利用下一代测序技术检测循环肿瘤DNA中的稀有突变

摘要

本文描述了一种用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变的技术——ER-Seq。该方法的独特之处在于采用了双向错误校正、特殊的背景过滤以及高效的分子富集。

摘要

利用下一代测序技术（NGS）对循环肿瘤DNA（ctDNA）进行分析，已成为临床肿瘤学研究的重要工具。然而，由于血液中ctDNA含量极低，该方法在实际应用中面临灵敏度不足的挑战。此外，测序及后续分析过程可能产生假阳性或假阴性结果。为了提高ctDNA检测在临床应用中的可行性与可靠性，本文介绍一种可富集稀有突变用于测序的技术——稀有突变富集测序（Enrich Rare Mutation Sequencing, ER-Seq）。ER-Seq能够在1×10⁷个野生型核苷酸中识别出单个突变，因而有望成为检测极低频遗传变异的有力工具，对研究疾病异质性具有重要意义。该方法通过独特的测序接头连接，实现了ctDNA分子的高效回收，同时能够对正链和反链进行双向错误校正。我们选用的1021 kb探针可富集12种肿瘤中超过95%的肿瘤相关驱动突变所覆盖的目标区域。这一经济高效且通用的方法，能够独特地成功积累遗传数据。在有效滤除背景错误后，ER-Seq可精确检测稀有突变。本文通过一个案例研究，详细展示了探针设计、文库构建及目标DNA捕获的方法流程，并包含了数据分析的工作流程。该方法的实施通常需要1至2天。

引言

下一代测序（NGS）是一种强大的工具，可用于探究基因组的奥秘，能够提供大量信息，从而揭示遗传变异。NGS分析在临床中的应用日益普遍，尤其在个体化医学领域。然而，NGS最大的局限性之一是其较高的错误率。尽管该技术被认为适用于研究遗传性突变，但在分析来自"液体活检"的DNA时，对稀有突变的分析受到极大限制^1，2。

循环肿瘤DNA（ctDNA）是血液中来自肿瘤细胞释放的无细胞DNA（cfDNA）。在大多数情况下，ctDNA的含量极低，使其检测与分析极具挑战性。然而，ctDNA具有诸多优势：其分离过程属于微创操作，可在肿瘤生长的早期阶段被检测到，ctDNA水平可反映治疗效果，且其携带了原发灶和转移灶中均存在的DNA突变^3,4,5。因此，随着下一代测序（NGS）技术及分析方法的快速发展，ctDNA检测的应用前景日益广阔。

尽管已采用多种高通量并行测序方法用于ctDNA检测，但由于其灵敏度低、缺乏通用性以及相对较高的成本等局限性，目前尚无任何一种方法被广泛接受用于临床常规检测^6,7,8。例如，基于唯一标识符标签（UID）的双链测序技术可通过双向共识重复纠正测序错误，从而校正大多数测序错误。然而，由于其成本高昂且数据利用率低，该方法的实际应用受到限制^9,10。类似地，CAPP-Seq及其改进版本CAPP-IDES^11,12在cfDNA检测中具有更高的实用性，但这些方法的准确性与普适性仍有待提升。

为了满足当前对ctDNA准确检测与分析的需求，我们开发了一种新策略——富集稀有突变测序（Enrich Rare Mutation Sequencing, ER-Seq）。该方法结合了以下要素：独特的测序接头，可高效回收ctDNA分子，并实现双向错误校正，能够从超过 > 1 × 10⁷ 个野生型核苷酸中识别出单个突变；1021 kb的探针，用于富集检测覆盖12种肿瘤中95%以上肿瘤相关突变的目标区域，这些肿瘤包括肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、甲状腺癌、宫颈癌、食管癌和子宫内膜癌（表1）；以及基线数据库筛选，使ctDNA中稀有突变的精确检测更加高效且简便。

为了建立基线数据库，首先通过ER-Seq技术从大量同类型的样本（初始约1000个）中找出所有基因突变。这些真实突变必须经过多种其他可靠的检测方法和分析加以验证。接着，总结假突变的模式，并将所有假突变进行聚类，以构建初始的基线数据库。随后在后续测序实验中发现的假突变应持续添加至该数据库中。因此，该基线数据库成为一个动态扩展的数据库，显著提高了测序的准确性。

为了推动肿瘤诊断与监测领域的进展，我们提出了ER-Seq，一种低成本且可行的通用数据获取方法。我们展示了一项经过ER-Seq分析的案例研究，证明了该方法在检测稀有突变方面的准确性及其在临床应用中的可行性。

方案

肿瘤标本和血液样本的获取均遵循经北京大学人民医院伦理委员会批准的方案。所有患者均签署了书面知情同意书，同意使用其样本。纳入研究的参与者需满足以下筛选标准：女性，晚期非小细胞肺癌，既往通过Sanger测序检测出EGFR p.L858R突变，接受过两轮厄洛替尼EGFR靶向治疗后疾病进展，以及应用ER-Seq技术对循环肿瘤DNA（ctDNA）进行分析，以探究耐药原因并寻找新的靶向药物。

1. 用于cfDNA和基因组DNA（gDNA）的外周血DNA提取

1. 在采集管中收集 10 mL 外周血，轻轻上下颠倒 6–8 次以混匀，避免细胞剪切。血液样本可在采集管中于 6–37 °C 条件下保存最长 72 小时。
2. 在室温下以 1600 (±150) ×g 离心 10 分钟。
3. 使用一次性移液器将上清液（血浆）从采集管转移至四个洁净的 2 mL 离心管中，离心管需适当标记，转移时勿扰动沉淀层（白细胞）。
4. 使用洁净的一次性移液器转移 1 mL 细胞至一个适当标记的 2 mL 离心管中。细胞可在进行步骤 1.8 前于 -20 °C 或更低温度保存。
5. 将血浆（来自步骤 1.3）在 4 °C 条件下以 16000 (±150) ×g 离心 10 分钟。
6. 将血浆转移至正确标记为 "plasma" 的洁净离心管中，底部保留约 0.1 mL 残留体积，以避免污染。将血浆保存于 -80 °C，直至进行步骤 1.7。
7. 使用步骤 1.6 中获得的 3 mL 血浆，采用市售试剂盒按照制造商说明书分离 cfDNA（包含 ctDNA）。
8. 使用步骤 1.3 中获得的 200 µL 白细胞，采用市售试剂盒按照制造商说明书分离 gDNA。
   注意：cfDNA 和 gDNA 均可在使用前于 -20 °C 保存。
9. 对 cfDNA 和 gDNA 进行不同的质量控制（表 2）。采用生物分析仪的标准方法进行质量控制，以评估样本降解程度和/或 gDNA 污染情况。cfDNA 提取物的质量峰形分析结果应与 图 1 相似。
   注意：cfDNA 的主峰大小约为 170 bp。请注意，增加 DNA 用量将有助于构建更高质量的文库，从而有效检测 cfDNA 中的稀有突变。建议使用至少 30 ng cfDNA（30,000 个拷贝）。

2. 文库构建

注意：关于基于片段化DNA的文库构建，循环游离DNA（cfDNA）本身以片段形式存在，其峰值大小约为170 bp，因此无需进一步片段化。

1. 通过超声处理将对照样品（基因组DNA）打断，以获得200–250 bp的片段。
   1. 在洁净的超声处理管中，将1 µg基因组DNA样品溶于100 µL Tris-EDTA缓冲液中。
   2. 设置超声程序为开启30秒、关闭30秒，共12个循环，总计12分钟。
   3. 超声处理后，取5 µL产物通过2%琼脂糖凝胶电泳分析，确认片段大小为200–250 bp。
   4. 将所有打断产物转移至新的1.5 mL离心管中，加入150 µL磁珠，室温孵育5分钟，以筛选合适大小的DNA片段。
   5. 将离心管置于磁力架上30秒，去除上清液。
   6. 保持离心管在磁力架上，用200 µL新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠，孵育30秒后去除上清液，重复一次。
   7. 将离心管盖打开，继续置于磁力架上进行空气干燥，避免磁珠过度干燥，以确保DNA有效回收。向磁珠中加入32 µL 10 mM Tris-HCl（pH 8）溶液，洗脱DNA片段，随后通过紫外-可见分光光度法进行定量。
      注意：后续实验至少需要200 ng DNA。
2. 末端修复反应
   注意：遵循试剂盒生产商的说明，并根据需要进行调整。使用30 ng cfDNA；以1 µg基因组DNA作为对照。
   1. 在无核酸酶的无菌离心管中加入7 µL反应缓冲液、3 µL酶混合液、30 ng cfDNA，并用ddH₂O补足至总体积60 µL。另取一管，加入上述相同组分，但以1 µg基因组DNA替代cfDNA。
   2. 混匀后，在未加热盖的热循环仪中于20 °C孵育30分钟，随后在65 °C孵育30分钟。完成后立即进入下一步。
3. 接头连接
   1. 向第2.2步所得混合物中加入30 µL连接主混合液、1 µL连接增强剂和4 µL独特的测序接头。
   2. 在未加热盖的热循环仪中于20 °C孵育15分钟。
   3. 涡旋振荡以重悬磁珠，并在下一步操作前将磁珠于室温放置至少30分钟。
   4. 向上述混合物中加入87 µL重悬后的磁珠，通过反复吹打充分混匀，室温孵育5分钟。
   5. 按照第2.1步所述方法对磁珠进行洗涤和空气干燥。
   6. 向磁珠中加入20 µL 10 mM Tris-HCl（pH 8）溶液，洗脱DNA目标片段。
4. 连接接头的DNA片段富集
   1. 向反应体系中加入20 µL已连接接头的DNA片段、5 µL Index引物/i7（含2.5 µL Primer-P7（10 pM）和2.5 µL Primer-P5（10 pM），用于测序）、25 µL文库扩增主混合液，并用ddH₂O补足至总体积50 µL。
   2. 对连接接头的DNA进行PCR扩增，热循环程序如下：98 °C初始变性45秒，随后进行8个循环（cfDNA）或4个循环（gDNA）的扩增（变性98 °C 15秒，退火温度未指定 °C 15秒，65 °C延伸30秒，72 °C延伸30秒），最后在72 °C延伸60秒，然后将温度保持在4 °C。
   3. 向PCR富集后的DNA中加入45 µL悬浮磁珠，以回收目标片段。
   4. 用30 µL 10 mM Tris-HCl（pH 8）溶液洗脱带有接头的DNA片段。
5. 文库质量控制
   1. 按照商业试剂盒的生产商说明书操作，测定接头连接后DNA的浓度。使用生物分析仪评估DNA质量。

3. 靶向DNA捕获

注意：靶向富集使用了一种定制的序列捕获探针，该探针专门设计用于覆盖来自12种不同类型肿瘤的已知肿瘤相关驱动突变的1021 kb靶向富集区域。以下步骤详细说明了对生产商方案的修改。

1. 封闭
   1. 取步骤2中1.5 µg的文库混合物（cfDNA最多可混合6个文库，gDNA最多可混合20个文库）、8 µL P5封闭接头(100P)、8 µL P7封闭接头(100P)以及5 µL Cot-1 DNA（1 µg/µL），加入无菌离心管中。使用真空浓缩仪在60 °C条件下将管内溶液干燥。
2. 将DNA捕获探针与文库进行杂交
   1. 向步骤3.1的离心管中加入以下组分：8.5 µL 2X杂交缓冲液、2.7 µL杂交增强剂以及1.8 µL无核酸酶的ddH₂O。
   2. 通过移液器反复吹打混匀，随后在95 °C的恒温混匀仪 中孵育10分钟。
   3. 孵育结束后，立即加入4 µL定制探针。将样品置于PCR仪中，在65 °C下孵育4小时，同时将PCR仪盖加热至75 °C。
3. DNA片段捕获
   1. 将杂交后的目标DNA与链霉亲和素磁珠孵育，随后洗涤磁珠以去除未结合的DNA。按照商品化试剂盒的说明书操作，最终获得20 µL重悬磁珠，其中包含已捕获的DNA片段。
4. 捕获DNA片段的扩增
   1. 使用商品化试剂盒，按照说明书加入2 µM骨架寡核苷酸进行PCR扩增。
   2. PCR反应完成后，直接向PCR产物中加入45 µL悬浮磁珠，并用30 µL 10 mM Tris-HCl（pH 8）洗脱，富集结合在磁珠上的扩增后目标DNA片段。
5. 使用文库定量试剂盒对DNA片段进行定量，并通过Bioanalyzer测定平均片段长度（图2）。

4. 测序

1. 使用台式测序仪对多重文库进行75 bp双端测序，运行时间为18小时。产生的总数据量最高可达60 GB，其中患者样本cfDNA需要15 GB，对照样本gDNA需要1 GB。

5. 数据分析工作流程

注意：图3展示了总体工作流程和数据分析过程。数据分析参数和命令如下所示。

1. 使用 NCfilter 过滤低质量读段，并校正错误及对 UID 进行屏蔽。
   NCfilter(own)
   NCfilter filter -l 5 -q 0.5 -n 0.1 -T 3 -G -1 fastq1 -2 fastq2
   realSeq(own)
   python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1 -2 fq2 -o 输出目录 -p 前缀 -u 4 -s 7 -m 3 -i uidFile -f。
2. 参考人类基因组 hg19（human genome 19），使用 BWA（版本 0.7.12-r1039）mem 定位测序结果，并使用基因组分析工具包（Genome Analysis Toolkit, GATK）（版本 3.4-46-gbc02625）进行重比对。
   bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
   java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g -
   Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar
   GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion -known dbsnp —
   allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -I cancerBam -I normalBam
   java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g —
   Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19 -known dbsnp
   -allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals intervals -I cancerBam -I normalBam
3. 根据模板片段的 UID 和位置对重复序列进行聚类，以校正由 PCR/测序引入的错误碱基，并修正碱基质量。
   realSeq(own)
   python realSeq/bin/realSeq CLUSTER -b unmarkdup_sort_merge.bam -r chipRegion -o output_dir -p
   前缀 -m 6
4. 使用 BWA mem 对聚类后的重复序列重新比对。
   bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
5. 使用 GATK（版本 3.4-46-gbc02625）进行局部重比对，随后进行碱基质量分数的重新校准。
   局部重比对：java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g -Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion -known dbsnp -allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -I cancerBam -I normalBam
   java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g -Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19 -known dbsnp -allowPotentiallyMisencodedQuals -targetIntervals intervals -I cancerBam -I normalBam
   碱基质量分数重新校准：java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g -Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion -knownSites dbsnp -knownSites cosmic -allowPotentiallyMisencodedQuals -nct 10 -I bam -o grp java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g -Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads -I bam -BQSR grp -o outbam -R hg19 -nct 8 -allowPotentiallyMisencodedQuals
6. 对于 SNV（单核苷酸变异）和 INDEL（小片段插入或缺失）检测，通过 GSR（Good Support Reads）进一步确认低频突变的准确性，要求正链和反链读段对均支持，并通过对照组（种系突变）和基线数据库进行过滤。
   realDcaller(own)
   python realDcaller -f hg19 -r chipRegion -C baselineDB -O -L 2 cancerBam normalBam -p 30
7. 使用基线样本作为对照进行 CNV（拷贝数变异）检测。
   NCcnv(own)
   python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir -r chipRegion cnv --normgt normalBam --tumgt cancerBam --repdb repeatMarsk
8. 对未比对、剪切及不一致配对的读段进行重比对，以检测 SV（结构变异）。
   NCsv(own)
   python NCsv -t tmpdir -r hg19 -o outputdir -x transcript -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam

结果

ER-Seq 中使用的 1021 kb 探针富集的目标区域见表 1，其覆盖了 12 种常见肿瘤中超过 95% 的基因突变。这些探针的广泛覆盖范围使得该技术适用于大多数癌症患者。此外，我们独特的测序接头和基线数据库筛选方法可实现对稀有突变的精确诊测。

由于从外周血中提取的基因组DNA（gDNA）和游离DNA（cfDNA）具有不同的特性，其数据质量存在差异，具体取决于所使用的不同仪器和质量控制方法，如表2所示。成功提取的cfDNA在生物分析仪质控分析中应显示约170 bp的主峰，如图1所示。出现较大片段提示存在基因组DNA污染，最终产物中不应含有此类污染。本患者样本提取的DNA在质量和数量上均满足ER-Seq检测要求（cfDNA - 42.6 ng；gDNA - 3.426 µg）。

讨论

循环肿瘤DNA（ctDNA）的存在早在30多年前即被发现，然而ctDNA分析在临床实践中仍未成为常规应用。随着ctDNA检测与分析技术的发展，人们对ctDNA方法实际应用的兴趣日益增加。利用ctDNA进行肿瘤监测为评估微小残留病灶、治疗反应以及在肿瘤进化和瘤内异质性背景下肿瘤的分子特征提供了微创手段^13,14。分析灵敏度和特异性的提升将促进上述各项应用的发展^15,16。

在本研究中，我们介绍了ER-Seq这一有前景的方法，旨在提高循环肿瘤DNA（ctDNA）检测的灵敏度，并以非小细胞肺癌（NSCLC）病例为例进行说明。与传统分析方法相比，ER-Seq中使用独特的测序接头显著提高了检测的灵敏度和特异性，表现为测序覆盖深度增加以及能够检测到低频突变（例如EGFR p.T790M（0.53%））。该患者样本中T790M的存在可能是导致厄洛替尼耐药的因素之一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QIAamp 循环核酸提取试剂盒	Qiagen	55114	外周血cfDNA的DNA提取
QIAamp DNA Blood Mini 试剂盒	Qiagen	51105	外周血gDNA的DNA提取
Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen	Q32854	测定cfDNA浓度
Quant-iT dsDNA BR 检测试剂盒	Invitrogen	Q32853	测定文库浓度
Agilent DNA 1000 试剂	Agilent	5067-1504	测定cfDNA和文库片段
NEBNext UltraII DNA 文库构建试剂盒（适用于Illumina）	NEB	E7645L	文库构建
Agencourt SPRIselect 试剂	Beckman	B23317	DNA片段筛选与纯化
Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML	Sigma	93283	溶解
xGen Lockdown 探针	IDT	——	xGen 定制探针
人Cot-1 DNA	Life	15279-011	靶向DNA捕获
Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠	Life	65305	靶向DNA捕获
xGen Lockdown 试剂	IDT	1072281	靶向DNA捕获
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	KAPA	KK2602	捕获后PCR扩增文库
KAPA 文库定量试剂盒	KAPA	KK4602	测定文库浓度
NextSeq 500 高输出试剂盒 v2（150个循环）	illumina	FC-404-2002	测序
Centrifuge5810	eppendorf	5810
Nanodrop8000	Thermo Scientific	8000	测定gDNA浓度
Qubit 2.0	Invitrogen		定量
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent
ThermoMixer C	eppendorf		孵育
16管DynaMagTM-2 磁力架	Life	12321D
Concentrator plus	eppendorf
PCR	AB	simplyamp
QPCR	AB	7500Dx
NextSeq 500	illumina