本方案旨在从含有非靶标背景细胞的混合物中分离并制备稀有靶细胞，用于单细胞水平的分子遗传学表征。所获得的DNA质量与未经处理的单细胞相当，适用于单细胞分析（包括基于筛查和靶向分析的应用）。
本文内容
摘要
摘要
可利用针对目标细胞表面蛋白的特异性抗体，从大量非目标细胞背景中分离出稀有目标细胞。一种新近开发的方法采用经抗上皮细胞黏附分子（EpCAM）抗体功能化的医用导丝，用于 体内 循环肿瘤细胞（CTCs）的分离1一项针对非转移性前列腺癌的患者匹配队列研究表明，该 体内 分离技术与当前循环肿瘤细胞（CTC）计数的金标准相比，能够获得更高比例的CTC阳性患者以及更高的CTC数量。由于现有医疗装置无法回收捕获的细胞，研究人员研制了一种新型功能化导丝（以下简称“装置”），可通过酶处理实现细胞的捕获及后续脱离。细胞可在该装置表面附着，经显微镜观察确认后，通过酶处理将其脱离。回收的细胞通过细胞离心法沉积于膜包被的载玻片上，并利用激光显微切割或显微操作技术进行单个细胞分离。单细胞样本随后进行单细胞全基因组扩增，以支持多种下游分析，包括筛查性及靶向性分析方法。该分离与回收流程可从单个细胞中获得高质量DNA，且不影响后续的全基因组扩增（WGA）。单个细胞扩增所得DNA可进一步用于筛查和/或靶向分析，如芯片比较基因组杂交（array-CGH）或测序。该装置允许 离体 从人工稀有细胞样本中分离（即 500个靶细胞加入至5 mL外周血中）。尽管细胞的脱落率尚可接受（50–90%），但脱落细胞在载玻片上的回收率则因所用细胞系的不同而存在较大差异（<10 - >50%），需要进一步关注。该设备尚未获得用于患者的批准。
引言
最近，一种名为 CellCollector DC01 的医用导丝被纳入循环肿瘤细胞（CTC）计数的方法体系，该导丝经抗 EpCAM 抗体功能化修饰，可用于从癌症患者外周血中分离 CTC1,2,3在一项正在进行的非转移性前列腺癌研究中，这种功能化导丝检测出的CTC阳性患者数量几乎是CellSearch（循环肿瘤细胞计数的金标准）的两倍，且在CTC阳性患者中检出的CTC数量也更高3由于这一令人鼓舞的表现，从功能化医用导丝上分离细胞以进行单细胞分析将具有重要意义，但目前尚无有效的酶解处理方法结合细胞解离溶液来实现这一目标。例如 胰蛋白酶消化或激光显微切割均无法回收完整的细胞（数据未显示）。
为了实现捕获细胞的脱离，新一代功能化导线配备了一种特定聚合物。该聚合物将捕获抗体与导线连接，并可被释放缓冲液处理，从而实现完整细胞的脱离（称为Device的CellCollector DC03）。这种新型功能化装置能够从掺入牛血清白蛋白（BSA）/磷酸盐缓冲液（PBS）以及外周血中的不同浓度癌细胞系细胞中分离目标细胞。
为便于在装置上进行细胞的视觉识别及回收后的观察，目标癌细胞在回收处理前需用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）和DNA染料进行标记即充电与分离）。该处理对单细胞DNA质量的影响此前已通过全基因组扩增（WGA）后的质控PCR进行评估4,5，染色体微阵列比较基因组杂交6,7 和靶向测序7 与从未处理的细胞悬液中通过显微操作获得的细胞相比，无显著差异7该方法的优势在于稀有靶细胞的预富集与细胞回收相结合，可用于单细胞水平的下游分析图1）。目前获得CE认证的 体内 捕获装置通常用于循环肿瘤细胞的计数，而非单细胞分子表征2,8然而，要深入研究循环肿瘤细胞（CTCs）之间的异质性，仍需在单细胞水平上进行更为全面的分析。即 在单细胞水平上进行靶向测序。其他基于细胞的方法则依赖于通过免疫磁分离法富集 EpCAM 阳性的循环肿瘤细胞，并利用介电电泳技术对单个细胞进行操控，以用于后续的分子遗传学分析9,10循环肿瘤细胞（CTCs）的分子表征对于其在临床环境中的有效应用至关重要，同时在转移级联的基础研究中也具有同等重要性。与CTCs并行，循环肿瘤DNA（ctDNA）的重要性日益凸显，因其能够在最小技术分离步骤下实现对肿瘤负荷的DNA分析。11,12基于细胞的方法可能作为一种补充性手段，因为它能够用于RNA研究13,14 和蛋白15 表达分析，以及循环肿瘤细胞（CTC）来源的细胞培养或异种移植16,17尽管仍需克服细胞回收率低以及用于患者时的审批障碍，但捕获与释放方法在稀有靶细胞的表征研究中迈出了重要的下一步。
方案
所有实验程序均已获得格拉茨医科大学伦理委员会批准（编号：25-240 ex 12/13）。用于加标实验的外周血采自健康个体。
注意：本方案描述了从 PBS 或 HT-29 细胞与外周血的人工混合物中分离 HT-29 细胞（人结肠癌细胞系）的方法。该实验同样在另外两种细胞系（LNCaP 和 VCaP，代表性结果中提供实验数据）上进行，理论上适用于所有表达 EpCAM 的细胞。
1. 靶细胞的制备
- 细胞培养与细胞标记
注意：本实验方案中，细胞在75 cm²培养瓶中培养。若使用其他细胞培养容器，请相应调整试剂用量例如 25 cm² 培养皿，6 孔板， 等等）。所有使用的液体均在水浴中预热至 37 °C。除非另有说明，所有实验步骤均在室温（RT）下进行。- 在37 °C、5% CO₂条件下，使用添加了2 mM L-谷氨酰胺、20 mM Hepes、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的McCoy's 5a改良培养基培养HT-29细胞2 大气
- 当细胞融合度达到90%时，移除培养基，并用10 mL 1x PBS冲洗细胞。
- 为收集细胞，加入2 mL细胞解离溶液（材料与试剂表将细胞在37 °C下孵育约5分钟。
注意：细胞解离液含有蛋白酶和胶原酶，溶剂为1×PBS、0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和3 mg/L酚红。细胞解离液预热时间应尽量缩短，因其在37 °C下1小时后将失活。为获得最佳解离效果，应使解离液完全覆盖整个细胞层。 - 使用倒置显微镜检查细胞脱落情况。
- 将所有脱落的细胞转移至一个预先加入10 mL细胞培养基（与步骤1.1.1中所用相同）的50 mL离心管中，通过移液吹打重悬细胞。
- 将剩余的细胞悬液置于室温下的水平滚轴混合器上，然后进行标记步骤。
- 活细胞标记靶细胞
- 将1 µL 5 mM CFSE（溶于二甲基亚砜，DMSO）加入1 mL预热至37 °C的1×PBS中，配制成5 µM的CFSE标记工作液。
注意：为了获得最佳染色效果，请使用新鲜配制的溶液。 - 配制即用型DNA染色液（材料与试剂表) 在1×PBS中保存，并于2–6 °C避光储存。
注意：为了获得最佳染色效果，请使用新鲜配制的溶液。 - 从水平滚轴混合器中取出细胞（步骤1.1.6），在300 x g条件下离心收集细胞 g 孵育10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于10 mL 1×PBS中。
- 用1×PBS再次洗涤细胞，然后将细胞沉淀重悬于500 µL即用型CFSE标记溶液中。
- 在37 °C下孵育细胞15分钟，然后在300 x g条件下离心收集细胞 g 3 分钟。
- 将标记的细胞重悬于1 mL预热的细胞培养基中，在37 °C条件下孵育30分钟以恢复细胞状态。
- 通过离心（300 x g）收集细胞 g 3分钟，然后在37 °C下用1 mL即用型DNA染色液重悬细胞沉淀，孵育10分钟。
- 离心收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于4 mL 1×PBS中。使用血细胞计数板测定细胞密度，并使用配备4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片的荧光显微镜检查荧光标记情况。图 2A 以及2E).
- 以 300 x g 离心细胞 g 孵育3分钟，然后根据下一节所述实验所需的细胞密度重悬细胞沉淀，并置于冰上。
- 将1 µL 5 mM CFSE（溶于二甲基亚砜，DMSO）加入1 mL预热至37 °C的1×PBS中，配制成5 µM的CFSE标记工作液。
2. 给导线充电
注意：可从目标细胞/外周血加样中以毫升规模分离细胞，或以微升规模提供少量细胞。前一种方法可用于模拟外周血中的稀有细胞状态，而后一种方法可能是为了优化或测试实验方案而附着少量细胞时的首选方式。
- 使用大量细胞悬液对导线进行负载
- 通过将0.8 g BSA溶解于40 mL 1×PBS（用于细胞培养）中，配制2% BSA封闭液。先通过涡旋混合使BSA溶解，随后在室温下置于水平滚轴混合器上孵育10–20分钟以充分溶解。
- 用2 mL 2% BSA冲洗空的EDTA管或肝素钠管，以去除抗凝剂残留，然后弃去溶液。在管中加入5 mL 2% BSA，在水平滚轴混合器上以15 rpm于室温孵育30分钟，以封闭管壁表面，随后弃去溶液。
- 将已标记的细胞（第1.2节）稀释至密度为100 000个细胞/mL，并取5 mL用于对导线进行负载。
- 将5 mL标记后的细胞悬液（总计500 000个细胞）加入管中。添加细胞悬液时应避免产生气泡。
- 从储存室中取出导线及其固定用的橡胶帽，并用1×PBS冲洗导线（图3）。
- 使用注射器针头（20G）刺穿EDTA管的橡胶管帽（步骤2.1.4），将导线插入，确保当管帽重新盖回管上并将管置于倾斜滚轴混合器上时，导线的功能部分完全浸没于细胞悬液中。
注：在负载过程中，导线的三螺旋功能部分应始终被细胞悬液覆盖。 - 将管置于倾斜滚轴混合器上以5 rpm转速旋转30分钟，使细胞充分附着于导线表面。
- 用5 mL 1×PBS冲洗导线，随后将其置于含有1×PBS的15 mL管中，避光保存于2–6 °C，直至进行显微观察。
注：导线的功能部分必须始终浸没在PBS中，以避免对细胞造成损伤。
- 从外周血人工混合物中分离目标细胞 （替代方法：2.1. 使用大量细胞悬液对导线进行负载）
- 将已标记的细胞（第1.2节）进行稀释，获得高细胞密度的细胞悬液（> 1 000 000个细胞/mL），从而减少加入外周血中的细胞悬液体积。
- 将500至500 000个细胞加入5 mL外周血中，并通过翻转混匀管进行混合。
- 从储存室中取出导线，取下固定导线的橡胶帽，并用1×PBS冲洗导线。
- 使用注射器针头（20G）刺穿新管帽，将装置的非功能部分插入，确保当管帽重新盖回管上并将管置于倾斜滚轴混合器上时，功能部分完全浸没于加标血液中。
注：在负载过程中，导线的三螺旋功能部分应始终被细胞悬液覆盖。 - 将管置于倾斜滚轴混合器上，于室温以5 rpm转速孵育30分钟。
- 用1×PBS冲洗导线3次，随后将其置于含有1×PBS的15 mL管中，避光保存，直至进行显微观察。
注：导线的功能部分必须始终浸没在液体中，以避免对细胞造成损伤。
- 使用小体积细胞悬液对导线进行负载 （替代方法：2.1. 使用大量细胞悬液对导线进行负载）
- 将已标记的细胞以1 000 000个细胞/mL的密度重悬于1×PBS中。
- 将一支150 mm一次性玻璃巴斯德吸管水平固定在支架上。
- 从储存室中取出导线，但保留固定导线的黄色橡胶帽。
- 将导线放入巴斯德吸管中，使功能化部分位于吸管尖端内，且不接触玻璃管壁。
注：导线尖端不应伸出巴斯德吸管尖端外。避免用固定导线的橡胶帽堵塞巴斯德吸管尖端的后端。若密封过紧，将无法从另一侧向吸管尖端加载细胞悬液。 - 将15 µL细胞悬液加载至巴斯德吸管尖端，确保完全覆盖导线的功能化部分。
- 孵育10分钟，每隔1分钟手动将组装好的导线/巴斯德吸管尖端旋转四分之一圈。
- 从巴斯德吸管尖端取出导线，用5 mL 1×PBS冲洗，随后将其置于含有1×PBS的15 mL管中，避光保存于2–6 °C，直至进行显微观察。
注：功能部分必须始终浸没在1×PBS中，以避免对细胞造成损伤。
3. 计算导线上的细胞数量
注意：务必使导线的功能部分始终浸没在 1× PBS 中，以避免对细胞造成损伤。
- 使用记号笔在玻璃载玻片上画出一个矩形区域，并加入 500 µL 的 1× PBS。
- 将导线的非功能部分弯折，并将其放置在玻璃载玻片上，使功能部分浸入 1× PBS 中。
注意：调整矩形区域大小和 1× PBS 的体积，以完全覆盖导线的功能部分。使用双面胶带将导线的非功能部分固定在载玻片上。 - 用显微镜目视检查导线两侧，以统计捕获的细胞数量（图 2B 和 2F）。
注意：使用配备 DAPI 和 FITC 滤光片的荧光显微镜判断细胞的存在。可检查导线的两侧，根据附着细胞数量的多少，选择进行细胞数量评估（细胞数量较多时）或直接计数（仅当附着细胞数量较少时可行）。如果无需统计细胞数量，此步骤可省略。 - 扫描完成后，将导线放回含有 1× PBS 的 15 mL 离心管中（参见 2.3.6 节注释和第 3 节），并将导线置于避光环境中保存。
注意：导线大部分非功能部分（包括弯折部分）可剪除，以便于储存。
4. 目标细胞的解离与回收
注意：细胞分离后须在 4 小时内完成细胞解离。
- 每毫升 1x PBS 中溶解 4 mg 的释放缓冲液组分（材料与试剂表），并通过 0.2 µm 无菌滤膜过滤，得到可直接使用的缓冲液。
注意：导线的聚合物由一种水凝胶构成，该水凝胶经抗 EpCAM 抗体功能化修饰，可与表达 EpCAM 的靶细胞结合。释放缓冲液含有一种碳-氧蛋白水解酶，能够切割该水凝胶。蛋白水解作用导致聚合物降解，从而实现捕获细胞的脱离。 - 将释放缓冲液在 37 °C 预热 5 分钟。
- 向 1.5 mL 反应管中加入 1.6 mL 释放缓冲液以充满管体。
注意：设计容量为 1.5 mL 的反应管可容纳 1.6 mL 液体，这对于完全浸没导线的功能部分是必要的。 - 将导线的功能部分浸入释放缓冲液中，在 37 °C（水浴）条件下孵育 20 分钟。使用随导线提供的橡胶帽代替管盖，将导线固定于 1.5 mL 管中，以避免水浴孵育过程中发生污染。
- 将导线/管组件转移至室温下的摇床，以 500 rpm 振荡 15 分钟。
注意：摇床的振荡直径为 1.5 mm。 - 将导线/管组件放入离心机，以 300 x g 离心 10 分钟。
- 从管中取出导线，盖紧管盖后再次以 300 x g 离心 10 分钟。
注意：导线可在避光条件下于 2–6 °C 的 1x PBS 中保存，用于后续细胞计数，以评估细胞脱离效率或检测导线上残留的细胞。 - 为减少细胞悬液的体积，保留上清液 100 µL（用于显微操作）或另选保留 300 µL（用于细胞离心及后续激光显微切割），其余弃去，并立即进行单细胞取样。
5. 单细胞取样
- 显微操作
注意：单个细胞将被加入到 2 µL 细胞裂解主混合液中以进行全基因组扩增（WGA）。根据待处理细胞的数量配制主混合液，计算因移液造成的损耗并额外增加相应体积，并将细胞裂解主混合液置于冰上。- 根据 Czyż et al18 所述方案，配制细胞裂解主混合液（全基因组扩增试剂盒组分，材料与试剂表）。简言之，将 2.0 µL 反应缓冲液、1.3 µL 辛基苯基聚乙二醇醚（10% 溶液）、1.3 µL 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇（10% 溶液）、2.6 µL 蛋白酶 K 溶液以及 12.8 µL 无 RNase/DNase 水混合，得到用于 10 个样本的主混合液（总体积 20 µL）。
注意：若样本数量更多，按比例增加各组分体积。本步骤中细胞裂解主混合液的组成与使用激光显微切割样本的替代方案（见 5.2 节）所用混合液不同。 - 使用记号笔在载玻片上标记区域以固定细胞悬液。若细胞密度过高，则调整标记区域和体积（即 在载玻片上标记更大的区域，加入 1x PBS 及一份细胞悬液）。
- 将步骤 4.8 所得的全部染色细胞悬液用移液器滴加至载玻片上。
- 将载玻片转移至配备显微操作仪的显微镜下，静置 5 分钟使细胞沉降（图 2D 和 2H）。
- 准备 0.2 mL PCR 管，每管加入 2.0 µL 细胞裂解主混合液（见步骤 5.1.1），并置于冰上保存。
- 使用显微操作仪将单个细胞在 1 µL 1x PBS 中捕获，并转移至含有细胞裂解主混合液的 PCR 管中。
注意：转移显微操作捕获的细胞时，将毛细管直接插入 2 µL 裂解液中，并持续吹打直至观察到气泡产生。 - 使用台式微量离心机在 2000 x g 条件下短暂离心 3 秒，使所有液体沉至管底。将样本置于冰上。
- 立即进行单细胞全基因组扩增（见第 6 节及 Czyż et al.19）。
- 根据 Czyż et al18 所述方案，配制细胞裂解主混合液（全基因组扩增试剂盒组分，材料与试剂表）。简言之，将 2.0 µL 反应缓冲液、1.3 µL 辛基苯基聚乙二醇醚（10% 溶液）、1.3 µL 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇（10% 溶液）、2.6 µL 蛋白酶 K 溶液以及 12.8 µL 无 RNase/DNase 水混合，得到用于 10 个样本的主混合液（总体积 20 µL）。
- 激光显微切割 （替代单细胞取样方法：5.1 显微操作）
注意：本节所用主混合液的组成与第 5.1 节显微操作所用混合液不同。单个细胞将被加入 4.5 µL 细胞裂解主混合液（全基因组扩增试剂盒组分，材料与试剂表）中进行全基因组扩增。- 根据 Czyż et al.19 的方法配制细胞裂解主混合液：将 5.0 µL 反应缓冲液、1.3 µL 辛基苯基聚乙二醇醚（10% 溶液）、1.3 µL 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇（10% 溶液）、2.6 µL 蛋白酶 K 溶液以及 34.8 µL 无 RNase/DNase 水混合，得到用于 10 个样本的主混合液（总体积 45 µL）。将主混合液置于冰上。
注意：若样本数量更多，按比例增加各组分体积。 - 对适用于激光显微切割的膜包被载玻片进行紫外线处理。将载玻片放入 DNA 交联仪中，暴露于最强紫外光下约 10 分钟。
- 将膜包被载玻片安装至细胞离心机中，将全部细胞悬液以 300 x g 离心 5 分钟进行细胞沉降。
注意：若使用液体系统（即细胞在溶液中被离心至载玻片上），在细胞离心后去除上清液，并以 1140 x g 干离心 1 分钟。 - 立即进行激光显微切割，或让细胞离心样本在空气中干燥过夜，随后于 -20 °C 冷冻保存以长期储存。
- 将 4.5 µL 细胞裂解主混合液加入 0.2 mL PCR 管盖内，通过激光显微切割采集单个细胞。
- 从激光显微切割显微镜中取出 PCR 管并盖紧管盖。短暂离心以收集管底液体，并将样本置于冰上。
- 继续进行单细胞全基因组扩增，或在进一步处理前将分离的样本于 -80 °C 保存最多 1 个月。
- 根据 Czyż et al.19 的方法配制细胞裂解主混合液：将 5.0 µL 反应缓冲液、1.3 µL 辛基苯基聚乙二醇醚（10% 溶液）、1.3 µL 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇（10% 溶液）、2.6 µL 蛋白酶 K 溶液以及 34.8 µL 无 RNase/DNase 水混合，得到用于 10 个样本的主混合液（总体积 45 µL）。将主混合液置于冰上。
6. 基于接头-连接子的全基因组扩增 18,19
注意：确保所有必要的预混液（WGA 试剂盒的组分，参见材料与试剂表）均已配制并置于冰上备用。预混液包括用于显微操作（见 5.1 节）样本的 DNA 消化预混液 1（含 2.0 µL 反应缓冲液、2.0 µL MseI 限制性内切酶和 16.0 µL 无 RNase/DNase 水），或用于激光显微切割（见 5.2 节）样本的 DNA 消化预混液 2（含 2.5 µL MseI 限制性内切酶和 2.5 µL 无 RNase/DNase 水），预退火主混合液（含 5.0 µL 反应缓冲液、每种预退火 PCR 接头各 5.0 µL，以及 15.0 µL 无 RNase/DNase 水），连接主混合液（含 30.0 µL 预退火的 PCR 接头、10.0 µL 三磷酸腺苷溶液和 10.0 µL T4 连接酶溶液），以及初级 PCR 主混合液（含 30.0 µL PCR 缓冲液、20.0 µL 10 mM 脱氧核苷酸混合溶液、10.0 µL 聚合酶混合液和 340.0 µL 无 RNase/DNase 水）。以上体积均为制备 10 个样本的用量，应根据实际样本数量相应调整。
- 进行细胞裂解时，将显微操作/激光显微切割样品置于热循环仪中，通过在42 °C孵育45分钟、65 °C孵育30分钟和80 °C孵育10分钟来完成单细胞裂解。
注意：使用带加热盖的热循环仪。细胞裂解也可在10至15小时的过夜（O/N）条件下进行；若采用此方式，则省略65 °C的孵育步骤。 - 进行PCR接头的预退火。将预退火主混合液在热循环仪中于65 °C孵育1分钟，随后进行49个循环（每个循环1分钟），每个循环温度递减1 °C/循环。经过50个循环（至15 °C）后，将主混合液在15 °C保存直至后续使用。
注意：此步骤对于生成适用于与经MseI限制性酶切的单细胞DNA连接的不对称接头至关重要（参见步骤6.6）。 - 细胞裂解后，以2000 x g离心3秒，使所有液体沉降至管底，并将样品置于冰上。
- 为片段化DNA，向每个裂解后的显微操作样品中加入2 µL DNA消化混合液1，或向激光显微切割样品中加入0.5 µL DNA消化混合液2，并进行限制性酶切反应。使用带加热盖的热循环仪，在37 °C反应5分钟，随后在65 °C进行5分钟的限制性内切酶失活步骤。
注意：37 °C的酶切反应可延长至3小时。这是显微操作样品与激光显微切割样品在本实验流程中唯一不同的步骤。 - 离心样品以收集管底液体，并将样品置于冰上。
- 为连接经限制性酶切的DNA与预退火的接头，向每个酶切后的DNA样品中加入5.0 µL连接主混合液，并在热循环仪中于15 °C连接1小时。
注意：此步骤可延长至12小时或过夜（O/N）进行。 - 离心样品以收集管底液体，并将样品置于冰上。
- 进行全基因组扩增（WGA）时，向每个连接产物中加入40.0 µL初级PCR主混合液，并在带加热盖的热循环仪中按以下程序运行WGA：首先，68 °C孵育3分钟；其次，进行15个循环，每个循环包括94 °C变性40秒、57 °C退火30秒、68 °C延伸1分30秒，且每循环延伸时间增加1秒；然后，再进行9个循环，其中94 °C变性40秒、退火温度逐循环升高1 °C（即57 °C + 1 °C/循环）30秒、68 °C延伸1分45秒并每循环增加1秒；接着，进行23个循环，每个循环为94 °C变性40秒、65 °C退火30秒、68 °C延伸1分53秒并每循环增加1秒；最后，在68 °C进行终延伸3分40秒，随后将样品冷却至4 °C。
- 离心样品以收集管底液体，检测DNA质量，或于-20 °C或-80 °C长期保存样品。
7. WGA 产物的质量控制
注意：通过运行4重QC-PCR5后观察DNA弥散条带的范围以及扩增产物的数量，来评估全基因组扩增（WGA）产物的质量。将WGA分装样品及其相应的QC-PCR样品在1.0%琼脂糖凝胶上电泳以进行分析。
- 准备 用于4重质量控制PCR的所有引物的100 µM储存液（表1。将每种引物各8 µL加入136.0 µL的PCR级水中，配制总量为200 µL的引物混合液。涡旋振荡溶液3秒，然后以2000 x g 3秒后分装 20 µL，于 -20 °C 保存。
- 使用标准PCR试剂盒配制多重PCR主混合液，其中包含6.0 µL的2x PCR组分（不含引物）、4.5 µL的PCR级水和0.5 µL的引物混合物。
- 加入1.0 µL的WGA产物，离心沉淀后，进行PCR扩增：94 °C预变性2 min，随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性1 min、56 °C引物退火1 min、72 °C引物延伸1 min 30 s，最后72 °C终延伸7 min。反应结束后将样品置于4 °C冷却，离心沉淀，当日进行凝胶电泳分析时置于冰上，或保存于-20 °C以备后续分析。
注意：为延长帕尔贴元件的使用寿命，可在热循环仪中以 12 °C 进行冷却。 - 在琼脂糖凝胶上分析全基因组扩增产物（来自步骤6.8）及相应的4重QC-PCR产物5.
结果
经CFSE和核酸染色后的细胞可使用配备DAPI和FITC滤光片的免疫荧光显微镜进行观察。细胞核在DAPI通道中呈现明亮的复染，而细胞质则显示CFSE的均匀标记，细胞间的荧光强度存在异质性。图 2A 和 2E). 预期附着在导线上的细胞具有相似的形态和染色强度图2B 和 2F）以及从金属丝上脱离并回收到载玻片上（图2D 和 2H).
高细胞密度（例如 >1 000 000 个细胞/mL）可能导致在加载细胞时细胞完全覆盖金属丝表面。然而，较低的细胞密度、孵育过程中转速的变化以及不同细胞系的使用均会影响分离效率，需分别进行测试。当按照第2.1节所述，将金属丝与5 mL浓度为100 000 个细胞/mL的HT-29细胞孵育时，每根金属丝平均捕获254 ± 103个细胞（n = 5）。在使用LNCaP细胞进行的相同实验中，每根金属丝平均捕获440 ± 319个细胞（n = 5）。
按照第2.2节方案，将500、5 000和50 000个HT-29细胞置于5 mL外周血背景中与导线接触，分别捕获到75 ± 18个细胞、25 ± 9个细胞和47 ± 57个细胞（n = 3，每组）。若按照第2.3节方案，将15 µL细胞悬液（1 000 000个细胞/mL）加样至导线，则最多可有约1 000个（HT-29）细胞黏附于导线表面。
HT-29 细胞的细胞解离效率为 81%（范围 54.9%–93.2%，n = 5），LNCaP 和 VCaP 细胞分别为 81%（范围 63.51%–92.87%，n = 6）和 91%（范围 84.7%–95.3%，n = 6）。类似地，不同细胞系解离后细胞的回收率也存在差异：通过细胞离心法回收的 HT-29 细胞平均回收率为 28%；LNCaP 细胞的回收率低于 10%，而 VCaP 细胞的平均回收率为 55%。
约75%的单细胞在进行全基因组扩增（WGA）后可产生高质量的WGA产物：表现为1）WGA产物在0.1至>1 kb范围内呈弥散条带（图4，上图），以及2）在4重质量控制PCR中出现三个或四个条带（图4，下图）。WGA产物可用于：1）满足单细胞阵列比较基因组杂交（array-CGH）分析质量标准的array-CGH检测6,7，以及2）经再扩增后的靶向下一代测序（NGS）7。
图1：用于分离和回收目标细胞以进行单细胞分析的工作流程。 (A) 将细胞培养至90%融合度，并 (B) 收集以获得单细胞悬液。用CFSE和核酸染料染色后，(C) 将功能化导线与细胞共同孵育，孵育可在反应管中使用5 mL体积进行，也可在巴斯德吸管尖端中使用低体积进行。后者允许应用低至15 µL的细胞悬液体积。(D) 细胞需在充电后4小时内解离。因此，将导线放入装有释放缓冲液的1.5 mL反应管中。在摇床上孵育15分钟后，再离心10分钟，随后取出导线，并将细胞悬液再次离心以沉淀细胞。(E) 回收的细胞可转移至载玻片进行单细胞显微操作（上图），或通过细胞离心法沉降到覆膜载玻片上，随后进行激光显微切割（下图）。(F) 最后，通过全基因组扩增（WGA）对收获的单细胞进行扩增。WGA产物适用于后续的aCGH和靶向NGS分析。EpCAM表位：细胞表面绿色圆圈。功能化导线：装置，灰色三螺旋导线。聚合物：紫色线条。抗EpCAM抗体：橙色。释放缓冲液活性：红色箭头。用于固定细胞悬液位置的记号油脂：深蓝色椭圆。回收的细胞悬液：浅蓝色。显微操作用毛细管：黑色线条。放大图：通过显微操作收获的回收细胞，以及细胞离心后沉积在覆膜载玻片上的回收细胞（灰色实心椭圆）。放大图：正在接受激光显微切割的回收细胞（灰色圆形线：来自覆膜载玻片的膜，作为激光显微切割的支撑结构），物镜及激光束（蓝色线条从下方接近覆膜载玻片）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：标记细胞的可视化。 (A,E) 加电前的细胞：细胞用 CFSE 标记，并用 DNA 插入染料复染，显示不同强度的 CFSE（绿色）信号。(B,F) 被导线捕获的标记细胞。(C,G) 细胞脱离程序后的导线。(D,H) 从导线脱离的细胞，通过细胞离心收集到载玻片上。CFSE：FITC 通道（绿色）。DNA 染色：DAPI 通道（蓝色）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：金属丝及储存腔室。 (A) 金属丝的腔室结构。(B) 功能化部分的细节。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：单个显微操作细胞获得的全基因组扩增产物的质量控制。 上图：来自单个细胞的全基因组扩增产物通常表现为大小在0.2 kb至>1.0 kb之间的DNA弥散条带，峰值强度约在0.5 kb处。编号为1、7和13的样品（以星号标示）显示出次优或无DNA弥散条带。下图：若四重PCR能够扩增出四个PCR产物（分别位于100、200、300和400 bp）中的三个或四个，则表明全基因组扩增产物质量足够。样品1、7、10和13显示的条带少于三条，应排除在后续分析之外。M泳道为100 bp DNA标记物，星号标示全基因组扩增产物质量不足的样品。请点击此处查看该图的放大版本。
| 引物序列 | 注意 |
| 5′-gtt cca ata tga ttc cac cc-3′ | 100 bp 正向引物 |
| 5′-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3′ | 100 bp 反向引物 |
| 5′-agg tgg agc gag gct agc-3′ | 200 bp 正向引物 |
| 5′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′ | 200 bp 反向引物 |
| 5′-agg tga gac att ctt gct gg-3′ | 300 bp 正向引物 |
| 5′-tcc act aac cag tca gcg tc-3′ | 300 bp 反向引物 |
| 5′-aca gtc cat gcc atc act gc-3′ | 400 bp 正向引物 |
| 5′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3′ | 400 bp 反向引物 |
表1：四重质量控制PCR的引物序列
讨论
本方案旨在从功能化导线（以下简称“装置”）上回收细胞，用于体外单细胞基因组分析。我们测试了三种EpCAM阳性细胞系（HT-29、LNCaP和VCaP），但原则上，该方法可适用于任何表达EpCAM的细胞系。EpCAM阳性的目标细胞可以纯细胞悬液形式（见2.1节）或混入过量背景细胞中（例如外周血，见2.2节）加入装置。后者尤其可用于在稀有细胞条件下测试分离能力，而通过所述低体积方法可精确调控附着在导线上的细胞数量（见2.3节）。由于不同细胞系之间可能存在差异，导线加样时的合适细胞密度、旋转速度以及孵育时间需通过免疫荧光显微镜评估附着细胞数量后进行经验性优化。
在单细胞水平上进行基因组下游应用时，需要进行全基因组扩增（WGA）。不同实验室所选用的WGA方法可能有所不同，原则上，本方法适用于所有能够处理通过显微操作或激光显微切割获得样本的WGA技术。在本实验方案中，我们采用基于酶切片段化DNA的WGA方法，因其性能优于基于热片段化的WGA方法7。此外，可选地，单个细胞也可用于等温WGA，以实现后续的DNA谱型分析20,21。
所述方案旨在从用于基因组单细胞分析的新一代功能化导线上回收完整细胞。第一代功能化导线同样也是目前唯一获得CE认证的 体内 目前市场上已有的富集装置已被用于计数转移性癌症患者中的循环肿瘤细胞（CTCs）。既往发表的研究及我们自身的数据表明 体内 相较于当前的金标准技术，该分离技术具有更高的灵敏度2因此，配备这一 体内 具有回收功能的分离技术，通过该设备实现，可将高CTC回收率与单细胞水平的表征相结合。
然而，该设备尚未获得用于患者的批准，因此尚无临床数据。 离体 应用（即 不建议在采样后从外周血中分离循环肿瘤细胞（CTCs），因为该技术是针对肘静脉环境条件优化的。 例如 低直径的导丝（增加循环肿瘤细胞与捕获抗体直接接触的概率）以及长滞留时间（30分钟，允许2-3升血液流经导丝）。然而，如2.2节所述，目标细胞也可从混合样本中分离。7.
该方法目前的一个局限性是在细胞从导线上脱离后，未固定细胞的回收效率较低。然而，这一问题可能通过在脱离处理前增加细胞固定步骤来改善。
总之，本方案是迈向联合使用一种 体内 用于单细胞基因表征的可回收细胞的分离技术。未来还需进一步优化细胞回收与清除效率，以推动其在患者中的应用1,2然而，个性化医疗在治疗监测和治疗决策中的应用已超越了循环肿瘤细胞（CTCs）计数的范畴。因此，该方法是实现单细胞水平CTC基因组学表征的第一步。
完整细胞的获取使得单细胞转录组分析的应用成为可能。然而，回收过程是否会影响RNA完整性仍有待评估。例如 将回收的单细胞直接进行裂解，随后进行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）22）。如果成功，可对单个细胞进行表征（例如 循环肿瘤细胞（CTCs）的研究可延伸至转录组水平，从而实现更深入的分析。在此方面，采用Smart-seq2进行RNA测序为单细胞RNA的下游分析提供了有力工具，因为在RNA测序文库构建过程中获得的预扩增cDNA可进一步用于定量PCR检测。这将实现对单个分离细胞的靶向分析与筛选分析相结合的综合研究。22,23.
目前功能化的导线基于抗EpCAM抗体，EpCAM是一种广泛用于CTC阳性筛选的上皮标志物24。由于部分CTC可能下调上皮标志物（如细胞角蛋白或EpCAM）的表达25，增加HER2/neu等抗体可提高CTC分离的成功率。Ferreira et al. 于2016年已开发并综述了多种基于抗体的富集策略26。将多种抗体混合固定于导线表面，可能是该技术未来的改进方向，有助于分离出更多数量及更多亚型的CTC。
所有涉及导线操作的步骤均必须保持导线功能部分浸没在溶液中，以维持其功能活性。我们建议在评估过程中（显微镜观察时）将导线置于1×PBS中。 例如步骤3.1–3.3）及储存。为避免染色不当，我们建议在步骤1.2.1和1.2.2中使用 freshly prepared staining solution。染色较弱的细胞会影响导线上细胞计数，并可能导致对贴壁细胞数量的低估。
将导线插入巴斯德吸管以加载细胞悬液时（步骤2.3.4），必须避免用橡胶帽将巴斯德吸管堵住。橡胶帽用于固定导线，使功能部分位于巴斯德吸管的尖端内部。如果橡胶帽过于紧密地连接在巴斯德吸管后端，则无法加载细胞悬液。此时，应适当松动橡胶帽，使被加载细胞悬液排出的空气能够从吸管中逸出。
在步骤 3.2 和 3.3 的细胞计数过程中，弯曲金属丝对其定位至关重要。使用胶带固定金属丝时，应使非功能端位于一侧。在扫描完功能部分的整个长度后，将金属丝旋转 180°，以便扫描功能金属丝的另一半。此步骤对于初始实验评估金属丝上的细胞数量非常重要。一旦确定了特定细胞系和操作流程下的细胞数量，后续操作可重复进行而无需再次计数细胞（例如，仅检查细胞是否存在，或省略此步骤）。在步骤 4.8 减少上清液体积时，精细的移液操作至关重要，以避免细胞损失。确保移液过程平稳，避免对沉淀物造成湍流。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由奥地利科学基金（FWF）资助，项目编号 I 1220-B19（授予 P.S.），属于转化癌症研究 ERANET 项目（TRANSCAN）的一部分"循环肿瘤细胞作为前列腺癌微小残留病的生物标志物（CTC-SCAN）"。博士生 S.C. 在格拉茨医科大学分子医学博士培养项目框架内接受培训。作者衷心感谢 Nina Schlögl、Daniel Kummer、Gabi Wendt、Claudia Chudak、Julia Schulz 和 Johanna Schiller 提供的专业技术协助。作者感谢 Georg Peinhaupt 在图形设计方面的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Gilupi 释放缓冲液 | Gilupi | GIL083 | 用于将细胞从金属丝上分离 |
| McCoy's 5A 培养基（1×），添加 L-谷氨酰胺 | 赛默飞世尔科技 | 16600-082 | 用于HT-29细胞的培养基，根据实验所用细胞系调整培养基 |
| HEPES缓冲液（1 M） | PAA | S11-001 | 5A 培养基补充剂 |
| 优级胎牛血清 | 聚丙烯酸 | A15-151 | McCoy's 5a 改良培养基添加剂 |
| 青霉素-链霉素（100倍浓缩液） | Biowest | L0018-100 | McCoy's 5a 改良培养基添加剂 |
| 磷酸盐缓冲液（1x PBS） | 赛默飞世尔科技 | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | 细胞解离液（细胞培养） |
| 水浴锅 | GFL | 1003型 | 用于预热溶液 |
| 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 用于细胞孵育（细胞培养） | |
| 50 mL 离心管 | VWR | 525-0403 | |
| 滚轴混合器 | Stuart Scientific | SRT6D | 用于将细胞固定在金属丝上，同时防止细胞沉降 |
| CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | C34554 | 用于标记活细胞（细胞质标记） |
| Hoechst 33342 | H3570 | 赛默飞世尔科技 | 用于染色DNA（核酸复染） |
| 离心机（配备可容纳15 mL和50 mL反应管的转子） | 赛默飞世尔科技 | Heraeus Megafuge 40R | 用于细胞沉淀 |
| 观察者 Z1（荧光/激光显微切割显微镜） | 卡尔·蔡司显微成像 | 能够进行激光显微切割的倒置（免疫荧光）显微镜；荧光显微镜必须能够检测Hoechst 33342（DAPI滤光片）和CFSE（FITC滤光片） | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A4503-50G | 用于包被玻璃/塑料表面 |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | 用于涡旋振荡 |
| Vacutainer EDTA（或 Na-肝素）管 | BD | 366450（或 366480） | 用作体外捕获靶细胞的反应管 |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | 能够分离和释放EpCAM阳性细胞的功能化导线（也称为捕获）&和释放，C&R) |
| 注射器针头（G20） | VWR | 613-0554 | 用于刺穿橡胶帽，以便使C的非功能部分&R 引领前行 |
| 血细胞计数板 | Roth | T729.1 | 用于细胞计数 |
| 巴斯德吸管 150 毫米 | Volac | D810 | 用于将细胞低体积接种至 C&和 |
| 润滑笔 | Dako | S2002 | 用于载玻片上以固定细胞悬液 |
| 无菌注射器滤器（0.2 µm) | 康宁 | 431219 | 用于过滤新配制的Gilupi释放缓冲液 |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | 用于细胞脱离过程中的振荡 |
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA试剂盒 | Silicon Biosystems | 通过 Silicon Biosystems 进行订购 | |
| 配备 Mikromanipulator MMJ 和 CellTram vario 的 Axiovert M200 显微镜 | 蔡司/艾本德 | 使用手动显微操作 | |
| 微毛细管（25 µ直径为 m，CustomTip I 型 | Eppendorf | 930001201 | 用于细胞的显微操作 |
| 0.2 mL PCR管 | Biozym | 710920 | |
| 细胞离心机及设备 | Hettich | 通用型 32 | 使用手控细胞离心机 |
| Thermo cycler | 伯乐（Bio-Rad） | DNA Engine Dyad | 任何带有加热盖的热循环仪均可使用 |
| 微型离心机 | Roth | CX73.1 | 使用手边的台式离心机 |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | 用于激光显微切割的膜包被玻片 |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | 使用手持式DNA交联仪 |
| 标准PCR试剂 | |||
| 6x DNA上样缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | R0611 | 使用现有的上样缓冲液 |
| DNA标准品 | BioLabs | N0551G | 使用手边的100 bp DNA分子量标准 |
| 琼脂糖 | Biozym | 840004 | |
| 凝胶电泳工作站 | Bio-Rad | 使用现有的电泳系统 | |
| Gel Red 核酸染料 | Biotium | 41003 | 用于琼脂糖凝胶中DNA可视化的嵌入染料 |
参考文献
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