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方法文章

基于同位素示踪实验组合的工作流程以研究微生物对多种营养源的代谢

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DOI：

10.3791/56393

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2018年1月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR SPO, INRA, SupAgroM, Université de Montpellier, 2IWBT Stellenbosch University, 3PILI, Toulouse White Biotechnology

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于定量且全面研究多种营养物质代谢的实验方法。该工作流程结合了同位素示踪实验与分析程序，可确定被消耗营养物质的去向以及微生物合成分子的代谢来源。

摘要

微生物学领域的研究依赖于多种方法的实施。特别是，适当方法的开发对于深入了解在含有特定氮源和碳源的化学成分明确培养基中生长的微生物的代谢过程具有重要贡献。相比之下，尽管多种营养物质在自然或工业环境中广泛存在，但微生物对其代谢调控的研究仍几乎处于空白状态。这种情况主要是由于缺乏合适的方法学，从而阻碍了相关研究的开展。

我们报告了一种实验策略，可定量且全面地探究当营养物质以不同分子的混合物形式提供时，代谢如何运作。 即，一种复杂的资源。本文描述了其在评估多种氮源通过酵母代谢网络分配过程中的应用。该工作流程结合了在使用选定的稳定同位素示踪实验中获得的信息 13C- 或 15N标记的底物。该方法首先在相同培养基中进行平行且可重复的发酵，培养基包含多种含氮分子的混合物；但每次仅对选定的一种氮源进行标记。结合多种分析手段（HPLC、GC-MS），用于评估目标化合物的标记模式，并定量分析底物在其他代谢物中的消耗与回收情况。对完整数据集的整合分析可全面揭示细胞内消耗底物的去向。该方法需要精确的取样流程——通过机器人辅助系统实现发酵过程的在线监测——并完成大量耗时的分析工作。尽管存在这些限制，该方法首次实现了对多种氮源在酵母代谢网络中分配路径的解析。我们阐明了氮元素从较丰富的氮源向其他含氮化合物的再分配过程，并确定了挥发性分子及蛋白源性氨基酸的代谢来源。

引言

了解微生物代谢的运行机制对于设计高效策略以优化发酵工艺并调控发酵产物的生成至关重要。过去二十年中，基因组学和功能基因组学的进步极大地拓展了人们对多种微生物代谢网络拓扑结构的认识。获取这些信息推动了旨在全面理解细胞功能的方法的发展1。这些方法通常依赖于对可测量参数的模型化解释。实验数据一方面包括代谢物的摄取和生成速率，另一方面则包括通过同位素示踪实验获得的细胞内定量信息。这些数据为推断特定代谢网络中不同代谢通路的体内活性提供了关键依据2,3,4。目前，现有的分析技术仅能在使用单元素同位素标记、或可能在双同位素共标记的情况下，准确检测分子的标记模式。此外，在大多数生长条件下，碳源通常仅由一种或两种化合物组成。因此，基于碳底物的13C同位素示踪方法已被广泛而成功地应用于全面解析碳代谢网络的运行机制5,6,7,8。

相比之下，在许多自然和工业环境中，支持微生物生长的可利用氮源通常由多种分子组成。例如，在葡萄酒或啤酒发酵过程中，氮以18种氨基酸和铵盐的混合物形式提供，且浓度各不相同9。这种可用于生物合成的氮化合物组合使得这些复杂培养条件与生理学研究中常用的条件大不相同，因为后者通常仅使用单一氮源，一般是铵盐。

总体而言，细胞内化的氮化合物可直接掺入蛋白质中，或被分解代谢。包括酵母Saccharomyces cerevisiae在内的许多微生物，其氮代谢网络结构极为复杂，这与底物的多样性相适应。从示意图上看，该系统基于氮代谢核心中心的整合，该核心催化谷氨酰胺、谷氨酸和α-酮戊二酸之间的相互转化10,11，并联合转氨酶和脱氨酶共同作用。通过该网络，来自铵离子或其他氨基酸的氨基被收集，同时释放出α-酮酸。这些中间产物也通过中心碳代谢（CCM）12,13合成。大量分支反应和中间产物既参与外源性氮源的分解代谢，也参与蛋白质氨基酸的合成代谢，从而满足细胞的合成需求。这些相互关联的代谢通路的活性还会导致代谢物的外排。特别是，α-酮酸可通过Ehrlich途径被重新定向，生成高级醇及其乙酸酯衍生物14，这些物质是产品感官特征的重要贡献者。因此，氮代谢的运行方式在生物量生成和挥发性分子（香气）的形成中起着关键作用。

氮代谢中涉及的反应、酶和基因在文献中已有广泛描述。然而，多种氮源在代谢网络中的分配问题至今尚未得到解决。这一信息缺失主要有两个原因：首先，考虑到氮代谢网络具有高度复杂性，要全面理解其运行机制需要大量的定量数据，而这些数据直到目前才得以获得；其次，许多实验限制以及分析方法的局限性阻碍了先前用于阐明碳浓缩机制（CCM）功能的研究方法的应用。

为解决这些问题，我们选择开发一种基于同位素示踪实验系列数据整合的系统级方法。该工作流程包括：
- 在相同环境条件下进行一系列发酵实验，每次标记不同的选定营养源（底物）；
- 结合多种分析方法（高效液相色谱、气相色谱-质谱联用），在发酵的不同阶段精确测定标记底物的残余浓度，以及由标记分子分解代谢产生的化合物（包括衍生的生物量）的浓度和同位素富集度；
- 对每种消耗的标记分子进行质量与同位素平衡计算，并对数据集进行进一步整合分析，通过确定通量比值，获得微生物对多种营养源利用情况的全局性概述。

应用该方法时，必须注意菌株/微生物在不同培养之间的可重复行为。此外，应于不同培养过程中相同的明确定义的发酵阶段取样。在本论文所报告的实验工作中，采用机器人辅助系统对发酵过程进行在线监测，以满足这些要求。

此外，选择一组合适的标记底物（包括化合物种类、标记性质及标记位置）对于解决研究中的科学问题至关重要。本研究中选择了15N标记的铵盐、谷氨酰胺和精氨酸，因为它们是葡萄汁中三种主要的氮源。这使得我们能够评估氮素从被消耗的化合物重新分配到蛋白质氨基酸中的模式。我们还旨在探究被消耗氨基酸的碳骨架的去向及其对挥发性分子生成的贡献。为实现这一目标，研究中加入了均匀13C标记的亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸，这些氨基酸来源于Ehrlich途径中的主要中间产物。

总体而言，我们定量研究了酵母在发酵过程中如何通过重新分配外源性氮源以满足其生物合成需求，从而应对复杂的氮资源，同时将过量的碳前体以挥发性分子形式排出。本文报道的实验方法可应用于研究其他微生物利用多种营养源的情况。该方法似乎是分析遗传背景或环境条件对微生物代谢行为影响的合适途径。

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方案

1. 发酵与取样

  1. 培养基与发酵罐的准备
    注意：所有发酵实验均平行进行，使用相同菌株及相同的化学成分明确的合成培养基（SM，组分见表1），该培养基包含铵盐与氨基酸混合物作为氮源15。在每次发酵中，仅有一种氮化合物以完全标记的13C或15N形式（100%）提供，其余氮源保持未标记状态。对于实验系列中使用的每一种标记氮源（此处为：15NH4、U-15N4-Arg、U-15N2-Gln、U-13C6-Leu、U-13C5-Val、U-13C6-Ile、U-13C4-Thr），需准备两个发酵罐。对于每种条件，另设两组仅使用未标记分子的重复发酵（共7组对照发酵）。
    1. 针对每种待研究的氮源，配制500 mL SM培养基，其中包含表1所列全部氮源，但排除将要以100%标记形式添加的化合物。
      注意：标记分子将在后续步骤中加入。
    2. 将各培养基置于含磁力搅拌子的1 L烧瓶中，进行巴氏灭菌（10 min，100 °C）。称取适量标记化合物，使其达到表1中指定的终浓度，并将其溶解于培养基中。
    3. 使用一次性真空过滤装置（醋酸纤维素膜，0.22 µm）对培养基进行灭菌。用无菌量筒将培养基均分至两个预先灭菌的发酵罐（各250 mL）中，每个发酵罐内含磁力搅拌子，并配备发酵锁，以防止氧气进入同时允许CO2释放。
    4. 将发酵瓶置于28 °C恒温培养室中过夜（设定温度为28 °C），使其升温至工作温度。
  2. 接种与发酵过程监测
    1. 在28 °C、振荡（150 rpm）条件下，将S. cerevisiae菌株接种于含10 mL YPD培养基的无菌试管中，培养12 h。随后，用移液器取1 mL YPD预培养液转移至含10 mL SM培养基的15 mL无菌试管中。在28 °C、振荡（150 rpm）条件下继续培养12 h。
    2. 在超净工作台内，取预培养液一定量样品，使用配备100 µm孔径的电子颗粒计数器测定细胞浓度。将预培养液离心（2,000 × g，15 min，4 °C），弃上清，将沉淀重悬于适量无菌水中，使最终细胞浓度为2.5 × 108 个细胞/mL。向每个发酵罐中接种1 mL细胞悬液。
      注意：用于监测发酵进程的机器人系统详见图1。
    3. 将发酵罐安装至支撑导轨，并将其正确放置于21孔搅拌板上，完成发酵平台的准备，设定搅拌速率为270 rpm。为启动各发酵罐的在线监测，运行机器人控制程序，点击"start assay"按钮，并选择要进行的发酵体积（300 mL）。
    4. 显示的界面允许设定发酵罐在平台上的数量与位置。为确保正确设置，右键点击相应插槽位置，并选择"enable"以激活该位置发酵罐的监测功能。
    5. 在开始称重采集前，初始化系统中持续运行的计算软件。点击"Initialiser"按钮，再点击"ok"确认。随后点击机器人控制程序中的"Start button"按钮，开始重量采集。
  3. 取样程序
    注意：对于每个发酵罐，当CO2产量（由运行计算软件的计算机实时显示）达到预设值时进行取样：本研究中分别为5、10、40和90 g/L。
    1. 含标记化合物培养物的取样程序。
      1. 取两份6 mL样品，离心（2,000 × g，5 min，4 °C）。将上清液分装保存，冷冻储存于-80 °C。沉淀用5 mL蒸馏水洗涤两次，-80 °C保存，用于同位素富集度测定。
    2. 不含标记化合物培养物的取样程序
      1. 收集10 mL培养液，用于干重测定。取两份10 mL样品，离心收集细胞（2,000 × g，5 min，4 °C）。沉淀用10 mL蒸馏水洗涤两次，-80 °C保存，用于蛋白质与氨基酸含量测定。

2. 消耗氮源的定量分析

  1. 残余氨浓度的酶法测定
    注意：上清液中氨浓度的测定使用商业化的基于酶的试剂盒进行；所有试剂均由制造商提供。
    1. 通过将25 mg精确称量的(NH4)2SO4溶解于100 mL容量瓶中，配制标准氨溶液（61.4 mg/L）。
    2. 根据制造商说明，对发酵前及释放5 g/L CO2时采集的样品进行1:2稀释。通过加入1 M KOH将样品pH调节至约8。记录所加体积，并在计算稀释倍数时予以考虑。
    3. 在4 mL分光光度计比色皿中，加入100 µL样品（必要时已稀释）或蒸馏水或标准氨溶液，再加入2 mL试剂1（含0.75 mM ADP和30 U/mL谷氨酸脱氢酶的pH 7.8缓冲液）和500 µL试剂2（1.3 mM NADH）。室温孵育15分钟，于340 nm处测定NADH吸光度（A1）。
    4. 加入500 µL试剂3（pH 8缓冲液中含60 mM α-酮戊二酸），室温孵育20分钟，于340 nm处测定NADH吸光度（A2）。
    5. 使用以下公式计算氨浓度：
      C氨 (g/L) = 0.083 × [(0.839 × A1 - A2)样品 - (0.839 × A1 - A2)蒸馏水]
    6. 使用标准溶液验证所得浓度是否准确。
  2. 残余氨基酸浓度的色谱测定
    注意：上清液中氨基酸浓度的测定采用专用氨基酸分析系统，该系统基于离子交换色谱法，并在色谱柱后使用茚三酮对含氮化合物进行衍生化，从而实现比色检测。
    1. 通过将200 µL商品化的中性和酸性氨基酸混合液、200 µL商品化的碱性氨基酸混合液以及200 µL 2.5 mM谷氨酰胺加入400 µL pH 2.2的200 mM柠檬酸锂缓冲液中，配制参考溶液。该化学成分明确的参考溶液作为样品处理。
    2. 向800 µL样品中加入200 µL含2.5 mM正亮氨酸（内标）的25%（w/v）磺基水杨酸溶液，以去除高分子量物质。4 °C孵育1小时，离心（3,000 × g，10分钟，4 °C），并通过0.22 µm孔径的硝酸纤维素膜（注射器系统）过滤。
    3. 在程序软件中点击"运行"按钮，启动配备阳离子交换柱（锂型）的分析仪进行液相色谱（LC）分析。通过依次使用不同锂缓冲液洗脱氨基酸，同时建立pH梯度、反离子浓度梯度以及温度梯度（表2）。
    4. 在茚三酮衍生化后，通过分光光度检测器在570 nm（紫色显色：茚三酮与氨基酸氨基的反应）和440 nm（黄色显色：茚三酮与脯氨酸亚氨基的反应）定量氮化合物。
    5. 使用参考溶液及正亮氨酸作为内标，通过单点内标法，在制造商提供的软件中计算样品中氨基酸的浓度。

3. 蛋白源性氨基酸的定量分析

  1. 干细胞重量的测定
    1. 使用真空装置，将10 mL培养液通过预先在铝杯中称重的硝酸纤维素滤膜（孔径0.45 µm）过滤。用50 mL蒸馏水洗涤两次。
    2. 将滤膜置于铝杯中，在105 °C的烘箱中干燥48小时（直至重量无进一步变化），然后重新称量铝杯中的滤膜。计算前后重量差值。
    3. 至少进行3次独立测量并计算其平均值，以准确测定酵母培养物的干重。
  2. 细胞蛋白质含量的定量分析
    注意：使用按照1.3.2节所述方法获得的未标记细胞沉淀，至少进行三次重复实验，以定量细胞的蛋白组分。
    1. 将1 mL DMSO溶液（50% v/v）加入冷冻沉淀中，通过孵育在干热烘箱中105 °C下1 h提取蛋白质。
    2. 使用基于蛋白质还原Cu的生化比色法测定DMSO提取物中的蛋白含量++ 进入 Cu+ 由二喹啉甲酸在蓝色复合物中进一步沉淀的离子（BCA法）。
  3. 蛋白质中氨基酸相对贡献的测定
    注意：需对未标记的细胞沉淀（1.3.2）至少进行三次重复测定，以确定蛋白质氨基酸谱。
    1. 将细胞沉淀重悬于200 µL过甲酸（90%甲酸，10%过氧化氢）中，制备氧化提取物。在4 °C孵育4小时，加入33.6 mg硫酸钠终止反应。
      注意：氧化步骤旨在将半胱氨酸和甲硫氨酸转化为甲硫氨酸砜和半胱酸，以便通过离子交换色谱进一步定量。然而，部分氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸）在氧化处理过程中会发生变性。因此，需制备两份水解物（一份经氧化处理，另一份未经氧化处理）。
    2. 向细胞沉淀或氧化提取物中加入800 µL 6N HCl，将样品置于密闭的玻璃管中，在干热烘箱中110 °C条件下孵育16小时。加入200 µL 2.5 mM 正亮氨酸，用氮气流去除HCl。用800 µL蒸馏水重悬并用氮气流去除液体，洗涤两次，再用800 µL乙醇洗涤一次。最后用800 µL 200 mM乙酸锂缓冲液（pH 2.2）重悬。
      注意：水解孵育时间需特别注意，因为某些氨基酸在酸性条件下不稳定。蛋白质中的色氨酸组分含量根据文献数据估算。16因为该氨基酸在盐酸水解过程中会完全变性。
    3. 为单点内标校准制备水解物标准品。取160 µL商品化氨基酸水解液，加入840 µL含625 µM甲硫氨酸砜、625 µM半胱酸和625 µM正亮氨酸的200 mM乙酸锂缓冲液（pH 2.2）中。
    4. 使用第2.2节所述的色谱方法测定蛋白质中氨基酸的相对浓度。
  4. 计算
    1. 通过将每种氨基酸的测定含量（mg/L）除以蛋白质提取物中测定的氨基酸总量（mg/L 的总和），计算每种氨基酸在蛋白质中的质量百分比。
    2. 将该百分比乘以培养物中的蛋白质浓度（mg/L）。 即生物量中蛋白质含量与干重的乘积，用于评估培养物中每种蛋白源性氨基酸的浓度（mg/L）。

4. 蛋白源性氨基酸同位素富集度的测定

注意：在测定蛋白质源性氨基酸的同位素富集度时，使用标记的细胞沉淀。在衍生化步骤中采用三种不同的试剂，以定量氨基酸的同位素富集度。通过测定簇离子的强度来评估氨基酸的标记模式。每个簇离子的信号对应于某一氨基酸片段的质量同位素异构体（m0 = 无标记，m+1 = 1个标记原子，…）的丰度。在图2中提供了DMADMF方法后获得的色谱图示例。

  1. 生物量水解
    1. 向细胞沉淀（相当于1-2 mg干重生物量）中加入1.2 mL 6 M HCl，在密闭玻璃管中于干燥热烘箱中105 °C孵育16 h，进行水解。
    2. 加入1.2 mL蒸馏水，以3,000 × g离心5 min以去除细胞碎片。将上清液分装为六份，每份400 µL，置于敞口玻璃管中。在105 °C热烘箱中干燥至糖浆状（4-5 h）。
  2. 乙基氯甲酸酯（ECF）衍生化
    1. 将干燥的水解物溶解于200 µL 20 mM HCl中，然后加入133 µL吡啶:乙醇（1:4）。加入50 µL ECF以衍生化氨基酸，并等待所有CO2释放完毕。将混合物转移至含有500 µL二氯甲烷的离心管中，以萃取衍生化产物。
    2. 涡旋振荡管子10 s，然后以10,000 × g离心4 min；用巴斯德移液管收集下层有机相，并转移至含有锥形玻璃衬管的GC小瓶中，以便样品可直接进样至GC/MS仪器。
  3. (N,N)-二甲基甲酰胺二甲基缩醛（DMFDMA）衍生化
    1. 将干燥的水解物溶解于50 µL甲醇和200 µL乙腈中。加入300 µL DMFDMA。涡旋振荡管子，然后将样品转移至含有锥形玻璃衬管的GC自动进样小瓶中。
  4. N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化
    1. 将水解物悬浮于200 µL乙腈中。加入200 µL BSTFA，将玻璃管严密封闭，在135 °C孵育4 h，然后将提取物直接转移至GC小瓶中。
  5. 气相色谱-质谱（GC-MS）分析
    1. 使用配备自动进样器进样装置并与质谱仪联用的气相色谱仪分析样品。
      1. 使用仪器专用软件控制设备并分析色谱图。在"序列"菜单中，点击"样品日志表"创建样品列表，并点击"运行"按钮开始进样。
        注：气相色谱仪配备一根30 m × 0.25 mm非极性石英毛细管柱，膜厚0.15 μm。所有分析中，设定质谱仪四极杆温度为150 °C，传输线温度保持在250 °C。采用三种分析程序，每种程序分别对应一种衍生化试剂。
      2. ECF衍生化物：以氦气为流动相，流速1.2 mL/min。设定进样口温度为230 °C，离子源温度为250 °C。设置自动进样器以3:1的分流比进样1 µL样品。运行分析时，逐步升高柱温箱温度：130 °C保持3 min；以15 °C/min升至260 °C；在260 °C保持20 min。
      3. DMFDMA衍生化物：以氦气为流动相，恒定流速1.2 mL/min。设定进样口温度为230 °C，离子源温度为250 °C。设置自动进样器以3:1的分流比进样1 µL样品。运行分析时，逐步升高柱温箱温度：60 °C保持1 min；以20 °C/min升至130 °C；再以4 °C/min升至260 °C；在260 °C保持10 min。
      4. BSTFA衍生化物：以氦气为流动相，恒定流速1.2 mL/min。设定进样口温度为275 °C，离子源温度为300 °C。运行分析（进样量：1 µL），逐步升高柱温箱温度：110 °C保持1 min；以2 °C/min升至154 °C；再以5 °C/min升至300 °C；在300 °C保持10 min。
      5. 检测程序：针对每种衍生化方式，以SCAN模式进样（1 µL），采用70 eV正电子轰击电离，记录各氨基酸的保留时间。
      6. 利用这些数值确定色谱图中各时间段以及各氨基酸特征离子（见表3）的选择离子监测（SIM）窗口，并为每种氨基酸包含这些信息。将该信息输入SIM检测程序，以70 eV正电子轰击电离模式在SIM模式下运行分析。
    2. 收集分析结果；即针对每种氨基酸，记录对应其不同质量同位素异构体（mass isotopomers）的一组强度值。使用专用软件17对数据进行处理，校正天然标记背景，计算蛋白源性氨基酸的同位素富集度（定义为蛋白质样品中某氨基酸被标记部分占其总量的比例）。
      注：分子的同位素富集度（I.E.），以百分比表示，通过将带有标记的质量同位素异构体（m1、m2、…mn）的校正强度之和除以所有质量同位素异构体（m0、m1、m2、… mn）的校正强度总和计算得出：
      I. E. = (m1 + m2 + …+ mn) / (m0 + m1+ m2 + …+ mn)

5. 挥发性化合物的定量与同位素富集

  1. 标记挥发性化合物的提取
    1. 在15 mL玻璃试管中，向5 mL上清液中加入10 µL氘代内标物（氘代化合物终浓度：100 µg/L）。加入1 mL二氯甲烷，严密封闭试管，并在摇床平台上振荡20分钟。在3,000 × g条件下离心5分钟，收集下层有机相至另一15 mL玻璃试管中。重复一次二氯甲烷萃取步骤。
    2. 将有机提取物通过500 mg无水硫酸钠干燥，用巴斯德移液管收集液相。在氮气流下将提取物浓缩至原体积的四分之一，然后转移至气相色谱自动进样瓶中。
  2. 挥发性化合物的气相色谱-质谱定量分析
    1. 使用一根30 m × 0.25 mm熔融石英毛细管柱（膜厚0.25 μm）装配气相色谱仪，并设定氦气恒流为1.0 mL/min。进样口和传输线温度均保持在250 °C。
    2. 进样2 µL样品，分流比为10:1，采用以下程序升温条件分离提取的挥发性分子：初始温度40 °C保持3分钟，以4 °C/min升温至220 °C，然后在220 °C保持20分钟。
    3. 使用质谱检测器进行化合物检测，离子源温度设为230 °C，质谱四极杆温度设为150 °C。采用选择离子监测（SIM）模式记录质谱图，电子轰击电离能量为70 eV，并使用表4中列出的针对各挥发性化合物的特征离子簇。
    4. 采用外标七点校准法，根据相应离子簇的强度总和对挥发性分子的浓度进行定量。将每种化合物配制成10 g/L的储备液，溶剂为100%乙醇。然后，通过混合储备液配制各类挥发性分子的标准溶液（包括乙酯类、乙酸酯类、醇类和酸类）。最后，将不同量的标准溶液稀释于含5 g/L酒石酸、pH调至3.3的12%醇水溶液中，制备校准溶液。
    5. 同时，校正各离子簇强度中天然同位素标记的背景信号，并计算挥发性化合物的同位素富集度，该值定义为分子中标记部分所占比例，以百分比表示，使用专用软件17完成计算。

6. 数据集综合分析的计算方法

  1. 原始数据的采集
    1. 使用所示的电子表格 表5、表6、表7 和 8, 输入与细胞外氨基酸浓度、细胞干重、细胞蛋白质含量、挥发性分子浓度以及蛋白质源性氨基酸和挥发性分子同位素富集度相对应的原始数据值。
      注意：表中所示数据以 mM 表示。所有结果也可通过将 mM 值乘以各分子的分子量转换为 mg/L，或通过将蛋白源性氨基酸的毫摩尔浓度乘以氮的原子质量（14 u）及该分子分解代谢所提供的氮原子数目，转换为 mg N/L。
    2. 通过将水解物中每种氨基酸的含量（mg/L）除以氨基酸总量（所有氨基酸含量之和，单位为 mg/L），计算每种氨基酸在蛋白质中的质量百分比。
    3. 根据独立实验获得的数据计算均值、标准差和均值标准误。
    4. 通过将每种氨基酸在蛋白质中的百分比（mg氨基酸/g蛋白质）乘以生物质中的蛋白质比例（g蛋白质/g干重）以及培养基中的干重含量（生物量产量，g干重/L），计算每种氨基酸的蛋白质源性浓度（mg/L）。
  2. 15氮同位素示踪实验
    1. 使用所提供的电子表格 表9计算蛋白质氨基酸中氮的标记部分和未标记部分（以 mg N/L 表示），需根据其总浓度（以 mg N/L 表示）和同位素富集度进行推算。对于每种氨基酸，标记部分等于其总浓度与同位素富集度的乘积，未标记部分则为总浓度与标记部分之差。
    2. 然后，通过将本研究中定量的蛋白源性氨基酸（Ala、Gly、Val、Asp、Phe、Leu、Ile、Thr、Ser、Pro、Lys、His、Glu 和 Arg）的总氮含量（以 mg N/L 计）相加，再用蛋白质中的总氮含量除以该总和，计算这些氨基酸所含氮占蛋白质总氮的比例。
    3. 通过加和本研究中定量的蛋白源性氨基酸（Ala、Gly、Val、Asp、Phe、Leu、Ile、Thr、Ser、Pro、Lys、His、Glu 和 Arg）的标记部分（以 mg N/L 表示），计算由精氨酸、谷氨酰胺或铵提供的、并在这些蛋白源性氨基酸中回收的氮量，该计算基于在含有以下物质的实验条件下获得的数据 15使用同位素标记的精氨酸、谷氨酰胺或铵盐中的氮，并将这些标记氮在定量的蛋白质源性氨基酸总氮量中所占的比例进行计算。
    4. 评估3种最丰富的氨基酸对细胞内氮库的贡献，该氮库用于 从头合成 通过整合来自的生物合成数据 13C 和 15氮同位素示踪实验（电子表格在 表7).
    5. 从总含量（以 mM 表示）的蛋白源性 Val、Leu、Ile 或 Thr 中，扣除由摄入化合物直接掺入所产生的部分13C 实验）以及其中的部分 从头合成 利用三种主要氮源合成，以评估其组分比例 从头合成 利用其他氨基酸中的氮合成。
    6. 然后，计算氨基酸的量之比 从头合成 利用谷氨酰胺（Gln）、精氨酸（Arg）和NH₃提供的氮合成4+ 将精氨酸、谷氨酰胺和铵对细胞内氮库的贡献量化为这三者总和（以 mM 表示）与总蛋白源性氨基酸（以 mM 表示）的比值。
  3. 13C同位素示踪实验
    1. 根据实验中测得的蛋白源性氨基酸浓度（以 mM 表示）及其同位素富集度，计算蛋白源性氨基酸的标记与未标记组分比例 13C标记的Leu、Val、Ile或Thr。（参见6.2.1， 表10).
    2. 根据实验中在存在条件下测得的挥发性化合物浓度（以 mM 表示）及其同位素富集度，计算挥发性化合物的标记部分和未标记部分 13C标记的Leu、Val、Ile或Thr（表10).

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结果

图3展示了为研究酵母在葡萄酒发酵过程中对多种氮源的调控机制所采用的工作流程示意图。
在不同取样时间点，生物学参数——包括生长特性、氮源消耗模式以及蛋白质源性氨基酸的分布特征——在多次发酵实验中表现出高度可重复性（图4）。这种一致性验证了基于14次独立发酵实验所产生数据整合分析方法的有效性。

图5 展示了氮素从葡萄汁中可利用的来源向所有蛋白质源性氨基酸重新分配的全面概览。该分析主要基于在存在条件下进行的实验所获得的结果 15含氮标记化合物。结合质量与同位素平衡的测定，对蛋白质源性氨基酸同位素富集度的测量首次量化了来源于精氨酸、谷氨酰胺、铵盐及其他前体的氮对这些化合物中各个氨基的贡献。此处强调的氮素显著再分配反映了其在代谢过程中的重要作用。 ...

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讨论

利用同位素示踪实验量化化合物在代谢网络中的分布是理解微生物代谢运行机制的一种有前景的方法。尽管该方法已成功应用于一种或两种标记底物的研究，但目前尚无法通过多种元素同位素标记来研究不同来源物质的代谢即，超过两种底物）。事实上，现有的分析技术仅在使用单一元素的同位素标记时，或可能在双元素共标记时，才能准确定量测定蛋白质源性氨基酸及其他分子的标记模式。因此，为了克服这些限制并评估微生物对多种营养源的利用情况，我们选择在相同环境条件下重复进行一系列培养实验，每次实验中仅对选定的一种底物进行同位素标记 13C 或 15氮同位素。随后，进一步结合每种方法所提供的特异性信息 13C 或 15氮示踪实验为多种来源的代谢提供了定量的扩展视角。

所报道方法的成功依赖于在标准条件下进行可重复的一系列培养，以及从处于相同生理状态的细胞群体中采集样本，该状态对所有培养物均一致（细胞生长、底物消耗， 等等。）。这些条件必须得到满足，以便将来自独立实验的数据合并并进行联合分析。满足这些约束...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Jean-Roch Mouret、Sylvie Dequin 和 Jean-Marie Sabalyrolles 为机器人辅助发酵系统的构思所做出的贡献，感谢 Martine Pradal、Nicolas Bouvier 和 Pascale Brial 提供的技术支持。本项目经费由法国国民教育部、研究与技术部提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
D-葡萄糖PanReac141341.0416
D-果糖PanReac142728.0416
DL-苹果酸Sigma AldrichM0875
一水柠檬酸Sigma AldrichC7129
磷酸二氢钾Sigma AldrichP5379
硫酸钾Sigma AldrichP0772
七水硫酸镁Sigma Aldrich230391
二水氯化钙Sigma AldrichC7902
氯化钠Sigma AldrichS9625
氯化铵Sigma AldrichA4514
氢氧化钠Sigma Aldrich71690
一水硫酸锰Sigma AldrichM7634
七水硫酸锌Sigma AldrichZ4750
五水硫酸铜(II)Sigma AldrichC7631
碘化钾Sigma AldrichP4286
六水氯化钴(II)Sigma AldrichC3169
硼酸Sigma AldrichB7660
七钼酸铵Sigma AldrichA7302
肌醇Sigma AldrichI5125
泛酸钙半钙盐Sigma Aldrich21210
盐酸硫胺素Sigma AldrichT4625
烟酸Sigma AldrichN4126
吡哆醇Sigma AldrichP5669
生物素Sigma AldrichB4501
麦角é醇Sigma AldrichE6510
吐温80Sigma AldrichP1754
无水乙醇VWR Chemicals101074F
六水三氯化铁Sigma Aldrich236489
L-天冬氨酸Sigma AldrichA9256
L-谷氨酸Sigma AldrichG1251
L-丙氨酸Sigma AldrichA7627
L-精氨酸Sigma AldrichA5006
L-半胱氨酸Sigma AldrichC7352
L-谷氨酰胺Sigma AldrichG3126
甘氨酸Sigma AldrichG7126
L-组氨酸Sigma AldrichH8000
L-异亮氨酸Sigma AldrichI2752
L-亮氨酸Sigma AldrichL8000
L-赖氨酸Sigma AldrichL5501
L-甲硫氨酸Sigma AldrichM9625
L-苯丙氨酸Sigma AldrichP2126
L-脯氨酸Sigma AldrichP0380
L-丝氨酸Sigma AldrichS4500
L-苏氨酸Sigma AldrichT8625
L-色氨酸Sigma AldrichT0254
L-酪氨酸Sigma AldrichT3754
L-缬氨酸Sigma AldrichV0500
13C5-L-缬氨酸EurisotopCLM-2249-H-0.25
13C6-L-亮氨酸EurisotopCLM-2262-H-0.25
15N-氯化铵EurisotopNLM-467-1
ALPHA-15N-L-谷氨酰胺EurisotopNLM-1016-1
U-15N4-L-精氨酸EurisotopNLM-396-PK
乙酸乙酯Sigma Aldrich270989
丙酸乙酯Sigma Aldrich112305
2-甲基丙酸乙酯Sigma Aldrich246085
丁酸乙酯Sigma AldrichE15701
2-甲基丁酸乙酯Sigma Aldrich306886
3-甲基丁酸乙酯Sigma Aldrich8.08541.0250
己酸乙酯Sigma Aldrich148962
辛酸乙酯Sigma AldrichW244910
癸酸乙酯Sigma AldrichW243205
十二酸乙酯Sigma AldrichW244112
乳酸乙酯Sigma AldrichW244015
丁二酸二乙酯Sigma AldrichW237701
2-甲基丙基乙酸酯Sigma AldrichW217514
2-甲基丁基乙酸酯Sigma AldrichW364401
3-甲基丁基乙酸酯Sigma Aldrich287725
2-苯乙基乙酸酯Sigma Aldrich290580
2-甲基丙醇Sigma Aldrich294829
2-甲基丁醇Sigma Aldrich133051
3-甲基丁醇Sigma Aldrich309435
己醇Sigma Aldrich128570
2-苯乙醇Sigma Aldrich77861
丙酸Sigma Aldrich94425
丁酸Sigma Aldrich19215
2-甲基丙酸Sigma Aldrich58360
2-甲基丁酸Sigma Aldrich193070
3-甲基丁酸Sigma AldrichW310212
己酸Sigma Aldrich153745
辛酸Sigma AldrichW279900
癸酸Sigma AldrichW236403
十二酸Sigma AldrichL556
1L发酵罐LegallaisAT1357手工制作的发酵用发酵罐
一次性真空过滤系统Dominique Deutscher029311
发酵罐（250 ml）LegallaisAT1352手工制作的发酵用发酵罐
无菌管Sarstedt62.554.502
发酵锁LegallaisAT1356手工制作的发酵用发酵锁
酵母提取物Becton, Dickinson and Company212750
蛋白胨Becton, Dickinson and Company211677
摇床培养箱Infors HT
颗粒计数器Beckman Coulter6605697Multisizer 3 Coulter计数器
离心机JouanGR412
平板搬运机器人系统Lab Services BVPF0X-MA自动化仪器
平板搬运机器人软件Lab Services BV机器人监控软件
RobView自主研发的计算软件
My SQL国际源数据库
Cimarec i Telesystem 多点搅拌器Thermo Fisher Scientific50088009String Drive 60
BenchBlotter 平台摇床Dutscher60903
氨酶法检测试剂盒R-Biopharm AG5390
分光光度计比色皿VWR634-0678
分光光度计 UviLine 9400Secomam
氨基酸标准品 生理型 - 酸性及中性Sigma AldrichA6407
氨基酸标准品 生理型 - 碱性Sigma AldrichA6282
柠檬酸锂缓冲液 - 茚三酮显色剂BiochromBC80-6000-06
磺基水杨酸Sigma AldrichS2130
正亮氨酸Sigma AldrichN1398
Biochrom 30 AAABiochrom
EZChrom EliteBiochrom仪器控制与数据分析软件
Ultropac 8 树脂 锂型BiochromBC80-6002-47锂型高分辨率生理柱
滤膜 Millex GVMerck MilliporeSLGVX13NLMillex GV 13mm（孔径 0.22 µm）
膜滤器 PALLVWR514-4157Supor-450 47mm 0.45µm
真空泵 Millivac MiniMilliporeXF5423050
铝制光滑称量皿 70mmVWR611-1380
精密天平Mettler规格 AE163
干燥二甲基亚砜Merck1029310161（最大含水量 0.025% H2O）SeccoSolv
燃烧炉Legallais
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒InterchimUP40840A
甲酸Fluka94318
过氧化氢Sigma AldrichH1009
37%发烟盐酸 EmsureMerck1003171000ACS、ISO、Reag. Ph Eur 级
乙酸锂缓冲液Biochrom80-2038-10
市售水解氨基酸溶液Sigma AldrichAAS18
L-甲硫氨酸砜Sigma AldrichM0876
L-半胱氨酸酸一水合物Sigma Aldrich30170
Pyrex 玻璃培养管Sigma AldrichZ653586
吡啶Acros Organics13178050099% 超纯
氯甲酸乙酯Sigma Aldrich23131
二氯甲烷Sigma Aldrich32222
样品瓶Sigma Aldrich854165
1.5ml 样品瓶用微型内插管Sigma AldrichSU860066
GC/MSAgilent Technologies5890 GC/5973 MS
ChemstationAgilent Technologies仪器控制与数据分析软件
甲醇Sigma Aldrich34860Chromasolv，用于 HPLC
乙腈Sigma Aldrich34998ChromasolvPlus，用于 HPLC
N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛Sigma Aldrich394963
BSTFASigma Aldrich33024
DB-17MS 柱Agilent Technologies122-473130m*0.25mm*0.15µm
无水硫酸钠Sigma Aldrich238597
工业级氮气Air products14629
Zebron ZB-WAX 柱Phenomenex7HG-G007-1130m*0.25mm*0.25µm
高纯氦气Air products26699
玻璃巴斯德吸管VWR612-1702

参考文献

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