方法文章

在失活X染色体上筛选重新激活MeCP2的shRNA文库

6.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56398

⸱

2018年3月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

本文内容

摘要

我们报告了一种基于小发夹RNA（shRNA）和下一代测序的技术方案，用于鉴定在小鼠细胞系中调控X染色体失活的因子，该细胞系的失活X染色体上融合了萤光素酶基因和潮霉素抗性基因，并将其连接至甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）基因。

摘要

利用插入异染色质的报告基因进行正向遗传筛选，已被广泛用于研究模式生物中的表观遗传调控机制。短发夹RNA（shRNA）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）等技术的发展，使得此类筛选可在二倍体哺乳动物细胞中开展。本文描述了一项针对X染色体失活（XCI）调控因子的大规模shRNA筛选，采用一种小鼠细胞系，该细胞系在失活X染色体（Xi）上的甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）基因C末端定点敲入了萤光素酶（firefly luciferase）和潮霉素抗性基因。在报告细胞系中，该构建体的重新激活可赋予细胞在潮霉素B筛选条件下的生存优势，从而使得我们能够通过下一代测序检测筛选后富集的shRNA，对大规模shRNA文库进行筛选并鉴定出可激活报告基因的发夹序列。随后，我们通过逐一验证这些富集发夹序列激活Xi上萤光素酶报告基因的能力，进行个体化验证。

引言

女性中最常见的遗传性智力障碍之一——Rett综合征，是由X染色体上的MeCP2基因发生杂合突变所致，该基因编码一种对神经元正常功能至关重要的蛋白质1。治疗该疾病的一个潜在策略是重新激活位于失活X染色体（Xi）上的野生型MeCP2等位基因，因为已有研究证明，在该疾病的小鼠模型中恢复MeCP2的表达可逆转神经功能缺陷1,2,4。然而，雌性细胞中两条X染色体之一的表观遗传沉默在整个生物体生命周期中维持得非常稳定3,4，因此要实现Xi上基因的有效再激活，可能需要对多个表观遗传调控通路造成显著干扰。

为了鉴定维持MeCP2沉默所必需的因子，我们首先建立了一种转基因小鼠模型，该模型在两条X染色体之一上携带MeCP2-荧光素酶-潮霉素抗性基因融合结构（MeCP2-LUC-HR）（XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2）5。尽管由该融合构建体表达的MeCP2不稳定，并导致功能丧失，表型上模拟了半合子雄性小鼠中MeCP2的缺失（XMeCP2-LUC-HR/Y），但报告基因的表达仍可被清晰检测到，其表达模式与内源性MeCP2的表达一致5。随后，我们建立了携带该构建体的永生化成纤维细胞克隆，其中构建体分别位于失活或活性的X染色体上，并证实前者表达野生型MeCP2而不表达报告基因构建体，而后者情况相反。当使用已知可消除基因沉默的DNA去甲基化试剂5-氮杂胞苷（5-AZA）处理时，报告基因位于Xi上的细胞（"报告细胞"）在生物发光检测中显示出活性增加，表明我们的构建体可以被重新激活，因而可用于遗传筛选。

接下来，我们开发了一种高通量遗传筛选方法，用于鉴定调控MeCP2沉默的因子。首先，将报告细胞系感染一种逆转录病毒文库，该文库包含>60,000种不同的shRNA，靶向小鼠基因组中>25,000个基因5,6，随后进行潮霉素B筛选。通过下一代测序技术比较筛选前和筛选后样本中发夹结构的频率，因为在潮霉素B筛选条件下，报告基因的重新激活会赋予细胞生长优势，从而导致相关发夹结构的富集。利用该方法，我们鉴定了30个参与MeCP2沉默的基因，并通过将报告细胞分别转导单个发夹结构并检测其荧光素酶 活性，进一步验证了这些结果。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有涉及动物的实验步骤均按照弗雷德·哈钦森癌症研究中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。除5-氮杂胞苷（5-AZA）外，本研究所用试剂均无已知的显著人类健康风险。

1. 在 Xi 上构建带有 MeCP2-LUC-HR 报告基因的细胞系

  1. 从雌性 XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2 小鼠中制备肌腱成纤维细胞
    1. 处死一只10-12日龄的雌性 XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2 小鼠。
    2. 使用直头解剖剪，在尾部近端皮肤处做环形切口。
    3. 握住尸体尾部基部，将皮肤从鼠体拉开以暴露尾部的纤维软骨部分。用手术刀片切除并切割暴露组织的末端10 mm，将其切成1 mm长的片段。
    4. 将组织碎片转移至含有5 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的15 mL锥形管中，该培养基添加有1 U/mL青霉素、1 µg/mL链霉素和1.5 mg/mL胶原酶，并预先通过0.45 µm和0.2 µm滤膜过滤。在37 °C下持续旋转孵育3-4小时。
    5. 在室温下以500 × g 离心10分钟。将沉淀重悬于10 mL DMEM中，该培养基补充有10%胎牛血清、1 U/mL青霉素和1 µg/mL链霉素（DMEM-10），并接种至6孔组织培养板中。传代一次后扩增至10 cm培养皿，再进行下一步操作。
    6. 通过转导携带HPV-16病毒癌基因（E6/E7）的表达载体使细胞永生化，方法如前所述7。
  2. 筛选单细胞克隆并表征 MeCP2 报告基因表达
    1. 从10 cm培养皿中收获细胞。首先吸除培养基，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育2-5分钟。用9 mL DMEM-10终止反应，并将重悬细胞收集至15 mL锥形管中。
    2. 用DMEM-10将细胞稀释至最终浓度为1个细胞/100 µL。通过移液将100 µL悬液加入每个孔，转移至96孔板中。
    3. 在37 °C孵育直至孔内细胞融合，可能需要2-3周。每3-5天更换新鲜DMEM-10。当细胞融合后，每孔加入20 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，并将其分种为两套相同的96孔板。
    4. 使用其中一套孔板检测荧光素酶活性。采用无需去除培养基的均相萤火虫荧光素酶检测试剂盒，按照试剂盒附带的说明书操作。
    5. 根据步骤1.2.4的结果，从剩余的孔板中选择无荧光素酶活性的克隆。将这些克隆扩增至24孔板，再扩增至6孔板。
    6. 同样处理一个荧光素酶活性最高的克隆，作为验证实验的阳性对照。
    7. 从6孔板中每个孔取部分细胞用于Western blot分析。每孔加入200 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，在37 °C孵育2-5分钟。用2 mL DMEM-10终止反应，将一半细胞转移至1.5 mL离心管中。在进行Western blot裂解前，用PBS洗涤细胞一次。或者，将一半细胞转移至另一块6孔板中。待细胞贴壁后，用PBS冲洗并直接裂解用于Western blot。 
    8. 使用抗MeCP2抗体进行Western blot，以确认荧光素酶阴性细胞表达、 而荧光素酶阳性细胞不表达来自活性X染色体的野生型MeCP2；操作步骤参照先前描述的方法8。使用任意野生型小鼠的脑组织裂解液作为阳性对照。
    9. 将多个阴性克隆以每孔2 × 105 个细胞的密度接种于6孔板中。加入10 µM 5-AZA处理一次，在72小时内不更换培养基，然后按照步骤1.2.3所述方法检测荧光素酶活性。
    10. 选择一个经5-AZA处理后获得荧光素酶活性的阴性克隆（Xi克隆），开始将其扩增至多个10 cm培养皿。将其余阴性克隆冻存于液氮中作为备份。阳性克隆（Xa克隆）可继续在细胞培养中维持或冻存以备后续使用。

2. 使用潮霉素B筛选筛选文库以实现再激活

  1. 感染测试克隆、施加筛选压力并收获用于测序的DNA
    1. 从表达发夹结构的shRNA文库中获取逆转录病毒浓缩液，或使用所需文库附带的方案制备浓缩的病毒上清液。
    2. 在进行筛选之前，对文库进行滴定（如有GFP标记，则使用该标记）。感染复数（MOI）应控制在0.3至0.5之间。
      注意：至少进行四次独立的筛选实验，以降低假阳性率。每次筛选使用20个培养皿，以实现文库100倍的覆盖深度，从而充分保留发夹序列的代表性，避免随机丢失9。然而，鉴于本实验为正向筛选且文库规模较大，较低的覆盖深度可能已足够。
    3. 早晨，将1 × 106个Xi细胞接种至10 cm组织培养皿中。
    4. 下午，通过更换培养基为含有病毒上清液和5–10 µg/mL聚凝胺（polybrene）的新鲜DMEM-10来感染细胞。病毒上清液的用量依据步骤2.1.2确定。
    5. 18–24小时后，吸除培养基，并向每个培养皿中加入10 mL新鲜DMEM-10。继续培养48小时。
    6. 早晨，使用每皿1 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，每皿加入9 mL DMEM-10终止反应。将细胞悬液通过100 µm细胞筛过滤。合并所有过滤后的细胞悬液，并以每皿1 × 106个细胞的密度接种两组10 cm培养皿。
    7. 下午，将其中一组培养皿的培养基更换为含15 µg/mL潮霉素B的DMEM-10（定义为第0天）；另一组仅更换为新鲜DMEM-10。
    8. 48小时后，使用1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA消化未处理组的细胞，在37 °C孵育2–5分钟，用9 mL DMEM-10终止反应。将细胞转移至15 mL离心管中，在室温下以500 × g离心5分钟。吸除上清液后立即从沉淀中提取DNA。或者，可在离心前将细胞合并至更大的离心管中。
    9. 采用苯酚与氯仿混合液提取DNA，并用乙酸钠和冷乙醇沉淀DNA，具体方法如前所述10。将各份筛选前的DNA样本合并后保存于-20 °C，待后续使用。
    10. 继续对潮霉素B筛选组进行培养，共持续4天。在第2天时，更换为含新鲜潮霉素B的DMEM-10培养基。
    11. 第7天，将筛选组的培养基更换为仅含新鲜DMEM-10。恢复培养2至4天后，按照步骤2.1.8所述方法收获细胞，并按步骤2.1.9进行DNA提取。
  2. 鉴定在筛选后样本中富集的发夹序列
    1. 使用5'端上下文引物（5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3'）和3'端反向环引物（5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3'），从筛选前和筛选后的DNA样本中扩增半发夹结构。将所有提取的DNA分别用于PCR反应，每反应使用100–200 ng DNA。
      注意：上述5'端上下文引物和3'端反向环引物分别对应shRNA插入片段上游的miR-30上下文序列和shRNA环部序列。不同文库需使用不同的寡核苷酸引物。根据需要调整纯化步骤，以分离不同大小的PCR产物。
    2. 使用大小选择磁珠去除引物和基因组DNA，并回收长度在100–200 bp之间的PCR产物。具体操作遵循磁珠产品附带的说明书。
    3. 构建测序文库以对半发夹序列进行测序。每次筛选应获得至少5000万条测序读段。根据所用测序试剂盒和设备选择合适的建库与测序方案。
      注意：每次筛选获得5000万条读段，可实现文库中每条shRNA约1000倍的代表性，以及每个独立感染事件约10倍的覆盖深度（基于每条shRNA 100倍代表性感染条件），从而确保每个感染事件得到充分代表。
    4. 使用Perl脚本统计与参考序列完全匹配的读段数量，以确定每条shRNA的丰度。选择在筛选前样本中至少有10条读段的shRNA进行后续分析。通过计算筛选后与筛选前读段数的比值来确定富集倍数，并基于1000次置换检验计算错误发现率（FDR）。将靶向基因的shRNA中FDR <5%的基因作为"候选基因"进行进一步验证。

3. 验证鉴定出的发夹结构（"阳性结果"）

  1. 包装筛选中鉴定出的含shRNA的慢病毒
    1. 在10 cm培养皿中每皿接种8 × 106个293FT细胞。
    2. 次日，每皿更换为9 mL无抗生素的DMEM-10培养基；转染前30分钟完成换液。
    3. 在30分钟间隔期间，准备两种转染混合物：
      1. 制备混合物1（每皿/shRNA；根据shRNA总数按比例放大）：将10 µL浓度为2 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）溶于0.5 mL最优最低必需培养基中，用移液器混匀，室温孵育5分钟。
      2. 制备混合物2（每shRNA）：将4 µg待包装的shRNA载体、1.5 µg VSV-G包膜载体（pMD2.G）和2.5 µg包装载体（psPAX2）混合于0.5 mL最优最低必需培养基中。
        注：在包装过程中包含一个空的慢病毒载体，用于后续感染作为阴性对照。
    4. 将0.5 mL混合物1加入每份混合物2中，用移液器轻轻混匀。室温避光孵育20分钟。
    5. 将上述混合物逐滴加入第3.1.2步的各培养皿中，轻轻摇晃培养皿以混匀。
    6. 次日，更换为5 mL新鲜DMEM-10培养基。
    7. 初次转染后48小时，收集上清液并通过0.22 µm滤器过滤。使用DMEM-10预润湿滤器以最大化回收率。
    8. 将过滤后的上清液分装成适合感染6孔板单孔的体积。
    9. 将分装的病毒液于-80 °C冻存以备后续使用，或立即进行转导。
  2. 单个发夹结构的转导及对荧光素酶报告基因和Xi染色体上野生型MeCP2基因再激活效果的检测
    1. 上午，将1 × 105个Xi细胞/孔接种至6孔板中。
    2. 下午，通过更换为含慢病毒上清液和5–10 µg/mL聚比烯的2 mL新鲜DMEM-10培养基进行感染。使用空慢病毒载体产生的病毒上清液感染一个对照孔。
    3. 次日，更换为含1 mg/mL嘌呤霉素的2 mL DMEM-10培养基，继续培养四天。
    4. 更换为2 mL新鲜DMEM-10培养基，恢复培养48–72小时。
    5. 用150 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，37 °C孵育2–5分钟。加入1.5 mL DMEM-10终止反应。将细胞转移至15 mL锥形管中，室温下以500 × g离心10分钟。
    6. 弃去上清，将细胞重悬于100 µL荧光素酶检测试剂盒提供的裂解缓冲液中，室温孵育5分钟。将裂解液转移至白色96孔板，按照试剂盒说明书检测荧光素酶活性。以Xa细胞作为阳性对照，以感染空慢病毒载体的Xi细胞作为阴性对照。
      注：检测前避免将白色板暴露于荧光灯下，以降低背景信号并提高检测灵敏度。尽可能在避光条件下操作试剂盒提供的检测流程，效果最佳。
    7. 为确定该发夹结构是否影响活性X染色体上MeCP2的表达水平，从转导后的Xi细胞中提取RNA，并使用定量PCR检测MeCP2 mRNA水平，引物设计为仅扩增野生型MeCP2（F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3'，R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3'）。
    8. 可选步骤：在细胞从嘌呤霉素筛选中恢复后，加入5-AZA至终浓度0.2 µM，以提高检测灵敏度。不更换培养基继续培养72小时，然后使用商用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。
    9. 检测沉默的野生型MeCP2的再激活情况。将含有单个发夹结构的载体按照步骤3.2.1–3.2.4感染携带野生型MeCP2的Xa细胞。提取细胞RNA，使用定量PCR检测MeCP2 mRNA水平，引物设计为仅扩增野生型MeCP2（F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3'，R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3'）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

小鼠肌腱成纤维细胞取自先前描述的 XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2 雌性小鼠，通过逆转录病毒介导导入人乳头瘤病毒-16（HPV-16）的 E6 和 E7 癌基因实现永生化，经有限稀释法进行克隆，并检测其荧光素酶活性以及野生型 MeCP2 蛋白的表达（图 1A 和 1B）。当报告基因位于活性 X 染色体（Xa）时，荧光素酶活性较强；而位于失活 X 染色体（Xi）时则无法检测到活性；内源性 MeCP2 的表达呈现相反的模式。我们选取了一个无荧光素酶活性的克隆（Xi-8）和一个具有强活性的克隆（Xa-3）用于后续实验。当对 Xi-8 细胞使用 5-AZA 处理时，观察到荧光素酶活性呈剂量依赖性诱导升高（图 1C）。

通过为期3天和6天的筛选实验，检测了Xi-8细胞和Xa-3细胞对潮霉素B的敏感性。与荧光素酶报告基因的表达模式预期一致，Xi-8细胞对潮霉素B的敏感性高于Xa-3细胞，尽管...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在我们最近的一项研究6中，我们构建了一种小鼠细胞系，其Xi染色体上的MeCP2基因融合了荧光素酶基因和潮霉素抗性基因，并用一个包含>60,000个靶向>25,000个基因的shRNA文库对该细胞系进行转导。我们发现有30个基因在表达被敲低后可在潮霉素B筛选条件下赋予细胞生存优势，提示这些基因在调控MeCP2及X染色体沉默中发挥作用。通过使用单个发夹RNA转导该细胞系并检测沉默的荧光素酶报告基因的再激活，验证了上述结果。

在我们筛选的所有重复实验中，排名前四的发夹结构均靶向XIST，这一发现为我们的方法提供了强有力的内部验证，鉴于XIST在X染色体失活（XCI）中的关键作用11。除TGFβ超家族外（其在XCI中的调控作用此前尚未见报道），其余鉴定出的基因均属于与表观遗传调控相关的功能基因家族，这进一步验证了我们方法的可靠性12,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

Leko 博士作为弗雷德·哈钦森癌症研究中心的雇员参与了本文的撰写。  本文表达的观点仅为作者个人观点，不一定代表美国国立卫生研究院或美国政府的观点

致谢

我们感谢墨尔本大学的 Ross Dickins 慷慨提供本筛选实验所用的 shRNA 文库。本研究由Rett综合征研究信托基金（A.B.）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
293FT 细胞系InvitrogenR700-07
5-氮杂胞苷SigmaA2385-100MG
Agencourt AMPure XPBeckman-CoulterA63881
抗 MECP2 抗体Millipore07-013
胶原酶SigmaC2674-1G
Corning 96 孔实心白色聚苯乙烯微孔板Fisher Scientific07-200-336
杜尔贝科改良伊格尔培养基Gibco11965-092
Expression Arrest microRNA 适配型逆转录病毒载体（pMSCV）Open BiosystemsEAV4679
Expression Arrest pSM2 逆转录病毒 shRNAmir 文库Open BiosystemsRMM3796
胎牛血清Fisherbrand03-600-511
HiSeq 2500IlluminaSY–401–2501或同等产品
潮霉素 BCalbiochem400051-1MU
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Bright-Glo 荧光素酶检测试剂系统PromegaE2610用于克隆筛选的均相检测法
荧光素酶检测试剂系统PromegaE4530用于检测单个发夹结构的非均相检测法
Luminometer TopCount NXTPerkin ElmerN/A或类似型号的发光仪
MiSeq 试剂盒 v2IlluminaMS-102-2001请使用与设备兼容的试剂盒
Opti-MEMGibco31985-070
青霉素-链霉素Gibco15140-122
pMD2.GAddgene#12259VSV-G 包膜载体
聚凝胺SigmaTR-1003-G
聚乙烯亚胺Polysciences23966-1
psPAX2Addgene#12260包装载体
嘌呤霉素GibcoA11138-02
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红Gibco25300-054

参考文献

  1. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  2. Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
  3. Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
  4. Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
  5. Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
  6. Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
  7. Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
  8. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
  9. Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341(2012).
  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
  11. Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
  12. Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
  13. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
  14. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
  15. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

X MeCP2

相关文章