本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外 或经荧光分选后移植至新生小鼠新皮层，用于细胞命运决定的研究，或用于治疗应用。
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本文内容
摘要
摘要
GABA能皮层中间神经元是一类具有异质性的细胞群体，在调控兴奋性锥体神经元输出以及同步化锥体神经元集群活动方面发挥关键作用。中间神经元功能缺陷已被认为与多种神经精神疾病相关，包括精神分裂症、自闭症和癫痫。通过胚胎干细胞衍生皮层中间神经元，不仅有助于研究其发育过程和功能特性，还能揭示与中间神经元相关疾病发病机制有关的分子通路。此外，中间神经元在移植后表现出显著的存活、迁移及整合入宿主皮层神经环路的能力，使其成为细胞治疗的理想候选细胞。本文介绍一种可扩展、高效率的改良型拟胚体转单层培养方法，用于从小鼠胚胎干细胞（mESCs）中获得表达Nkx2.1的中间神经元前体细胞及其后代细胞。利用携带Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP双报告系统的mESC细胞系，可通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出Nkx2.1阳性前体细胞或其表达Lhx6的终末分化后代，并进一步应用于多种下游实验。我们还提供了富集小清蛋白（PV）或生长抑素（SST）中间神经元亚群的方法，这些方法可能有助于命运决定机制的研究，或适用于需要特定中间神经元亚群富集移植的治疗应用。
引言
在小鼠和人类中，大约一半的皮层抑制性中间神经元（CIns）起源于一种称为内侧神经节隆起（MGE）的短暂性皮层下结构，其中CIns及其他神经元和胶质细胞亚群的神经上皮前体细胞表达转录因子Nkx2.11,2。CIn亚群或亚型由其形态学、神经化学、电生理学及连接特性共同定义3,4。源自MGE的CIns可根据是否表达PV或SST分为基本无重叠的亚群，而PV或SST的表达与特定的电生理特性及连接倾向相关5。中间神经元功能障碍，尤其是PV亚群的功能障碍，已被认为与多种神经精神疾病相关6,7。本方法的总体目标是生成富集PV或SST中间神经元命运的干细胞来源的有丝分裂前体细胞和迁移前体细胞，用于研究皮层中间神经元生物学及其在细胞治疗中的应用。
我们开发了一种可扩展且高效的方案，用于从小鼠胚胎干细胞（mESCs）中诱导生成表达 Nkx2.1 的中间神经元前体细胞及其子代细胞。利用一种携带 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 双报告系统的 mESC 细胞系
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方案
注意：本实验方案中描述的双报告基因小鼠胚胎干细胞系可应要求提供（sande@mail.med.upenn.edu）。
1. 培养基制备
注意：在细胞培养中使用前，将所有培养基预热至 37 °C。
- 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基（配制500 mL）
- 将50 mL胎牛血清（FBS）加入449 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。
- 过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）。培养基可于4 °C保存至多1个月，或分装后于≤ -20 °C保存。
- N2培养基（配制500 mL）
- 将5 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（100倍浓度）和500 µL 2-巯基乙醇（55 mM）加入489.5 mL DMEM/F-12培养基（DMEM:营养混合物F-12），使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。
- 过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）和5 mL N2补充剂-B。培养基避光于4 °C保存，至多可保存1个月。
- 无血清生长培养基（KSR）（配制500 mL）
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结果
本文所述方案是我们已发表方案15,16,17的改进版本，已针对我们所用的Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP双报告基因mESC细胞系进行了优化。从DD0-5开始添加Wnt抑制剂XAV-939，并在DD8时重新铺板，可实现稳定的Nkx2.1诱导，其中培养物中超过50%的DAPI+细胞核同时表达Nkx2.1（图1A，B）。对mCherry和GFP报告基因进行免疫组织化学染色显示，在Nkx2.1免疫反应阳性区域中报告基因表达清晰（图1A）。利用内源性报告基因对活细胞进行流式细胞分选（FACS），可明确分离出四类细胞：（1）GFP/mCherry双阴性细胞，（2）仅表达mCherry的细胞，（3）仅表达GFP的细胞，以及（4）GF.......
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讨论
尽管该方法在模式化 J1 来源的小鼠胚胎干细胞（mESC，SCRC-1010）方面效果显著，但我们在其他 mESC 系及克隆分离株中获得的成功程度不一。例如，Foxg1::venus mESC（EB3 来源；Danjo 等13）对该方案反应较差，使用 DD12 诱导 Foxg1 的效率通常仅为 1–2%。出于尚不完全清楚的原因，另一个同时分离获得的 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 双报告克隆（称为 JQ59），在与本方案所述细胞系（称为 JQ27）完全相同的培养条件下，其表达 Nkx2.1 的细胞比例不足 1%。然而，亲本细胞系（J1；ATCC SCRC-1010）对该方案响应良好，在 DD12 阶段产生的 Nkx2.1 阳性细胞比例与图 1B所示结果相似。如有必要，可调整 XAV-939 和 SHH/SAG 的浓度，以针对不同细胞系优化分化条件。但我们在使用该方案将其他 mESC 系分化为类似内侧神经节隆起（MGE）前体细胞方面的经验仍然有限。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢许青开发了Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP双报告mESC细胞系，同时感谢Jennifer Tyson、Asif Maroof和Tim Petros在本实验方案早期开发过程中提供的帮助。我们还感谢CHOP流式细胞术核心设施提供的技术协助。本研究得到了NIH R01 MH066912（SA）和F30 MH105045-02（DT）项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 瓶顶式真空过滤系统 | 康宁 | CLS430769 | |
| 带 snap cap 细胞筛的试管 | ThermoFisher | Corning 352235 | |
| 小鼠胚胎成纤维细胞（CF-1 MEF IRR 7M） | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 小瓶 7M MEFs 可用于四块 10 cm 组织培养板。参考文献： <上标 class="xref">29,35 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | 又称抗菌剂。请勿与基础培养基一同过滤——应在过滤后添加。参考文献： <上标 class="交叉引用">9,11,36,37 |
| N2 补充剂-B | Stemcell Technologies | 7156 | 不要用基础培养基过滤——过滤后再添加 |
| Glutamax（100倍浓缩液） | ThermoFisher | 35050061 | 也称为 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。参考文献： 9,<上标 class="xref">11,38,<上标 class="xref">39 |
| KnockOut血清替代物 (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | 也称为无血清培养基添加剂。参考文献： 9,<上标 class="交叉引用">11 |
| L-谷氨酰胺（100倍） | ThermoFisher | 25030081 | |
| MEM-NEAA（100倍） | ThermoFisher | 11140050 | |
| 2-巯基乙醇 | ThermoFisher | 21985023 | |
| KnockOut DMEM | ThermoFisher | 10829018 | 也称为不含谷氨酰胺的DMEM。参考文献： 9,11 |
| Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | 也称为干细胞级 FBS。参考文献： <上标 class="交叉引用">9,<上标 class="交叉引用">11 |
| 组织培养处理培养皿（10 cm） | BD Falcon | 353003 | |
| 非黏附性无菌培养皿（10 cm） | VWR | 25384-342 | |
| 白血病抑制因子（mLIF） | Chemicon | ESG1107 | 不要冷冻，4°C 保存。参考文献： <上标 class="xref">9,<上标 class="交叉引用">11 |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330032 | |
| 0.1% 明胶溶液 | ATCC | ATCC PCS-999-027 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma | L2020 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P6282 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%） | ThermoFisher | 25300054 | |
| Accutase | ThermoFisher | A1110501 | 也称为不含胰蛋白酶的细胞解离试剂。参考文献： <上标 class="xref">9,<上标 class="xref">11 |
| RQ1 无 RNase DNase | Promega | M610A | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | 用DMSO重悬，并在-80°C下分装保存，每份仅供一次性使用 |
| XAV939 | Stemgent | 04-0046 | 用DMSO重悬，并在-80°C下分装保存，每次使用一份 |
| rhFGF-2 | R&D Systems | 233-FB | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，并分装成单次使用量，于 -80°C 保存 |
| rhIGF-2 | R&D Systems | 291-G1 | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，并在 -80°C 下分装保存，每次使用一份 |
| ROCK抑制剂（Y-27632） | Tocris | 1254 | 用DMSO重悬，并分装成单次使用量，于-80°C保存 |
| Smo激动剂（SAG） | Millipore | 566660-1MG | 用 H₂O 重悬，并分装成单次使用量后于 -80°C 保存 |
| rm Sonic Hedgehog/SHH | R&D Systems | 464-SH-025 | 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，并分装为单次使用量，于 -80°C 保存 |
| PKCζ 伪底物抑制剂，肉豆蔻酰化 | EMD Millipore | 539624 | 用 H₂O 重悬，并以单次使用分装量在 -80°C 下保存 |
参考文献
- Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696....
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