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方法文章

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

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DOI：

10.3791/56358

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2017年12月3日

 , 
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外 或经荧光分选后移植至新生小鼠新皮层，用于细胞命运决定的研究，或用于治疗应用。

摘要

GABA能皮层中间神经元是一类具有异质性的细胞群体，在调控兴奋性锥体神经元输出以及同步化锥体神经元集群活动方面发挥关键作用。中间神经元功能缺陷已被认为与多种神经精神疾病相关，包括精神分裂症、自闭症和癫痫。通过胚胎干细胞衍生皮层中间神经元，不仅有助于研究其发育过程和功能特性，还能揭示与中间神经元相关疾病发病机制有关的分子通路。此外，中间神经元在移植后表现出显著的存活、迁移及整合入宿主皮层神经环路的能力，使其成为细胞治疗的理想候选细胞。本文介绍一种可扩展、高效率的改良型拟胚体转单层培养方法，用于从小鼠胚胎干细胞（mESCs）中获得表达Nkx2.1的中间神经元前体细胞及其后代细胞。利用携带Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP双报告系统的mESC细胞系，可通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出Nkx2.1阳性前体细胞或其表达Lhx6的终末分化后代，并进一步应用于多种下游实验。我们还提供了富集小清蛋白（PV）或生长抑素（SST）中间神经元亚群的方法，这些方法可能有助于命运决定机制的研究，或适用于需要特定中间神经元亚群富集移植的治疗应用。

引言

在小鼠和人类中，大约一半的皮层抑制性中间神经元（CIns）起源于一种称为内侧神经节隆起（MGE）的短暂性皮层下结构，其中CIns及其他神经元和胶质细胞亚群的神经上皮前体细胞表达转录因子Nkx2.11,2。CIn亚群或亚型由其形态学、神经化学、电生理学及连接特性共同定义3,4。源自MGE的CIns可根据是否表达PV或SST分为基本无重叠的亚群，而PV或SST的表达与特定的电生理特性及连接倾向相关5。中间神经元功能障碍，尤其是PV亚群的功能障碍，已被认为与多种神经精神疾病相关6,7。本方法的总体目标是生成富集PV或SST中间神经元命运的干细胞来源的有丝分裂前体细胞和迁移前体细胞，用于研究皮层中间神经元生物学及其在细胞治疗中的应用。

我们开发了一种可扩展且高效的方案，用于从小鼠胚胎干细胞（mESCs）中诱导生成表达 Nkx2.1 的中间神经元前体细胞及其子代细胞。利用一种携带 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 双报告系统的 mESC 细胞系8，可通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出表达 Nkx2.1 的前体细胞或其表达 Lhx6 的终末分裂后子代细胞，并进一步用于多种下游应用。通过调控多个信号通路、培养时长以及神经发生模式，我们能够获得数百万个带有荧光标记的中间神经元前体细胞，适用于多种后续实验操作。

尽管已有多种其他方法可用于从mESCs生成类似MGE的前体细胞9,10,11,12,13,14，但我们的方法利用Wnt拮抗剂XAV-939，能够高效地生成共表达Foxg1/Nkx2.1的端脑前体细胞。此外，通过双报告系统对中间神经元前体细胞或其有丝分裂后表达Lhx6的子代细胞进行筛选，显著增强了生成不同类型前体细胞及其子代的能力。

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方案

注意：本实验方案中描述的双报告基因小鼠胚胎干细胞系可应要求提供（sande@mail.med.upenn.edu）。

1. 培养基制备

注意：在细胞培养中使用前，将所有培养基预热至 37 °C。

  1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基（配制500 mL）
    1. 将50 mL胎牛血清（FBS）加入449 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。
    2. 过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）。培养基可于4 °C保存至多1个月，或分装后于≤ -20 °C保存。
  2. N2培养基（配制500 mL）
    1. 将5 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（100倍浓度）和500 µL 2-巯基乙醇（55 mM）加入489.5 mL DMEM/F-12培养基（DMEM:营养混合物F-12），使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。
    2. 过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）和5 mL N2补充剂-B。培养基避光于4 °C保存，至多可保存1个月。
  3. 无血清生长培养基（KSR）（配制500 mL）
    1. 将75 mL无血清培养基补充剂、5 mL L-谷氨酰胺（100倍浓度）、5 mL MEM非必需氨基酸（MEM-NEAA）（100倍浓度）和500 µL 2-巯基乙醇（55 mM）加入413.5 mL不含谷氨酰胺的DMEM中，使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。
    2. 过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）。培养基于4 °C保存，至多可保存1个月。
  4. 小鼠胚胎干细胞培养基（配制500 mL）
    1. 将75 mL干细胞级胎牛血清（FBS）、5 mL MEM-NEAA（100倍浓度）、5 mL L-谷氨酰胺（100倍浓度）和500 µL 2-巯基乙醇（55 mM）加入413.5 mL不含谷氨酰胺的DMEM中，使用500 mL 0.22 µm孔径滤器过滤。
    2. 过滤后加入1 mL抗菌剂（50 mg/mL）。培养基避光于4 °C保存至多1个月，或分装后于≤ -20 °C保存。

2. 培养小鼠胚胎干细胞（mESCs）

  1. 将有丝分裂失活的MEF饲养细胞以3-4 × 104 个细胞/cm2 的密度接种于组织培养处理过的培养皿中，使用MEF培养基。在接种mESCs前，于37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2 的细胞培养箱中孵育至少12小时，使其充分贴壁。若未立即使用，每3天更换一次MEF培养基。若接种后7天内未使用，应丢弃MEF细胞。
  2. 将mESCs（接种密度为1-4 × 104 个细胞/cm2）加入含小鼠白血病抑制因子（mLIF）（1,000 U/mL）的mESC培养基中，接种至MEF培养皿。于37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2 条件下孵育细胞。
  3. 当培养皿中细胞融合度达到约70-80%，或克隆开始相互接触时，使用胰蛋白酶-EDTA（0.05%胰蛋白酶）按1:5至1:10比例传代mESCs。通常每2天传代一次，但具体时间可能因初始接种密度不同而延长至4至5天。
  4. 将mESCs维持在MEF饲养层及mESC培养基中，以保持其多能性。
  5. 开始分化前，至少将细胞传代一次至明胶包被的培养板上（无MEF），以稀释去除残留的MEF细胞。
    1. 通过在组织培养处理的培养皿中加入含Ca2+/Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS）配制的0.1%明胶溶液，并于37 °C孵育至少1小时，制备明胶包被的培养板。每10 cm培养皿接种1.5-2 × 106 个细胞（2.7-3.6 × 104 个细胞/cm2），并在开始分化前让细胞扩增2天。

3. 将小鼠胚胎干细胞分化为类似MGE的端脑前体细胞

  1. 分化第0天（DD 0）= "悬浮细胞"
    1. 小鼠胚胎干细胞（mESCs）在明胶包被的培养板上生长2天后，吸除培养基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤细胞一次。加入足量胰蛋白酶-EDTA（0.05%胰蛋白酶）覆盖培养皿表面（通常一个10 cm组织培养皿加入4 mL胰蛋白酶-EDTA），将细胞放回37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2的培养箱中孵育4分钟。
    2. 4分钟后，用两倍体积的mESC培养基中和胰蛋白酶-EDTA。将细胞转移至适当大小的离心管中，在200 x g条件下离心5分钟。离心结束后取出离心管，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用1 mL含BMP抑制剂LDN-193189（250 nM）和Wnt抑制剂XAV-939（10 µM）的KSR:N2培养基（1:1）重悬细胞沉淀。
    3. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞浓度。将细胞以75,000个细胞/mL的密度接种于含LDN-193189（250 nM）和XAV-939（10 µM）的KSR:N2培养基（1:1）中，置于非黏附性组织培养皿中，开始以拟胚体（EBs）形式培养。将细胞置于37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2条件下培养。
  2. 在DD1，为细胞"贴壁"做准备：用多聚-L-赖氨酸（10 µg/mL溶于含Ca2+/Mg2+的PBS中）包被组织培养处理过的培养皿，37 °C、相对湿度≥95%条件下过夜（O/N）或至少1小时。
  3. 在DD2，吸除多聚-L-赖氨酸溶液，用层粘连蛋白（10 µg/mL溶于含Ca2+/Mg2+的PBS中）包被培养板，37 °C、相对湿度≥95%条件下过夜（O/N）。
    注意：虽然过夜包被效果最佳，但至少2小时也可能足够。若培养板次日不用，应吸除层粘连蛋白，替换为不含Ca2+/Mg2+的PBS，并于4 °C保存，最长可保存2周。
  4. DD3（"贴壁细胞"）
    1. 开始拟胚体（EB）解离前，吸除层粘连蛋白溶液，将培养板置于组织培养超净台中使其完全干燥。避免使用表面发亮或明显湿润的培养板。将含培养基的拟胚体转移至15 mL离心管中，在15 x g条件下离心3–4分钟，或直至拟胚体完全沉淀。
  5. 吸除上清液，加入含DNase（2 U/mL）的细胞解离溶液3 mL，在37 °C、相对湿度≥95%、5% CO2条件下孵育15分钟。每3分钟轻轻敲击离心管一次，以促进拟胚体解离。
  6. 当拟胚体不可见或孵育时间已达15分钟时，加入6 mL含DNase（1 U/mL）的KSR:N2（1:1）培养基，在200 x g条件下离心5分钟。
  7. 将细胞以4.5–5 × 104个细胞/cm2的密度接种于含LDN-193189（250 nM）、XAV-939（10 µM）和ROCK抑制剂Y-27632（10 µM）的KSR:N2（1:1）培养基中。

4. SST 富集方案："DD12 GFP 高表达 Sonic Hedgehog (SHH)"（接步骤 3.7）

  1. 在DD5时，更换含有FGF-2（10 ng/mL）、IGF-1（20 ng/mL）和SSH（50 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。
  2. 按照步骤3.2–3.3中的说明，在第8天准备用于传代培养的组织培养板（步骤4.4）。
  3. 在DD7时，更换含有FGF-2（10 ng/mL）、IGF-1（20 ng/mL）和SHH（50 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。
  4. 在DD8时，对细胞进行传代培养。
    注意：虽然此步骤并非必需，但传代培养可减少早期分化产生的非目标细胞类型。此外，传代还能打散细胞团块，避免对后续免疫组织化学分析造成困难，并提高后期FACS分选的效率。
    1. 进行细胞传代时，使用胰蛋白酶-EDTA（0.05%胰蛋白酶）在37 °C、相对湿度≥95%及5% CO2条件下消化5分钟，使细胞从培养板上脱落。用两倍体积的KSR:N2终止胰蛋白酶反应，随后以200 × g离心5分钟。通过40 µm滤膜管过滤细胞，以去除任何细胞团块。将细胞以250,000个细胞/cm2的密度重新接种至含有FGF-2（10 ng/mL）、IGF-1（20 ng/mL）、Y-27632（10 µM）和SHH（50 ng/mL）的N2/KSR（1:1）培养基中。
      注意：如果决定不在DD8进行细胞传代，则从DD7至DD12每隔两天更换一次含SHH（50 ng/mL）的KSR:N2培养基，并持续添加IGF-1（20 ng/mL）和FGF-2（10 ng/mL）直至DD9。
  5. 在DD10时，更换含有SHH（50 ng/mL）的KSR:N2培养基。
  6. 在DD12时，为获得富集的SST亚型细胞，使用FACS分离仅表达Lhx6::GFP的细胞。
    1. 消化细胞时，应使用不含胰蛋白酶的细胞解离试剂，而非胰蛋白酶-EDTA。用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤细胞一次。向细胞中加入预热的、含有DNase（2 U/mL）的不含胰蛋白酶的细胞解离试剂。将培养板置于37 °C、相对湿度≥95%及5% CO2的培养箱中孵育10–30分钟，或直至细胞完全脱落。每隔5分钟轻轻敲击培养板以促进解离。
      注意：对于DD11–12的培养物，可能仅需10–15分钟；而对于DD15–16的培养物，可能需要30分钟或更长时间才能完成完全解离。
    2. 待细胞完全从培养板上脱落之后，按照标准操作流程进行FACS分选，或将其用于其他后续分析。

5. 富集PV的方案："DD11/DD17 mCherry + aPKCi"（接步骤3.7）

  1. 在第5天（DD5），更换含FGF-2（10 ng/mL）和IGF-1（20 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。
  2. 按照步骤3.2–3.3所述说明，准备用于第8天（DD8）传代的组织培养板（见步骤4.4）。
  3. 在第7天（DD7），更换含FGF-2（10 ng/mL）和IGF-1（20 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。
  4. 在第8天（DD8），按照步骤4.4所述方法进行细胞传代，但作如下调整：传代时，将SHH替换为smoothened激动剂（SAG；30 nM），并添加非典型PKC抑制剂（aPKCi；2 µM）。综上，传代所用培养基为含FGF-2（10 ng/mL）、IGF-1（20 ng/mL）、Y-27632（10 µM）、SAG（30 nM）和aPKCi（2 µM）的N2/KSR（1:1）培养基。
  5. 在第10天（DD10），更换含aPKCi（2 µM）的KSR:N2培养基。
  6. 第11天（DD11）
    注意：此时Nkx2.1::mCherry+细胞已富集为PV CIns。
    1. 采用步骤4.6所述相同方案，将细胞从培养板上解离用于FACS。若决定在后续分化天数收集Nkx2.1::mCherry+细胞，则忽略此步骤。
  7. 在第12天（DD12），更换含aPKCi（2 µM）的KSR:N2培养基。在第14天（DD14），更换含aPKCi（2 µM）的KSR:N2培养基。在第16天（DD16），更换含aPKCi（2 µM）的KSR:N2培养基。在第17天（DD17），采用步骤4.6所述相同方案收集Nkx2.1::mCherry+细胞。

6. 富集PV的方案："DD17 mCherry Low SHH"（接步骤3.7）

  1. 在第5天，更换为含有FGF-2（10 ng/mL）和IGF-1（20 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。在第7天，更换为含有FGF-2（10 ng/mL）和IGF-1（20 ng/mL）的KSR:N2（1:1）培养基。
  2. 在第9天，更换为KSR:N2（1:1）培养基。从此开始，无需添加额外的生长因子。
    1. 此后每2天更换一次培养基，直至第17天收获细胞。

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结果

本文所述方案是我们已发表方案15,16,17的改进版本，已针对我们所用的Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP双报告基因mESC细胞系进行了优化。从DD0-5开始添加Wnt抑制剂XAV-939，并在DD8时重新铺板，可实现稳定的Nkx2.1诱导，其中培养物中超过50%的DAPI+细胞核同时表达Nkx2.1（图1A，B）。对mCherry和GFP报告基因进行免疫组织化学染色显示，在Nkx2.1免疫反应阳性区域中报告基因表达清晰（图1A）。利用内源性报告基因对活细胞进行流式细胞分选（FACS），可明确分离出四类细胞：（1）GFP/mCherry双阴性细胞，（2）仅表达mCherry的细胞，（3）仅表达GFP的细胞，以及（4）GF...

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讨论

尽管该方法在模式化 J1 来源的小鼠胚胎干细胞（mESC，SCRC-1010）方面效果显著，但我们在其他 mESC 系及克隆分离株中获得的成功程度不一。例如，Foxg1::venus mESC（EB3 来源；Danjo 等13）对该方案反应较差，使用 DD12 诱导 Foxg1 的效率通常仅为 1–2%。出于尚不完全清楚的原因，另一个同时分离获得的 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 双报告克隆（称为 JQ59），在与本方案所述细胞系（称为 JQ27）完全相同的培养条件下，其表达 Nkx2.1 的细胞比例不足 1%。然而，亲本细胞系（J1；ATCC SCRC-1010）对该方案响应良好，在 DD12 阶段产生的 Nkx2.1 阳性细胞比例与图 1B所示结果相似。如有必要，可调整 XAV-939 和 SHH/SAG 的浓度，以针对不同细胞系优化分化条件。但我们在使用该方案将其他 mESC 系分化为类似内侧神经节隆起（MGE）前体细胞方面的经验仍然有限。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢许青开发了Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP双报告mESC细胞系，同时感谢Jennifer Tyson、Asif Maroof和Tim Petros在本实验方案早期开发过程中提供的帮助。我们还感谢CHOP流式细胞术核心设施提供的技术协助。本研究得到了NIH R01 MH066912（SA）和F30 MH105045-02（DT）项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
瓶顶式真空过滤系统康宁CLS430769
带 snap cap 细胞筛的试管ThermoFisherCorning 352235
小鼠胚胎成纤维细胞（CF-1 MEF IRR 7M）MTI-GlobalstemGSC-6101G1 小瓶 7M MEFs 可用于四块 10 cm 组织培养板。参考文献： <上标 class="xref">29,35
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2又称抗菌剂。请勿与基础培养基一同过滤——应在过滤后添加。参考文献： <上标 class="交叉引用">9,11,36,37
N2 补充剂-BStemcell Technologies7156不要用基础培养基过滤——过滤后再添加
Glutamax（100倍浓缩液）ThermoFisher35050061也称为 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。参考文献： 9,<上标 class="xref">11,38,<上标 class="xref">39
KnockOut血清替代物 (KSR)ThermoFisher10828028也称为无血清培养基添加剂。参考文献： 9,<上标 class="交叉引用">11
L-谷氨酰胺（100倍）ThermoFisher25030081
MEM-NEAA（100倍）ThermoFisher11140050
2-巯基乙醇ThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018也称为不含谷氨酰胺的DMEM。参考文献： 9,11
Hyclone FBSVWR82013-578也称为干细胞级 FBS。参考文献： <上标 class="交叉引用">9,<上标 class="交叉引用">11
组织培养处理培养皿（10 cm）BD Falcon353003
非黏附性无菌培养皿（10 cm）VWR25384-342
白血病抑制因子（mLIF）ChemiconESG1107不要冷冻，4°C 保存。参考文献： <上标 class="xref">9,<上标 class="交叉引用">11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
0.1% 明胶溶液ATCCATCC PCS-999-027
层粘连蛋白SigmaL2020
聚-L-赖氨酸SigmaP6282
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501也称为不含胰蛋白酶的细胞解离试剂。参考文献： <上标 class="xref">9,<上标 class="xref">11
RQ1 无 RNase DNasePromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074用DMSO重悬，并在-80°C下分装保存，每份仅供一次性使用
XAV939Stemgent04-0046用DMSO重悬，并在-80°C下分装保存，每次使用一份
rhFGF-2R&D Systems233-FB用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，并分装成单次使用量，于 -80°C 保存
rhIGF-2R&D Systems291-G1用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，并在 -80°C 下分装保存，每次使用一份
ROCK抑制剂（Y-27632）Tocris1254用DMSO重悬，并分装成单次使用量，于-80°C保存
Smo激动剂（SAG）Millipore566660-1MG用 H₂O 重悬，并分装成单次使用量后于 -80°C 保存
rm Sonic Hedgehog/SHHR&D Systems464-SH-025用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，并分装为单次使用量，于 -80°C 保存
PKCζ 伪底物抑制剂，肉豆蔻酰化EMD Millipore539624用 H₂O 重悬，并以单次使用分装量在 -80°C 下保存

参考文献

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皮层中间神经元分化Nkx2.1 前体细胞荧光激活细胞分选拟胚体单层法小清蛋白中间神经元富集生长抑素中间神经元亚群双报告基因 mESC 细胞系细胞移植方案神经命运决定
小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化
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