本研究中，我们介绍了一种在神经退行性条件下评估血脑屏障破坏的简便高效方法。为实现研究目标，我们将高分子量的异硫氰酸荧光素标记（FITC）-白蛋白注入小鼠颈静脉，并通过荧光显微镜观察其向脑实质的渗漏情况。
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摘要
摘要
血脑屏障（BBB）完整性的破坏是多种神经系统疾病和神经退行性疾病常见的特征。尽管 BBB 稳态失衡与脑部疾病发病机制之间的相互作用仍需进一步研究，但建立并验证一种能够准确检测 BBB 改变的可靠方法可能至关重要，该方法可作为预测疾病进展和开发靶向治疗策略的有用工具。
本文介绍了一种简便且高效的方法，用于评估亨廷顿病小鼠临床前模型等神经退行性疾病中血脑屏障（BBB）的渗漏情况。在此类疾病中，血脑屏障通透性缺陷可在疾病早期被明确检测到。具体而言，将高分子量的异硫氰酸荧光素标记（FITC）-白蛋白急性注入小鼠颈静脉，该分子仅在血脑屏障受损时才能穿越屏障；随后通过荧光显微镜检测其在血管或实质区域的分布情况。
脑实质中绿色荧光白蛋白的积聚可作为血脑屏障通透性异常的指标，通过Image J图像处理软件进行定量后，以绿色荧光强度表示。
引言
中枢神经系统（CNS）内的稳态是神经元细胞正常通信与功能发挥的前提条件。CNS 实质通过内皮性的血脑屏障（BBB）与外周紧密隔离，该屏障构成了外周血液循环与脑组织之间的界面，在这两个区域之间的相互作用中起着关键作用1,2。BBB 是一种复杂且动态的三维结构，主要由特化的微血管内皮细胞（ECs）构成，这些细胞通过细胞间连接复合物——紧密连接（TJs）——相互连接，并被周细胞、神经元末梢和星形胶质细胞足突所包绕1,2。
在生理条件下，完整血脑屏障（BBB）的通透性极低，可严格调控营养物质及其他分子进入和离开大脑的转运过程，并使中枢神经系统（CNS）免受血液成分变化的影响，从而保护神经活动不受干扰，同时抵御潜在的外周损伤1,2,3。
血脑屏障（BBB）完整性的破坏及其通透性增加已被长期认为是多种神经系统和神经退行性疾病的关键特征4，包括亨廷顿病（Huntington's Disease, HD）5,6，然而，这种功能障碍究竟是疾病发生的原因还是疾病进展过程中的继发现象，目前尚不明确。BBB破坏发生的时间点也仍不清楚，但本课题组及其他研究团队的新兴证据表明，BBB完整性的破坏并非疾病晚期事件，而可能是疾病进展的早期步骤6,7,8，可能对疾病产生长期影响。
基于此，早期揭示神经退行性疾病中血脑屏障的破坏至关重要，这有助于制定策略以预测疾病进展和脑损伤，并开发出能够有效减轻此类破坏所导致临床后果的替代性及更具靶向性的干预措施。因此，对血脑屏障功能障碍进行可靠的影像学检测，在脑部疾病的实验研究和临床管理中均具有重要意义。
本文中，我们描述了一种在亨廷顿病（HD）小鼠模型中评估血脑屏障（BBB）通透性的成功且简便的方法，该方法使用高分子量的异硫氰酸荧光素标记白蛋白（FITC-白蛋白）。以正常情况下无法通过屏障的FITC-白蛋白渗出至脑实质的程度作为BBB渗漏的指标。该技术可轻松适用于大鼠及其他以脑血管功能障碍为特征的病理状态9,10。
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方案
所有动物实验均经 IRCCS Neuromed 动物护理审查委员会和"Istituto Superiore di Sanità"（许可编号：1163/2015-PR）批准，并符合欧盟关于动物实验的指令 2010/63/EU 的指导原则。
1. 准备用于颈静脉注射的FITC-白蛋白溶液
注意：所有实验均在显性症状（11周龄）的亨廷顿病R6/2小鼠及其年龄和性别匹配的野生型（WT）对照小鼠中进行。
- 将FITC-白蛋白粉末（参见材料表）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为10 mg/ml。
注意：为获得最佳效果，每次标记反应均应新鲜配制。
2. 手术期间使用设备的准备
- 摆放预先高压灭菌的手术器械（参见材料表）。
- 用酒精（70% 乙醇溶液）清洁手术台。使用无菌一次性手术巾铺巾，准备45 cm × 45 cm的手术区域，并架设手术体视显微镜。
3. 荧光素异硫氰酸-白蛋白经颈静脉输注的手术操作
- 记录小鼠体重以确定麻醉剂量。
- 通过腹腔注射（i.p）给予适当剂量的氯胺酮（100 mg/kg）-赛拉嗪（10 mg/kg）溶液对小鼠进行麻醉。
- 通过轻捏脚趾并观察回缩反射来监测动物的镇静程度，方法如 Walantus et al.11,12 所示。
- 将麻醉后的小鼠仰卧位放置，并用胶带将其四肢和尾巴固定在手术台上。
- 固定小鼠后，使用电动剃刀（见材料表）小心剃除颈部适当范围的毛发，并用聚维酮碘溶液和70%乙醇进行消毒。
- 用棉签将暴露的剃毛区域擦干。
- 轻轻提起剃毛区域的皮肤，使用手术刀在锁骨中线处做一条长约1.5 cm的纵向切口，起始于胸腔中部，延伸至颈部下方。
- 在显微镜观察下（5倍放大），用镊子小心分离结缔组织，以暴露颈外静脉。
- 确保颈静脉左右两侧有足够的空间，以便插入30½ G针头用于注射FITC-白蛋白溶液。
- 使用30½ G针头经静脉（右侧颈静脉）缓慢注射100 µL的10 mL/kg FITC-白蛋白溶液，注射时间持续3分钟。
- 15分钟后，通过断头法处死小鼠，迅速按先前描述的方法取出脑组织13，并将其浸入预冷的异戊烷中至少15分钟，异戊烷体积至少为脑组织体积的10倍。
- 将经异戊烷冷冻的脑组织转移至预冷的管中，并储存于-80 °C冰箱中，直至进行组织学切片。
4. 脑内灌注FITC-白蛋白后的组织学切片
- 在冷冻切片前，将冷冻脑组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中（见材料表）。
- 使用冷冻切片机（见材料表）将脑组织连续切片，厚度为 20 µm，并将切片贴附于显微镜载玻片上。
- 采用特异性抗层粘连蛋白（laminin）抗体（见材料表），按照先前描述的方法进行FITC-白蛋白/层粘连蛋白共染色6。
- 简言之，将切片与一抗抗层粘连蛋白（pAb，1:1000）在4°C孵育过夜，随后使用与Cy3偶联的适当二抗进行孵育。
- 用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片（吸收峰 = 360 nm；发射峰 = 460 nm）（见材料表）。
- 将载玻片置于4 °C避光环境中过夜干燥。
- 在荧光显微镜（见材料表）下，使用20倍物镜并配备FITC（吸收峰 = 495 nm；发射峰 = 525 nm）和Cy3滤光片（吸收峰 = 550 nm；发射峰 = 570 nm）观察荧光染色结果。
- 若需在染色后立即观察样本，可用指甲油在盖玻片四角固定，然后按上述方法（4.3.3）在显微镜下检查。
5. 荧光显微镜的设置与彩色图像的采集
- 按如下步骤设置荧光显微镜。
- 使用前约10分钟打开荧光灯。开启显微镜、连接的计算机和数码相机。运行图像分析软件（参见材料表）。
- 选择合适的物镜以获得最佳信号采集和空间分辨率，并选择适当的滤光片。
- 彩色图像的采集
- 在图像分析软件中（参见材料表）选择[实时]命令，并为每个滤光片设置最佳照明参数。
- 选择[冻结]命令以获取单通道彩色图像，并添加标尺（“编辑>烧录标尺”）。
- 将每幅图像以“.tiff”格式保存。
- 通过选择“文件>合并通道”将各通道合并为一幅图像，并将其保存为
- tiff格式。
- 每张脑片（每张载玻片含6个切片）至少采集四幅24位彩色图像（2200 µm × 3400 µm）。
6. FITC-白蛋白外渗的评估
- 使用免费的 ImageJ14,15 分析每个单通道的荧光强度。
- 将每张图像中 FITC-白蛋白的总荧光信号强度相对于 CY3-层粘连蛋白的总荧光强度进行归一化，并将血管外渗出的白蛋白报告为绿色荧光强度。
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结果
在血脑屏障受损的情况下，将FITC-白蛋白正确注入颈静脉，会导致绿色荧光示踪剂从血液渗出至脑实质6。在生理条件下，输注的荧光白蛋白分布局限于脑血管内部，周围血管周围区域和/或脑实质中均无法检测到信号（图1A，上方显微图像）。相反，在神经病理状态下血脑屏障受损时，FITC-白蛋白在血管周围间隙及脑实质中呈现弥散性荧光分布模式（图1A，下方显微图像）。通过与血管标志物层粘连蛋白（laminin）共染色，可清晰定位FITC-白蛋白的积聚部位（图1A）。使用图像处理软件（见材料表）评估血脑屏障受损时FITC-白蛋白增强的绿色荧光强度，并以绿色荧光强度表示（N = 3；0.3112 vs 0.5765；****，p = 0.0004，非配对t检验）（图1B）。FIT...
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讨论
本文所述技术主要用于检测脑部疾病状态下血脑屏障（BBB）的渗漏情况。血脑屏障功能障碍正日益受到关注，被认为是多种神经系统疾病共有的特征4。我们此前已利用该方法描述了一种罕见神经退行性疾病（如亨廷顿病，HD）小鼠模型中血脑屏障完整性的早期紊乱6。
该方法利用了操作相对简便且高效的特点，可提供准确可靠的结果。它是一种高度敏感的临床前研究工具，通过直接观察脑组织切片中绿色荧光的存在，能够快速、即时地定性评估血脑屏障（BBB）的破坏情况。然而，当该技术与生物化学和分子分析相结合时，还可成功提供有关血管内皮紧密连接（TJs）结构与功能完整性的定量信息，并允许分析血脑屏障破坏与脑内环境稳态之间的相关性。
尽管该方法无法提供关于血脑屏障超微结构的任何信息，但与高分辨率电子显微镜等其他方法相比，本文所述方案可能更为经济且节省时间16,17
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致谢
本工作由"Fondazione Neuromed"支持，并由意大利卫生部"Ricerca Corrente"项目资助给 V.M.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 白蛋白-异硫氰酸荧光素偶联物 | SIGMA | A9771-100MG | |
| 多克隆抗层粘连蛋白抗体 | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| 山羊抗兔IgG-CY3标记二抗 | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS 载玻片 | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| 盖玻片 24 × 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik 最佳切割温度（OCT）包埋剂 | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD 封片剂 | VECTOR | H-1500 | 含DAPI的封片介质 |
| iNSu/Light 一次性胰岛素注射器 | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | 一次性胰岛素注射器用针头 |
| 手术刀柄 | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 一次性手术刀片 | F.S.T. | 10022-00 | |
| 精细虹膜剪 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont 镊子 #5745 45° 0.10 × 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe 镊子 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont 镊子 #5 0.1 × 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| 医用敷料贴 | Medicalis | 34788 | |
| 无菌一次性手术巾单 | Dispotech | TVO50VE | |
| 体视显微镜 | NIKON | SMZ 745 T | |
| LED光源照明器（C-FLED2） | NIKON | 1003167 | 体视显微镜用光学照明器 |
| Eclipse Ni-U 显微镜 | Nikon | 932162 | 落射荧光显微镜 |
| 显微镜数字相机 | Nikon | DS-Ri2 | 显微镜相机 |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | 显微镜光源灯 |
| NIS-Elements 64位 | Nikon | AR 4.40.00 | 图像分析软件 |
| 电动剃须刀 | Gemei | GM-3007 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
