超薄多孔弹性水凝胶作为双细胞共培养的仿生基底膜

摘要

现有的双层培养模型无法实现功能性 体外 模拟研究 体内 微环境。利用聚乙二醇和氧化锌模板法，本方案描述了一种超薄仿生基底膜的构建方法，该基底膜具有可调控的刚度、孔隙率和生化组成，可高度模拟 体内 细胞外基质

摘要

基底膜是细胞双层结构中的关键组分，其刚度、成分、结构和孔隙率具有可变性。体外对内皮-上皮双层结构的研究传统上依赖于可渗透支撑模型，该模型能够支持双层细胞培养，但可渗透支撑材料在模拟人类基底膜多样性方面存在局限性。相比之下，需要化学合成的水凝胶模型具有高度可调性，可通过引入仿生肽或蛋白质来调节材料刚度和生化成分。然而，传统水凝胶模型的功能受限，因其缺乏允许细胞间接触以及进行功能性体外迁移研究的孔道。此外，由于传统水凝胶较厚，难以制备贯穿整个水凝胶厚度的孔道。在本研究中，我们采用聚乙二醇（PEG）水凝胶结合一种新型氧化锌模板法，以克服以往仿生水凝胶的不足。由此，我们开发出一种超薄、类似基底膜的水凝胶，可在具有可定制孔道结构、力学性能和生化成分的支架上支持融合细胞双层的培养。

引言

细胞外基质（ECM）构成了支持细胞附着的蛋白质支架，并作为不同类型细胞之间的屏障，是复杂组织和器官的重要组成部分。与间质性结缔组织不同，基底膜（BM）是一种特殊类型的ECM，可作为屏障将不同的组织区域相互分隔。BM的厚度约为100 µm，因此允许其两侧的细胞之间进行直接或间接的通讯。常见的BM包括血管BM（位于周细胞与内皮细胞之间的微血管壁中）和气道BM（位于内皮细胞与上皮细胞之间）。BM在健康和疾病状态下对调控细胞功能（如细胞极性和迁移）具有重要作用¹。BM的组成、硬度、结构和孔隙率在不同器官系统中各不相同，以适应特定的生理功能。例如，BM上的孔隙对于维持细胞间通讯、可溶性分子的扩散，以及炎症过程中免疫细胞或感染期间细菌的迁移至关重要。在气道中，孔隙贯穿BM的整个厚度，直径范围为0.75至3.86 µm²。

基底膜的薄层特性确保了尽管不同细胞类型在物理上相互分离，仍可通过旁分泌和接触介导的信号传导维持细胞间通讯。因此，为研究人类疾病 体外 研究人员一直依赖多孔通透性支撑膜插件来培养细胞双层结构。³ 这些模型对于理解在健康和疾病中起作用的细胞间通讯至关重要。^3,4,

方案

使用所有材料前，请务必阅读材料安全数据表（MSDS），并始终采取安全预防措施。

1. 氧化锌针状结构的合成

1. 通过将 2.9749 g 硝酸锌加入 250 mL 水中，配制 250 mL 浓度为 0.04 M 的 Zn(NO₃)₂*6H₂O 溶液。
2. 通过将 6 g NaOH 加入 150 mL 水中，配制 150 mL 浓度为 1 M 的 NaOH 溶液。
3. 在带有搅拌器的加热板上设置矿物油浴，并将一个 500 mL 圆底烧瓶在室温下浸入油浴中。
4. 向烧瓶中加入 250 mL Zn(NO₃)₂*6H₂O 溶液，并开始搅拌反应。
5. 加入 150 mL NaOH 溶液（会短暂形成白色沉淀，随着两种溶液继续混合，沉淀将消失）。敞口搅拌 2 小时。
6. 将烧瓶加热至 55–60 °C，并继续搅拌 24 小时。
7. 关闭加热，持续搅拌使溶液冷却至室温。
8. 使用孔径为 11 µm 的布氏漏斗过滤溶液，并敞口过夜干燥。当滤纸不再被倒入的溶液润湿，且漏斗孔上方已形成白色粉末时，表明颗粒已完全干燥。
9. 收集 ZnO 针状物，并准备进行扫描电子显微镜（SEM）分析以确认其针状形貌。简要步骤如下：将导电碳胶....

结果

通过将聚合物溶液夹在两层可牺牲的氧化锌之间，并利用氧化锌针形成孔模板，制备出PEG-RGD水凝胶。随后用盐酸去除牺牲性的氧化锌组分，从而生成具有连续孔道的超薄PEG水凝胶（图1）。通过扫描电子显微镜（SEM）确认了氧化锌针的形貌，其平均长度和宽度分别为3.92 ± 0.089 µm和0.43 ± 0.02 µm（图2A - 2B）。在去除氧化锌针后，通过SEM观察并表征了水凝胶的孔道结构（图2C - 2E）。水凝胶的平均孔密度为176,863 ± 49,532 个孔。同时使用SEM观察并计算了标准3 µm孔径的聚碳酸酯可渗透支持插入物的孔密度，结果显示其孔密度显著更低，约为每平方毫米2.51 ± 0.05 个孔（图2D，.......

讨论

本文所述方案使我们能够制备一种可调控的聚乙二醇（PEG）水凝胶，用作仿生基底膜支架。具体而言，通过调节PEG的分子量、多肽偶联策略以及氧化锌微晶结构或浓度，可分别调控水凝胶的弹性模量、生化特性及多孔结构。这种超薄PEG支架具有更高的孔隙密度和更小的孔径，更接近天然基底膜的结构特征。 体内 与标准的可渗透支撑模型相比的基底膜表 2）。此外，通过该方法，我们已获得平均厚度小于20 µm的超薄结构。尽管聚碳酸酯可渗透支撑模型已实现低至10 µm的超薄层，但据我们所知，这是首个达到此厚度的可自由悬浮且可调节的水凝胶系统。最后，该PEG水凝胶的弹性模量约为100 kPa，远低于传统可渗透支撑材料、组织培养塑料和玻璃（其弹性模量均在GPa量级），因此更接近于低（<10 kPa）弹性模量的 体内 细胞外基质（表2).

实现较低的弹性模量是本研究的主要目标之一，也是传统聚碳酸酯通透性支撑模型应用中的一个局限性。众所周知，基底刚度可决定细胞行为，已有研究证明基底刚度能够引导分化中细胞的细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1M 水凝胶氯化物（HCl）	EMD	HX0603-75 2.5L	无菌。在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
1X PBS	Gibco	14040-133 500 mL	无
六水合硝酸锌（Zn(NO3)2•6H2O	Sigma-Aldrich	228737-500g	使用时请佩戴护目镜和手套。
氢氧化钠（NaOH）	Macron Chemicals	278408-500g	使用时请佩戴护目镜和手套。
乙酸锌二水合物 ((CH3O2)2Zn2+•2H2O	Fisher Scientific	AC45180010 1 kg	使用时请佩戴护目镜和手套。
甲醇（CH3OH	J.T. Baker	9070-05 4L	在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
VWR生命科学Seradigm优质级FBS	VWR	97068-085	无菌滤器。5 mL 胎牛血清加入 45 mL 磷酸盐缓冲液
矿物油	绒毛膜绒毛取样术	PLD-B280B	无
圆底烧瓶	ChemGlass		N/A
温度计			N/A
搅拌子			N/A
普通预清洁载玻片 3"x1"x1" 毫米厚	赛默飞世尔科技	420-004T	用乙醇喷洒后，待其干燥后再使用。
玻璃巴斯德吸管			N/A
1 mL 橡胶吸头			N/A
塑料 100 mm 培养皿			N/A
无菌镊子			N/A
硅胶隔离器			0.8 mm 厚
聚二甲基硅氧烷（PDMS）打孔器			N/A
玻璃瓶			N/A
6 孔板	Cellstar	657 160	N/A
滤纸	Whatman	8519	N/A
搅拌器-加热板	VWR Dya-Dual	12620-970	使用时请佩戴护目镜和手套。
2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（C6H5COC(OCH3)2C6H5	Sigma-Aldrich	24650-42-8	使用时请佩戴护目镜和手套。
1-乙烯基-2-吡咯烷酮（C6H9一氧化氮	Aldrich		使用时请佩戴护目镜和手套。
聚乙二醇 10,000（H(OCH₂CH₂)ₙOH）2CH2)10,000OH	Fluka	81280-1kg	使用时请佩戴护目镜和手套。
RGDS	Life Tein	180190	使用时请佩戴护目镜和手套。
Blak-Ray 长波紫外灯	UVP	Model B 100AP	N/A
Eppendorf管	USA Scientific	1615-5500	N/A