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方法文章

超薄多孔弹性水凝胶作为双细胞共培养的仿生基底膜

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DOI：

10.3791/56384

⸱

2017年12月26日

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, Yale University

本文内容

摘要

现有的双层培养模型无法实现功能性 体外 模拟研究 体内 微环境。利用聚乙二醇和氧化锌模板法，本方案描述了一种超薄仿生基底膜的构建方法，该基底膜具有可调控的刚度、孔隙率和生化组成，可高度模拟 体内 细胞外基质

摘要

基底膜是细胞双层结构中的关键组分，其刚度、成分、结构和孔隙率具有可变性。体外对内皮-上皮双层结构的研究传统上依赖于可渗透支撑模型，该模型能够支持双层细胞培养，但可渗透支撑材料在模拟人类基底膜多样性方面存在局限性。相比之下，需要化学合成的水凝胶模型具有高度可调性，可通过引入仿生肽或蛋白质来调节材料刚度和生化成分。然而，传统水凝胶模型的功能受限，因其缺乏允许细胞间接触以及进行功能性体外迁移研究的孔道。此外，由于传统水凝胶较厚，难以制备贯穿整个水凝胶厚度的孔道。在本研究中，我们采用聚乙二醇（PEG）水凝胶结合一种新型氧化锌模板法，以克服以往仿生水凝胶的不足。由此，我们开发出一种超薄、类似基底膜的水凝胶，可在具有可定制孔道结构、力学性能和生化成分的支架上支持融合细胞双层的培养。

引言

细胞外基质（ECM）构成了支持细胞附着的蛋白质支架，并作为不同类型细胞之间的屏障，是复杂组织和器官的重要组成部分。与间质性结缔组织不同，基底膜（BM）是一种特殊类型的ECM，可作为屏障将不同的组织区域相互分隔。BM的厚度约为100 µm，因此允许其两侧的细胞之间进行直接或间接的通讯。常见的BM包括血管BM（位于周细胞与内皮细胞之间的微血管壁中）和气道BM（位于内皮细胞与上皮细胞之间）。BM在健康和疾病状态下对调控细胞功能（如细胞极性和迁移）具有重要作用1。BM的组成、硬度、结构和孔隙率在不同器官系统中各不相同，以适应特定的生理功能。例如，BM上的孔隙对于维持细胞间通讯、可溶性分子的扩散，以及炎症过程中免疫细胞或感染期间细菌的迁移至关重要。在气道中，孔隙贯穿BM的整个厚度，直径范围为0.75至3.86 µm2。

基底膜的薄层特性确保了尽管不同细胞类型在物理上相互分离，仍可通过旁分泌和接触介导的信号传导维持细胞间通讯。因此，为研究人类疾病 体外 研究人员一直依赖多孔通透性支撑膜插件来培养细胞双层结构。3 这些模型对于理解在健康和疾病中起作用的细胞间通讯至关重要。3,4,5,6,7 可渗透支撑小室满足了理解细胞间信号如何调控生理过程（如白细胞募集和细菌侵入）的基本需求；然而，这类小室存在显著局限性，无法模拟人类基底膜（BM）。可渗透支撑小室缺乏机械性能和生化特性的可调节性，其简单的多孔结构也无法模拟构成基底膜典型不规则孔隙的纤维状结构。因此，迫切需要可调控的系统，以重现影响细胞过程的天然基底膜特性。

基于聚合物的基底是构建生物模拟基底膜的理想候选材料，可用于在更接近生理环境的条件下研究细胞双层结构 体内 环境8,9,10,11,12 聚合物具有可调节的机械性能，并可通过化学修饰引入仿生肽片段.11,12,13 生物惰性聚合物聚乙二醇（PEG）可用于构建仿生基底膜，近期研究已详细阐述了具有多孔网络结构的机械性能可调PEG-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）凝胶的合成方法，该凝胶可支持细胞生长和炎症细胞的趋化迁移。14 尽管已发表的基于聚乙二醇（PEG）的基质比可渗透支撑物更能模拟人类细胞外基质（ECM），但这些模型中的许多厚度极大，深度约为775 µm，限制了具有细胞间接触的双层培养体系的构建。14

在此，我们介绍一种基于聚乙二醇（PEG）聚合物的基底膜（BM）仿生材料制备方案，该方案克服了当前细胞双层培养技术的诸多局限性。我们开发了一种模板法，在聚合物合成与交联过程中引入氧化锌——一种广泛用于微晶制备的材料，并在后续步骤中选择性地将其从所得块状聚合物中去除。该过程形成一种随机分布的多孔网络结构，模拟人类基底膜中曲折且相互连通的孔隙结构。此外，通过调节针状氧化锌微晶制备过程中的反应化学计量比，可改变其尺寸与形态，从而调控材料的孔隙率。本研究所建立的技术可制备出厚度与人类基底膜相近的超薄水凝胶。最后，这些类基底膜结构的力学性能、孔隙率以及生化组成均可便捷地进行调节，以构建最接近真实生理环境的微环境 体内.

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方案

使用所有材料前，请务必阅读材料安全数据表（MSDS），并始终采取安全预防措施。

1. 氧化锌针状结构的合成

  1. 通过将 2.9749 g 硝酸锌加入 250 mL 水中，配制 250 mL 浓度为 0.04 M 的 Zn(NO3)2*6H2O 溶液。
  2. 通过将 6 g NaOH 加入 150 mL 水中，配制 150 mL 浓度为 1 M 的 NaOH 溶液。
  3. 在带有搅拌器的加热板上设置矿物油浴，并将一个 500 mL 圆底烧瓶在室温下浸入油浴中。
  4. 向烧瓶中加入 250 mL Zn(NO3)2*6H2O 溶液，并开始搅拌反应。
  5. 加入 150 mL NaOH 溶液（会短暂形成白色沉淀，随着两种溶液继续混合，沉淀将消失）。敞口搅拌 2 小时。
  6. 将烧瓶加热至 55–60 °C，并继续搅拌 24 小时。
  7. 关闭加热，持续搅拌使溶液冷却至室温。
  8. 使用孔径为 11 µm 的布氏漏斗过滤溶液，并敞口过夜干燥。当滤纸不再被倒入的溶液润湿，且漏斗孔上方已形成白色粉末时，表明颗粒已完全干燥。
  9. 收集 ZnO 针状物，并准备进行扫描电子显微镜（SEM）分析以确认其针状形貌。简要步骤如下：将导电碳胶带固定在样品台针座上，用金属药匙将 ZnO 针状物涂抹到碳胶带上。以 22.4 g/cm3 的密度溅射镀 8 mm 铱，然后在 10 kV 条件下获取图像。

2. 在显微镜载玻片上添加牺牲性锌层以实现盐酸诱导释放聚乙二醇

  1. 将1.756 g乙酸锌溶解于200 mL甲醇中，配制乙酸锌溶液。
  2. 用70%乙醇和一次性擦拭纸清洁3" × 1"普通显微镜载玻片，室温下晾干10分钟。
  3. 将直径150 mm的玻璃培养皿置于加热板上，预热至150–160 °C。
  4. 使用带橡皮吸头的玻璃移液管，用镊子夹住载玻片，滴加5滴乙酸锌溶液，使溶液在载玻片表面形成一层均匀的薄膜。让多余的溶液滴回原储备液中。
  5. 将载玻片（涂有乙酸锌的一面朝上）放入预热的培养皿（150–160 °C）中，在加热板上保持15分钟。
  6. 用镊子取出载玻片，使其冷却至室温。此时载玻片表面将呈现白色条纹状涂层。
  7. 使用一次性擦拭纸擦去载玻片上残留的过量锌，去除明显的白色条纹，使表面均匀一致。
  8. 将制备好的载玻片置于生物安全柜中，用紫外光照射至少1小时，以确保无菌。
    注意：紫外光对眼睛和暴露的皮肤有害。避免直接接触眼睛或皮肤，不使用时应关闭电源。

3. 硅胶隔离器的制备

  1. 将硅胶片切成小于1" × 1"的正方形（隔离器必须能够放入6孔板中）。
  2. 使用活检打孔器在正方形中心打8–12 mm的孔。
  3. 将硅胶隔离器在121.0 °C和1.12 kg/cm条件下高压灭菌20分钟。

4. PEG 溶液的制备与 PEG 凝胶合成

注意：PEG 的功能化和聚合反应此前已被本实验室及其他研究团队广泛探索并详细描述。8,10,11,13,14,15,16,17

  1. 将RGD细胞粘附肽与丙烯酰基-PEG-NHS按1:1的摩尔比在50 mM碳酸氢钠（pH 8.5）中混合，以实现肽的氨基末端与丙烯酸酯基团的功能化连接，该生化反应已有文献报道，其反应效率超过85%。17
  2. 将2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮与1-乙烯基-2-吡咯烷酮按300 mg/mL的浓度混合，制备光引发剂。
  3. 在不同的1.5 mL离心管中，分别称取以下物质：20 mg ZnO针状颗粒、12.5 mg PEG-DA和2.5 mg PEG-RGD。
  4. 将20 mg ZnO针状颗粒悬浮于270 µL含10% FBS的PBS溶液中；涡旋混匀（约15 s）。
  5. 在台式小型离心机中短暂离心（<1 s），使任何ZnO聚集体沉降至管底。
  6. 从ZnO溶液上层吸取250 µL液体，以确保聚集体保留在管底。将该溶液与PEG-DA和PEG-RGD混合，制备含约2.5 mM RGD的PEG溶液。涡旋混匀（约15 s）。
  7. 加入2 µL苯乙酮/N-乙烯基吡咯烷酮光引发剂，短暂涡旋混匀（约5 s）。
  8. 沿ZnO涂层载玻片中心加入20 µL聚合物溶液。
  9. 将另一张载玻片缓慢覆盖其上，ZnO涂层面向下（PEG溶液应位于两层ZnO涂层之间）。尽量避免产生气泡。沿载玻片长轴方向轻微滑动，使气泡逸出并将溶液铺展成薄层。用聚合物溶液覆盖大部分载玻片表面。上层载玻片应略微悬出，以便后续步骤中可轻松分离两片载玻片。
  10. 在365 nm紫外灯（约10 mW/cm2）下交联15分钟。

5. 从玻璃载片上释放 PEG 凝胶

  1. 对悬空的载玻片施加压力，并以缓慢的速度手动将两张载玻片分开，以避免载玻片破裂。让凝胶干燥至少5分钟，或过夜。
  2. 将载玻片放入无菌的25 mm玻璃培养皿中，轻轻倒入1 M HCl溶液，用量仅需覆盖载玻片即可（约10–20 mL）。轻轻摇动培养皿；随着HCl溶解牺牲性锌涂层和针状结构，凝胶应开始从载玻片上脱离。一旦凝胶完全脱离载玻片，将HCl倒回原储备液中。
  3. 向培养皿中轻轻倒入约25 mL的1x PBS，冲洗凝胶，直至载玻片和凝胶完全浸没。小心将PBS倒入废液容器中。
  4. 向培养皿中轻轻倒入约25 mL的1x PBS，使凝胶漂浮于溶液中。
  5. 使用镊子小心地将硅胶隔离器滑入凝胶下方，并将凝胶轻轻提起置于隔离器上。
  6. 将隔离器连同凝胶一起转移至盛有无菌1x PBS的6孔板中。
  7. 重复此过程，直至所有凝胶均从载玻片上取下并浸泡在PBS中。将制备好的凝胶置于生物安全柜中，暴露于紫外光下至少1小时，以确保无菌。

6. 接种细胞双层

  1. 准备接种 A549 细胞。简而言之，用 5 mL 的 1× PBS 冲洗一个 75 cm2 培养瓶，加入 3 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 静置 2–3 分钟。
    1. 机械震荡培养瓶，用 3 mL 含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）终止反应，并将细胞收集至一个 15 mL 圆锥形离心管中。再用额外的 4 mL 完全杜氏改良伊格尔培养基冲洗，并将冲洗液收集至同一离心管中。在 475 × g 条件下离心 6 分钟。
  2. 在细胞离心过程中，向一个新的 6 孔板的每个孔中加入少量完全杜氏改良伊格尔培养基。使用镊子将带有凝胶的硅胶隔离器转移至新的 6 孔板中，使凝胶置于培养基液滴上。由于凝胶已铺展成薄层，应立即肉眼检查是否存在明显的大孔洞。此步骤应在细胞接种前立即进行，以避免凝胶干燥和开裂。
  3. 将细胞重悬于含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基中，浓度为 6 × 105 个细胞/mL。将细胞悬液逐滴加至凝胶中央，尽量保持在硅胶膜打孔区域内的液面弯月面形态。让细胞贴壁 4 小时。
  4. 4 小时后，向每孔加入 0.5 mL 完全杜氏改良伊格尔培养基，并于 37 °C 过夜培养，以确保细胞完全贴壁。
  5. 次日，准备接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。
    1. 用 5 mL 的 1× PBS 冲洗一个 75 cm2 培养瓶，加入 3 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 静置 2–3 分钟。
    2. 机械震荡培养瓶，用 3 mL 含 20% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素和 1% 生长补充剂的 M199 培养基终止反应，并将细胞收集至一个 15 mL 圆锥形离心管中。
    3. 用 4 mL 完全 M199 培养基冲洗，并将冲洗液收集至同一离心管中。在 475 × g 条件下离心 6 分钟。
  6. 在细胞离心过程中，向一个新的 6 孔板的每个孔中加入少量完全 M199 培养基。将新的硅胶隔离器放入孔中，使培养基液滴位于硅胶中央。
  7. 使用镊子，小心地将承载 PEG 凝胶及 A549 细胞的硅胶隔离器翻转，放置于新 6 孔板中的隔离器上。
  8. 将 HUVECs 重悬至浓度为 6 × 105 个细胞/mL，并将细胞悬液逐滴加至翻转后凝胶的中央，尽量维持硅胶膜打孔区域内凝胶表面的弯月面形态。让细胞贴壁 2 小时。
  9. 2 小时后，轻轻向每孔加入 2 mL 完全 M199 培养基。

7. 免疫荧光

  1. 使用手动移液器小心吸去凝胶中的培养基，并在细胞接种位置的中央加入约 500 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA），室温静置 30 分钟。
    ​注意：PFA 为有毒化学品，操作时需佩戴防护装备，并确保在生物安全柜中进行。
  2. 小心吸去 PFA 溶液，向每孔凝胶中加入约 500 µL 含 2% BSA 的 PBS 溶液，室温静置 1 小时。
  3. 小心吸去 BSA 溶液。将一抗用含 2% BSA 的 PBS 按 1:100 稀释后，每孔加入 500 µL，室温孵育 1 小时，随后用 500 µL 1× PBS 轻柔冲洗。
    1. 二抗孵育步骤同上。使用以下抗体：1）抗人 CD144（VE-Cadherin）克隆 16B1；2）抗人 CD324（E-Cadherin）克隆 6714；3）抗人 CD31（PECAM-1）克隆 C-20；4）抗 A549；5）抗小鼠 FITC；6）抗山羊 Alexa Fluor 647。为观察 F-肌动蛋白，加入 500 µL 鬼笔环肽（Phalloidin，10 µg/mL 溶于 PBS）孵育 20 分钟。
  4. 小心吸去二抗或鬼笔环肽溶液，每孔加入 500 µL DAPI（0.1 µg/mL）孵育 20 分钟。随后小心吸去 DAPI 溶液，每孔轻柔加入 1.5 mL 1× PBS，使凝胶悬浮于液体中。
    1. 使用镊子和硅胶隔离器将一块凝胶转移至载玻片上。每块凝胶应在成像前立即转移，成像后及时放回 PBS 溶液中。
    2. 或者，可使用含 DAPI 的封片剂封片。用指甲油将样品密封，确保密封良好，并在 2 天内完成成像以防止凝胶干燥和开裂。问题排查请参见表 1。

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结果

通过将聚合物溶液夹在两层可牺牲的氧化锌之间，并利用氧化锌针形成孔模板，制备出PEG-RGD水凝胶。随后用盐酸去除牺牲性的氧化锌组分，从而生成具有连续孔道的超薄PEG水凝胶（图1）。通过扫描电子显微镜（SEM）确认了氧化锌针的形貌，其平均长度和宽度分别为3.92 ± 0.089 µm和0.43 ± 0.02 µm（图2A - 2B）。在去除氧化锌针后，通过SEM观察并表征了水凝胶的孔道结构（图2C - 2E）。水凝胶的平均孔密度为176,863 ± 49,532 个孔。同时使用SEM观察并计算了标准3 µm孔径的聚碳酸酯可渗透支持插入物的孔密度，结果显示其孔密度显著更低，约为每平方毫米2.51 ± 0.05 个孔（图2D，...

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讨论

本文所述方案使我们能够制备一种可调控的聚乙二醇（PEG）水凝胶，用作仿生基底膜支架。具体而言，通过调节PEG的分子量、多肽偶联策略以及氧化锌微晶结构或浓度，可分别调控水凝胶的弹性模量、生化特性及多孔结构。这种超薄PEG支架具有更高的孔隙密度和更小的孔径，更接近天然基底膜的结构特征。 体内 与标准的可渗透支撑模型相比的基底膜表 2）。此外，通过该方法，我们已获得平均厚度小于20 µm的超薄结构。尽管聚碳酸酯可渗透支撑模型已实现低至10 µm的超薄层，但据我们所知，这是首个达到此厚度的可自由悬浮且可调节的水凝胶系统。最后，该PEG水凝胶的弹性模量约为100 kPa，远低于传统可渗透支撑材料、组织培养塑料和玻璃（其弹性模量均在GPa量级），因此更接近于低（<10 kPa）弹性模量的 体内 细胞外基质（表2).

实现较低的弹性模量是本研究的主要目标之一，也是传统聚碳酸酯通透性支撑模型应用中的一个局限性。众所周知，基底刚度可决定细胞行为，已有研究证明基底刚度能够引导分化中细胞的细胞...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Paul Van Tassel 教授和 Chinedum Osuji 教授富有见地的讨论以及在材料科学领域的专业知识。本研究工作由 Dubinsky 新计划奖和美国国立卫生研究院国家生物医学成像与生物工程研究所 BRPR01 EB16629-01A1 项目提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1M 水凝胶氯化物（HCl）EMDHX0603-75 2.5L无菌。在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
1X PBSGibco14040-133 500 mL无
六水合硝酸锌（Zn(NO3)2•6H2OSigma-Aldrich228737-500g使用时请佩戴护目镜和手套。
氢氧化钠（NaOH）Macron Chemicals278408-500g使用时请佩戴护目镜和手套。
乙酸锌二水合物 ((CH3O2)2Zn2+•2H2OFisher ScientificAC45180010 1 kg使用时请佩戴护目镜和手套。
甲醇（CH3OHJ.T. Baker9070-05 4L在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
VWR生命科学Seradigm优质级FBSVWR97068-085无菌滤器。5 mL 胎牛血清加入 45 mL 磷酸盐缓冲液
矿物油绒毛膜绒毛取样术 PLD-B280B无
圆底烧瓶ChemGlassN/A
温度计N/A
搅拌子N/A
普通预清洁载玻片 3"x1"x1" 毫米厚赛默飞世尔科技420-004T用乙醇喷洒后，待其干燥后再使用。
玻璃巴斯德吸管N/A
1 mL 橡胶吸头N/A
塑料 100 mm 培养皿N/A
无菌镊子N/A
硅胶隔离器0.8 mm 厚
聚二甲基硅氧烷（PDMS）打孔器N/A
玻璃瓶N/A
6 孔板Cellstar657 160N/A
滤纸Whatman8519N/A
搅拌器-加热板VWR Dya-Dual12620-970使用时请佩戴护目镜和手套。
2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（C6H5COC(OCH3)2C6H5Sigma-Aldrich24650-42-8使用时请佩戴护目镜和手套。
1-乙烯基-2-吡咯烷酮（C6H9一氧化氮Aldrich使用时请佩戴护目镜和手套。
聚乙二醇 10,000（H(OCH₂CH₂)ₙOH）2CH2)10,000OHFluka81280-1kg使用时请佩戴护目镜和手套。
RGDSLife Tein180190使用时请佩戴护目镜和手套。
Blak-Ray 长波紫外灯UVPModel B 100APN/A
Eppendorf管USA Scientific1615-5500N/A

参考文献

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