自体微骨折并纯化脂肪组织用于踝关节镜下距骨骨软骨损伤的治疗

摘要

本研究旨在报道一种利用微骨折技术结合纯化脂肪来源干细胞进行距骨软骨损伤关节镜治疗的操作方案。

摘要

近年来，再生技术被越来越多地研究并用于治疗距骨骨软骨损伤。特别是，多项研究重点关注了来源于脂肪组织的间充质干细胞。脂肪来源的干细胞（ADSCs）具有与其他间充质细胞相似的形态特征和生物学特性，并能够分化为多种细胞谱系。此外，这些细胞在皮下组织中广泛存在，占正常体重的10 - 30%，每克组织中约含有5,000个细胞。

在本技术中，第一步是从腹部获取脂肪来源的间充质干细胞，并进行微骨折和纯化处理；接下来，整个手术完全通过关节镜完成，与传统的开放手术相比，软组织剥离更少，关节可视化更佳，恢复更快。关节镜手术的特点分为两个阶段：第一阶段是识别、隔离病灶，并进行微孔处理；第二阶段在干燥条件下进行，将脂肪组织注射至病灶部位。

2016年1月至2016年9月期间，四名患者接受了关节镜下微骨折联合纯化脂肪组织移植治疗距骨骨软骨损伤。所有患者在术后六个月均报告临床症状改善，且无并发症发生。末次随访时的功能评分结果令人鼓舞，证实该技术可为距骨骨软骨损伤患者提供可靠的疼痛缓解和功能改善。

引言

关节镜手术是治疗距骨骨软骨损伤（OLTs）的金标准，旨在缓解疼痛、恢复功能并改善生活质量，尤其适用于年轻且活动量大的患者。

目前，关节镜技术可分为三种类型。修复性技术通过清创及在病灶部位进行微骨折，刺激骨髓来源的细胞再生。重建性技术则采用自体或异体骨软骨移植物替代病灶。再生性技术利用多能细胞的分化与复制能力，重建受损组织^1,2,3,4,5,6。

近年来，再生技术已成为众多研究的课题 体外 和 体内 用于治疗口腔鳞状细胞癌的研究，特别是来源于脂肪组织的间充质干细胞（ADSCs）^7,8,9这些间充质干细胞表现出与其他组织来源的多能细胞相似的形态学和功能特征；它们也具有向多种不同细胞系分化的潜能 体外 和 体内^10,11,12,13. 对这些细胞的研究重点主要集中在其分布位置上，事实上，它们占正常体重的10%至30%，每克组织中约含有5,000个细胞。^13,14另一方面，限制这些细胞应用的一个因素与实验室操作过程中的处理有关。含有脂肪细胞团块、胶原纤维和正常血管成分的脂肪抽吸物需经I型胶原酶进行酶消化处理，并在培养前进行溶血处理。本文旨在描述采用微骨折技术联合纯化脂肪组织治疗距骨骨软骨病变的实验方案。

方案

所有涉及人类参与者的研究所进行的程序均符合机构和/或国家研究委员会的伦理标准，以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或同等伦理标准。

1. 病史

1. 以详细的患者病史开始临床检查。
   注意：当踝关节出现反复扭伤并伴有肿胀、僵硬、疼痛和关节交锁等不稳定情况时，必须始终怀疑距骨骨软骨损伤（OLT）。此外，在许多情况下，OLT 可能与系统性疾病史相关，例如炎症性疾病、血管疾病、神经病变或神经系统疾病以及糖尿病。必须评估并考虑可能影响愈合的药物使用或医疗状况。

2. 临床检查

1. 在直立位评估患者，以凸显踝关节或后足畸形。评估肌肉和肌腱功能以及踝关节活动范围（ROM）。常存在弥散性压痛，尤其是在最大屈曲和伸展时，关节面水平出现触痛区域的情况并不少见。
2. 进行前抽屉试验和后抽屉试验，以识别是否存在合并的外侧踝关节不稳。
3. 在术前咨询期间，记录以下临床和功能评分：美国骨科足踝协会 &美国足踝外科医师协会（AOFAS）踝关节与后足评分¹⁵视觉模拟评分法（VAS）疼痛评分¹⁶12项健康调查简表（SF-12）¹⁷.

3. 放射学评估

1. 进行足部和踝关节的双侧负重位X线摄影。该检查包括常规的负重前后位（AP）踝穴位和踝关节侧位负重位影像。前后位踝穴位应在中立位拍摄，同时以15度内旋位拍摄，以便更好地显示距骨。
   注意：仅50%的骨软骨损伤（OLT）可通过X线片诊断；对于较大的病灶，可观察到由透亮区环绕的游离骨区域¹⁸。
2. 进行踝关节常规计算机断层扫描（CT扫描）。CT扫描可精确定位病灶位置并测量其大小，同时在发生骨块分离时识别出骨碎片。CT的局限性在于其对软骨状态的显示能力。既往研究表明，CT检测骨软骨损伤的敏感性和特异性分别为0.81和0.99^19,20。
3. 进行踝关节磁共振成像（MRI）。MRI在评估软骨及软骨下骨方面具有关键作用。此外，MRI不涉及电离辐射，并能更清晰地显示软组织。文献报道，MRI检测骨软骨损伤的敏感性和特异性均高达96%^21,22。

4. 手术技术

1. 脂肪组织的采集与处理
   1. 配制Klein溶液：将1 L浓度为9 g/L的生理盐水、50 mL浓度为1%的利多卡因、1 mL浓度为1:1000的肾上腺素、10 mL浓度为8.4%的碳酸氢钠，以及0.1 mL浓度为10 mg/mL的曲安奈德加入溶液中。
   2. 使用手术刀片在脐周创建两个约0.5 cm的切口。使用带有18G针头的60 mL注射器，通过切口向腹部皮下脂肪组织内注射约300 mL Klein溶液（图1）。
   3. 使用连接20 mL注射器的13G钝头套管，从处理套件中采集40–45 mL的脂肪来源干细胞（ADSCs）（图2）。通常在脐周区域进行采集。
   4. 将100–130 mL脂肪抽吸物注入封闭系统中。通过一个大孔滤器将脂肪抽吸物推入装置，以实现初步的脂肪团块减小；同时，相应量的生理盐水将流向废液袋。不锈钢钢珠在此过程中起关键作用，可形成油、血液与生理盐水之间的暂时性乳化。通过生理盐水的重力逆流冲洗，去除油性残留物和受污染的血液。
   5. 完成此洗涤步骤后（流出液体变清亮，脂肪抽吸物呈黄色），停止生理盐水流动，并将装置倒置（灰色帽朝上），进行第二次脂肪团块减小。使用10 mL注射器从底部向上推动液体，使漂浮的脂肪团块通过第二个六角切割滤器，从而实现减小。将最终产物收集至连接在装置上端开口的10 mL注射器中。
      注：脂肪组织处理套件可改进标准的脂肪填充技术：该系统为封闭式、全浸没、低压圆柱形系统，旨在获得一种流动性好且均匀的产物，其中含有大量周细胞。该过程仅通过温和的机械力处理脂肪细胞，同时保持基质血管微环境的完整性。该处理过程创伤最小，可在短时间内（15–20分钟）完成终产物制备，无需酶解处理或细胞扩增。完整的血管基质微环境有助于组织修复过程。
   6. 采集ADSCs后，在腹部加压包扎。
2. 手术操作与脂肪组织注射
   1. 将患者置于仰卧位，实施脊髓麻醉，并在大腿水平使用压力为250 mmHg的止血带，以减少出血并改善关节镜视野¹。
   2. 使用皮肤标记笔在皮肤上标记解剖标志。这些标志对于避免医源性损伤至关重要。
      需标记以下结构（图3）：
      内外踝（外踝（LM）和内踝（MM））
      前关节线（JL），通过踝关节背屈和跖屈确定
      胫骨前肌腱（TAT）和跟腱
      大隐静脉，其走行于内踝前方
      腓浅神经（SPN）
   3. 首先，在胫骨前肌腱内侧、对应软点处建立前内侧入路。该入路作为观察入路。大多数情况下，踝关节背屈时可触及并看到一个凹陷。
      1. 仅用刀片切开皮肤，随后通过钝性分离穿破关节囊。注意避免损伤隐神经和大隐静脉。大隐静脉位于入路外侧约9 mm处，而神经位于入路外侧约7.4 mm处。此为两个主要观察入路之一。
   4. 确认关节线位置后，在外踝内侧、趾长伸肌腱外侧建立前外侧入路。
      注：建立前外侧入路时，应避免损伤中间背侧皮神经（腓浅神经的外侧分支）；因此，在切开皮肤后，应继续采用钝性分离。
   5. 检查关节软骨，评估其大小和位置。使用探针评估软骨的状态和质量。距骨的骨软骨损伤通常位于后内侧或前外侧。
      1. 使用2.7 mm广角、30°视角的关节镜进行关节镜治疗，部分外科医生可能使用更大的4 mm关节镜，并将器械置于关节前隐窝。可采用无创性关节牵开技术和过度跖屈来充分暴露距骨穹隆的大部分区域。
      2. 若为后侧损伤，可经皮置入Hintermann牵开器以牵开关节，暴露病灶。Hintermann牵开器通过杠杆臂作用于先前置入胫骨和距骨内侧或外侧的两根克氏针，具体位置根据病灶侧别而定。若为外侧病灶，应注意将近端克氏针插入胫骨而非腓骨，以实现更佳的关节牵开效果。
   6. 使用刮匙处理病灶，清除受损和不稳定的软骨、钙化层以及坏死和硬化骨组织，形成边缘规整、有肩状结构的局限性病灶。此步骤可使用标准关节镜刮匙（图4）。
   7. 从病灶外周向中心方向，在软骨下骨进行微穿孔，以激活骨髓间充质干细胞。
      1. 穿孔间距约为3 mm。使用Chondral Pick在缺损下方健康的软骨下骨上制造微骨折（图5）。
         注：出血将形成纤维蛋白凝块。凝血产物通过激活炎症级联反应，释放血管活性介质、生长因子和细胞因子。这些因子可促进血管侵入及间充质干细胞向软骨缺损区域迁移。这些多能细胞被诱导分化为成纤维细胞、软骨细胞和成骨细胞，在病灶修复过程中发挥重要作用。关节微环境中的旁分泌生长因子促进细胞外基质形成和纤维软骨生成。同时，病灶骨性部分的细胞生成未成熟骨组织，并逐渐被成熟骨组织替代。
   8. 使用刨削器在负压吸引下清除关节腔内液体，并用棉片吸除残余液体，直至关节完全干燥。
3. 脂肪来源干细胞注射
   1. 使用两个入路之一（前内侧或前外侧），将步骤4.1.3中预先制备的5–7 mL脂肪来源干细胞注入踝关节。
   2. 松开止血带。

5. 术后护理

1. 术后15天内避免踝关节活动，手术肢体完全免负重。
2. 术后15天开始，允许进行踝关节的主动和被动活动，直至完全恢复并达到正常活动范围。
3. 术后30天允许负重。

6. 临床与影像学随访

1. 在术后6个月和12个月进行临床及影像学评估，之后每年随访一次。随访方案包括每次终点时的AOFAS踝-后足评分、VAS疼痛评分和SF-12评分^15,16,17。影像学检查包括对术侧踝关节进行MRI和CT扫描。

结果

2016年1月至2016年9月期间，四名患者接受了关节镜下微骨折联合纯化脂肪组织移植治疗距骨骨软骨损伤。所有患者在术后六个月均报告临床症状改善。初步临床结果见表1。未报告任何并发症。

近年来，使用脂肪来源基质细胞（ADSCs）治疗足踝部病变的应用逐渐增多。2013年，Kim et al.²³ 对65名年龄超过50岁的症状性骨软骨病变（OLT）老年患者进行了治疗，并根据治疗方式分为以下两类：
–     单独使用骨髓刺激
–     骨髓刺激联合ADSCs治疗

在最终随访时，接受联合治疗的患者相比单纯骨髓刺激治疗的患者表现出显著的临床改善。同一研究团队随后开展的一项针对骨软骨病变（OLT）治疗的研究

讨论

近年来，临床和临床前试验已将关注重点放在使用脂肪间充质干细胞治疗不同肌肉骨骼系统疾病的效果上。本文旨在描述一种利用微骨折并纯化的脂肪组织联合关节镜下微穿孔技术治疗距骨软骨损伤的治疗方案。该方案包含多个关键步骤，存在较高的并发症风险。在脂肪采集过程中，并发症可分为局部并发症或全身性并发症。

最常见的术后并发症是轮廓不规则，发生率为2.7%。使用小口径套管、避免进行浅层吸脂以及在退出切口时关闭负压吸引，可预防该问题。在患有潜在结缔组织病的患者中，偶尔可见皮肤相关并发症，如色素沉着、坏死和红斑^27,28。血清肿通常是由于过度吸脂导致治疗区域积聚浆液性液体，进而形成单一空腔所致；在BMI较高的患者中更为常见²⁹。感染是一种极为罕见的并发症（<1%），这可能归因于无菌操作技术、小切口以及利多卡因的抗菌作用共同作用的结果³⁰。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
处理套装 - 脂肪组织处理套装	LIPOGEMS	LG PK 60	用于获取微切碎且纯化的脂肪源性干细胞（ADSCs）的Lipogems套装
欣特曼牵开器	INTEGRA	119654	该牵开器可进入距骨穹窿的大部分区域，尤其适用于后方病灶的情况
杯状刮匙	ARTHREX	AR-8655-02	用于清除受损软骨以及坏死和硬化骨组织
软骨钩针 30° 尖端 / 60° 尖端	ARTHREX	AR-8655-05 AR-8655-06	用于在病灶部位进行微穿孔，刺激软骨下骨出血
关节刨削器	ARTHREX	AR-7300SR	用于清理关节腔并吸除液体