼠不得与未经手术的小鼠同笼饲养。
注：小鼠状况会迅速改善，通常在术后24-48小时内表现出正常行为。 - 对于出现应激表现的小鼠，给予生理盐水补液并增加镇痛剂量以改善其状况。若小鼠未能迅速恢复，应测量其体重，并对体重下降超过初始体重20%的小鼠实施安乐死。对出现尿毒症或其他濒死状态的小鼠也应及时实施安乐死。可能的健康问题详见表1。
注：小鼠有时会自行拆除外部缝线，或在伤口愈合前缝线松脱。若肌肉层缝合不良而皮肤层完整，可能在切口处形成疝，表现为局部隆起。在此情况下，应尽快将小鼠置于麻醉状态（异氟烷麻醉比氯胺酮/甲苯噻嗪更快），并立即使用新的缝线修复手术部位。若不可吸收的皮肤缝线在术后10-14天后仍未脱落，应予以拆除。偶尔小鼠可能会撕咬同笼同伴的缝线或发生打斗行为。一旦发现攻击性行为，应立即将攻击者转移至单独的笼子中，并提供环境丰富化措施，以防止其伤害其他小鼠。 - 当达到健康或实验终点时，根据机构现行的安乐死标准操作规程，采用二氧化碳吸入或过量异氟烷麻醉，随后辅以颈椎脱位等二次安乐死方法对小鼠实施安乐死。
| 原因 | 起始 | 受影响小鼠数量 | 症状 | 立即行动 | 长期解决方案 | ||
| DNA 含有内毒素 | 注射后6-40小时。 | 可能会影响所有接受污染DNA制备物的小鼠。 | 呼吸困难、严重疼痛迹象、器官衰竭、死亡。 | 处死患病小鼠。使用鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate）检测每种注射成分中的内毒素。 | 使用无内毒素的质粒大提试剂盒，以及仅限无菌且全新或经氢氧化钠处理的实验器具。使用商业购买、经内毒素检测的缓冲液来稀释DNA。 | ||
| 麻醉过量 | 手术过程中，可在DNA注射之前或之后。 | 可能仅影响较年轻、体型较小或较瘦弱的小鼠。 | 停止呼吸，同时在加热垫上，排尿。 | 减少剩余小鼠的麻醉剂量。 | 仔细核对制剂和给药方案的剂量准确性。剔除发育不良个体。若怀疑剂量使用不当，应咨询兽医。 | ||
| 注射器或注射针头中的气泡 | 肾盂注射后立即进行。 | 除非所有注射器都未小心装填，否则仅影响一只小鼠。 | 呼吸急促 | 检查剩余注射器中是否有气泡迹象。 | 小心准备注射器，轻敲注射器以去除底部的气泡。改善照明条件以便更清楚地观察气泡。 | ||
| 手术部位的开放 | 注射后12-72小时 | 一只或多只小鼠。有时是整个鼠笼。 | 大面积开放性伤口，通常无其他严重症状 | 在异氟烷麻醉下，采用无菌技术小心地重复缝合以修复伤口。必要时可用生理盐水冲洗，或用剪刀修剪伤口边缘。 | 如果所有小鼠的缝线均过短或缺失，可能存在某只小鼠将其拆除的情况，因此可考虑将小鼠分笼饲养。改进缝合技术，使用独立结。 | ||
| 手术部位疝 | 注射后 48+ 小时 | 一只或多只小鼠。 | 手术部位可见隆起。 | 在异氟烷麻醉下，采用无菌技术切开已愈合的皮肤，暴露肌层疝出部位。将腹膜内器官复位，使用可吸收缝线修复肌层，并闭合创口。 | 这表明肌层缝合不佳。应改进缝合技术，使用独立结。 | ||
| 肾衰竭 | 注射后48小时以上 | 一只或更多小鼠。 | 体重减轻 >20%，可能发展为尿毒症，弓腰姿势 | 提供生理盐水，并加强或延长镇痛处理。若未观察到改善，处死受影响的小鼠。 | 改变动物的疾病状态以减轻其严重程度。减弱转基因的表达强度或使其具有可诱导性。在疾病进展的更早时间点对小鼠进行注射。 | ||
| 脓肿或感染 | 术后数天至数周 | 一只或多只小鼠。 | 可触及的脓肿或败血症体征 | 处死患病小鼠。申请尸检以确认疑似感染。 | 当手术条件和注射操作的无菌程度不足时，可能发生这种情况。所示操作步骤适用于免疫系统正常的小鼠，但在免疫功能受损的动物（如接受环磷酰胺处理的小鼠）中进行实验时，必须采取进一步的预防措施。 | ||
表1. 肾盂注射操作过程中可能遇到的潜在健康问题一览表。 尽管所列健康问题并不常见，但在操作过程中仍可能发生一些由研究者引起的错误。本表有助于预防和诊断这些健康问题，并为实施潜在的补救措施以防止未来发生此类问题提供参考。随着操作熟练度的提高，研究者可预期因该操作导致的健康问题和死亡率将极为罕见。
3. 评估注射效率和转基因效应
- 使用针对目标转基因的成熟检测方法评估转染效率。谨慎使用阳性和阴性对照，以确保检测的特异性。
注意：根据启动子的选择，小鼠在注射后的第1天转基因表达水平可能最高；通常在注射后第一周内达到峰值。 - 通过向注射用稀释DNA中加入表达荧光素酶的质粒（如增强型萤火虫荧光素酶，10 µg），进行活体动物荧光素酶成像。
- 清洁所有接触过小鼠的表面。将第一笼小鼠放入麻醉室并密封。检查麻醉剂表压以确认异氟烷是否充足；若不足，添加异氟烷至“max”刻度线。将异氟烷旋钮调至3.5，氧气调至2，启动麻醉气体流。
- 通过腹腔注射方式，向每只小鼠注射100 µL解冻的30 mg/mL荧光素。记录注射时间。
- 点击橙黄色小鼠图标启动成像设备控制软件。在“Select/Add User ID”处，从“User ID”下拉菜单中选择正确的姓名缩写，点击“OK”。在顶部菜单栏中点击“Acquisition”，从下拉菜单中选择“Autosave To…”，然后选择或创建用于保存数据的文件夹。
- 转至右下角的图像采集设置框。确认自动设置如下：Binning为medium；F/Stop在发光成像时设为1，拍照时设为8；Emission Filter设为open；Imaging Mode仅勾选Luminescent、Photograph、Overlay和Alignment。点击“initialize”初始化系统，待初始化完成后，将“Field of View”改为“E”，以同时成像五只小鼠。
- 调节麻醉管路阀门，使设备内部鼻罩输送异氟烷。将动物按预定顺序俯卧放置于成像仪内，背部朝上对准上方摄像头，以便观察肾脏区域。若需成像多笼小鼠，将下一笼小鼠放入异氟烷麻醉室。
- 在荧光素注射后5–10分钟，点击“Acquire”进行图像采集。
- 在右侧“Tool Palette”中点击“Image Adjust”。在“Color Scale”下，降低“Min”滑块，直至所有预期小鼠的肾脏区域均可见紫色信号，表明基因表达。若某些小鼠无表达信号，可再次注射100 µL荧光素，等待至少3分钟后重新成像。
- 若图像出现像素饱和，应降低曝光时间并重新采集，以获得可用于定量分析的图像，因为饱和像素会导致转染效率被低估。最低曝光时间为0.5秒。
- 若首次曝光时基因表达信号微弱，可将曝光时间延长至最长2分钟并重新采集。每次重新成像后，数据将自动保存至所选文件夹，以便后续分析使用。
- 对后续各笼小鼠重复上述成像步骤。
- 成像完成后，将小鼠从成像仪中取出，关闭气体供应。清洁麻醉室、鼻罩及成像平台，并关闭计算机程序。
注意：软件将提示“Save Dataset”，此操作保存的是对数据集所做的调整（如标尺和感兴趣区域设置），而非原始数据本身。- 点击“Yes”以保存对标尺和感兴趣区域（ROIs）的修改；点击“No”则恢复图像的原始设置。
- 进行数据分析时，打开软件，在“Tool Palette”中点击“ROI Tools”。点击圆形图标，并在下拉菜单中选择“1”，在图像窗口中创建新的感兴趣区域（ROI），表现为带四个方块的红色椭圆。将鼠标指针置于任一红色方块上并拖动，调整ROI大小以覆盖注射侧肾脏上的紫色信号区域。
- 将光标置于ROI的红色方块上，右键点击并选择“Duplicate ROI”，在图像窗口中复制一个新的ROI，并将其移至下一只小鼠的相应位置。重复此操作，直至图像中所有小鼠的注射侧肾脏均被ROI覆盖。
- 在图像上方的菜单中，将“Units”从“Counts”更改为“Radiance (Photons)”。为导出ROI数据，在“Tool Palette”中点击“ROI Tools”，然后点击铅笔/尺子图标，生成测量值表格。在后续数据分析与统计软件中，使用“Avg Radiance”作为分析指标。
- 按文献所述方法进行组织切片染色11。
注意：注射未能使整个肾脏均匀转染，因此不同切片可能反映不同的转染效率11。共注射荧光乳胶微球等微珠有助于识别预期为转基因阳性的区域（图3D）11。染色方案的优化至关重要。 - 通过Western blot检测转染肾脏中目标基因的表达。
注意：器官取材用于蛋白提取时必须在冰上操作。同样，避免仅使用器官的小片组织，因为该区域可能转染效率较低。转染在器官内分布不均，应取多个区域组织合并并混匀。已有研究表明，通过肾盂水动力注射表达促红细胞生成素的质粒可导致血细胞比容轻度升高，因此推测分泌型转基因产物可在循环中被检测到11。 - 为实现转基因的长期高效表达，可将整合型载体系统与免疫抑制剂（如环磷酰胺）联合使用。转染后数周内会出现针对转基因的免疫反应，且反应较强11。
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结果
掌握后，手术和注射技术操作简单，无需大型设备或昂贵材料。如果初次进行侧腹切口肾脏手术，建议安排一天培训时间，使用数只计划实施安乐死的小鼠进行练习，且术后不需复苏动物，因为首次尝试该手术所需时间可能远长于正常情况。或者，熟悉类似技术的研究人员可能会发现该操作相当简便。请仔细参照图1中的示意图以及图2中的图解说明。为准确确定切口位置，可将小鼠侧卧放置，术者用手指轻压其腹部，此时肾脏会因轻微腹压而在靠近脊柱处形成一个小隆起，切口应位于该区域上方（图1和图2）。切口需准确穿过皮肤和肌肉层，并保持合适大小（图1）。若切口过大，肾脏容易滑回腹腔，导致注射困难；若切口过小，则难以将肾脏推出腹腔，可能造成器官损伤。另一个关键点是针头在肾盂内的定位。术者应先用闭合的镊子轻压肾脏使其下移，然后以平...
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讨论
本方案描述了一种在肾脏中实现可重复基因表达的稳健方法。对于具备中等经验的外科操作者而言，采用该技术转染的小鼠比例可达50–100%，具体数值取决于小鼠年龄及外源基因检测方法的灵敏度。在接受piggyBac转座子的小鼠中，荧光素酶基因的表达水平在数月内均高于背景值；在免疫缺陷小鼠中，相同转座子的表达可完全维持数周11。尽管在注射位点附近区域，许多细胞对外源基因呈现强染色信号，但整体转染效率相对较低（图3D）。实现理想实验结果最关键的材料是注射用注射器本身，必须使用29G × ½"的胰岛素注射器，配备固定针头，且无任何阻碍注射的安全装置。注射过程必须迅速，控制在3秒内完成。质粒DNA制备物应高度纯净，内毒素和细菌基因组DNA含量需极低19。
可以推测，其他物质（如RNA、病毒或蛋白质）的注射也可采用类似方法进行。与肾静脉或直接肾实质注射等其他注射位点相比，肾盂作为注射入路更具优势。这些其他注射方式易导致出血且基因表...
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披露
作者声明无任何披露事项，且不存在利益冲突。
致谢
美国退伍军人事务部 [BX002797] 的职业发展奖资助了 L.E.W.，美国国立卫生研究院 [R01-DK095867] 和美国心脏协会 [15GRNT25700209] 资助了 J.C。美国国立卫生研究院 [DK093660]、美国退伍军人事务部 [BX002190] 以及范德堡肾脏疾病中心资助了 M.H.W。本研究工作得到了田纳西河谷医疗保健系统退伍军人事务部的资源和设施支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AnaSed Xylazine | 帕特森兽医用品公司 | 07-808-1947 | 麻醉剂 - 非管制物质 |
| BD 胰岛素注射器 0.5 mL 29G 1/2 英寸 | 卡地纳健康集团 | 309306 | 必需注射器 |
| Buprenex | 药剂师/兽医 | 镇痛药 - 管制药品 | |
| Dynarex 一次性毛巾巾单 | 赛默飞世尔科技 | 19-310-671 | 覆盖于加热垫上 |
| EndoFree 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12362 | 仅使用无内毒素质粒DNA |
| Endosafe 凝胶法LAL快速阳性对照品 | 查尔斯河实验室 | PC200 | 内毒素检测的阳性对照 |
| Endosafe 凝胶法LAL快速单次检测瓶 | 查尔斯河实验室 | R13500 | 内毒素检测 |
| 超细显微解剖剪 | Roboz外科器械公司 | RS-5882 | 外科手术工具 |
| Fisherbrand 即时密封灭菌袋 - 9" | 赛默飞世尔科技 | 01-812-51 | 用于外科器械高压灭菌 |
| Gaymar 循环水加热泵 | Paragon 医疗公司 | TP-700 | 水循环加热泵 |
| Germinator 500 | Roboz外科器械公司 | DS-401 | 术中重复使用外科器械 |
| Graefe 镊子 | Roboz外科器械公司 | RS-5136 | 外科手术工具 |
| Graefe 组织镊 | Roboz外科器械公司 | RS-5153 | 外科手术工具 |
| Halsey 持针器，5" 长度 | Roboz外科器械公司 | RS-7841 | 外科手术工具 |
| 加热垫 - 15" x 21" - 至少需要3个 | Paragon 医疗公司 | TP22G | 与 Gaymar 加热泵配合使用 |
| IsoFlo（异氟烷，USP） | 雅培动物健康公司 | 5260-04-05 | 用于成像和安乐死 |
| Isotec 异氟烷输送系统蒸发器 | 史密斯医疗公司 | VCT3K2 | 用于成像和安乐死 |
| 氯胺酮 | 药剂师/兽医 | 麻醉剂 - 管制药品 | |
| Kimwipes 纸巾 | 金佰利专业用品公司 | 34120 | 实验室用纸巾 |
| Living Image 软件 | Caliper 生命科学公司 | 用于活体动物成像 | |
| 荧光素 | 珀金埃尔默公司 | 122796 | 用于活体动物成像 |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | 用于DNA浓度测定的分光光度计 |
| Prevantics 消毒棉片 | 赛默飞世尔科技 | 23-100-110 | 用于皮肤手术前准备 |
| Prolene 5-0 缝线 Taper 30" | 赛默飞世尔科技 | NC0256891 | 皮肤用不可吸收缝线 |
| Puralube 品牌眼用软膏 | 帕特森兽医用品公司 | 07-888-2572 | 术中保持眼睛湿润 |
| Trans IT - QR 水动力递送溶液 | Mirus Bio 公司 | MIR-5240 | 用于稀释DNA的水动力递送缓冲液 |
| Vicryl 5-0 缝线 J303H | 赛默飞世尔科技 | NC9816710 | 肌肉层用可吸收缝线 |
| Wahl Mini Arco 电推剪 | Med-Vet 国际公司 | 8787-1550 | 皮肤准备用剃毛器 |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper 生命科学公司 | 用于活体动物成像 |
参考文献
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