本文介绍了一种用于多孔板膜插件系统中测定通透性的方法，以及通过模拟进行扩散系数计算的in silico参数优化方法。
本文内容
摘要
摘要
体外培养的皮肤模型在药物和化妆品应用中变得越来越重要，同时也被用于药物开发和物质测试。这些模型通常在膜插件系统中培养，其对不同物质的通透性是一个关键因素。通常用于测定这些参数的方法往往需要较大的样品量（例如，Franz扩散池）或复杂的设备（例如，光漂白后荧光恢复技术（FRAP））。本研究提出了一种直接在直径为4.26 mm和12.2 mm（培养面积）的膜插件系统中测定通透系数的方法。该方法使用琼脂糖凝胶、胶原凝胶以及由胶原构成的细胞模型（模拟皮肤模型）进行了验证。该方法能够准确描述不同分子大小的物质的渗透过程，以及物质通过不同细胞模型（由胶原凝胶、成纤维细胞和HaCaT细胞组成）的渗透行为。
此外，为了支持上述实验方法，建立了一个模拟系统。该模拟对于斯托克斯半径小于等于14 × 10-10 m（分子量4,000）的小分子物质，能够很好地拟合实验数据，因此是一种描述该系统的有效工具。进一步地，该模拟可显著减少实验工作量，并具有足够的鲁棒性，可扩展或调整用于更复杂的实验装置。
引言
类器官三维培养已成为药物开发和物质测试的有力工具1在这方面，由于法规要求（如化妆品行业中的相关规定），人类皮肤模型备受关注。这些要求进而推动了多种3D皮肤模型的开发，这些模型既可单独用作多孔板中的单器官培养，也可与其他器官模型联用，构建多器官芯片。 例如肝脏2.
在皮肤等效物的培养过程中，气液界面（ALI）是实现表皮正常分化的关键要素3。通常使用由底部带有液体可渗透膜的培养小室组成的细胞培养插入式装置来建立气液界面。ALI技术广泛应用于多种商业化的皮肤模型，如EpiDerm4、Phenion5和Episkin6，可用于培养直径范围从96孔板（4.26 mm）至12孔板（12.2 mm）的不同尺寸皮肤模型。本文所述方法用于测定物质在膜插入系统中的渗透性。
渗透系数是评估任何体外培养皮肤模型质量的重要参数，可用于评价活性物质穿过皮肤的速度5。特别是当药物或化妆品需要经皮施用时，该参数对于明确活性成分何时确切地透过皮肤至关重要。通过模拟还可进一步预测系统的行为，从而在涉及大量物质时显著减少所需耗时的实验工作量。
Franz 扩散池是进行皮肤及皮肤模型渗透实验的先进设备5,6,7,8,9。该装置由两个腔室组成，中间固定有样品（扩散屏障）。待测物质直接施加于样品顶部（供体腔室），而渗透化合物的浓度可在相对一侧（受体腔室）进行检测。受体侧通过温控室和磁力搅拌器确保恒定的温度和均匀的物质浓度。样品可从 Franz 扩散池受体侧的取样臂中取出。该系统的高度范围为 19 cm 至 179 cm，相对较大10,11。另一种测定类凝胶物质和组织中扩散系数的方法是荧光漂白后恢复技术（FRAP）。该技术利用激光漂白凝胶中荧光标记粒子的原理，随后通过测定漂白区域荧光恢复所需的时间来计算扩散系数12,13,14。
此外，傅里叶变换红外光谱（FTIR）可通过检测颗粒对红外光的吸收来监测其运动，从而确定物质在皮肤中的渗透过程15,16。然而，这些方法或其他成像技术（例如，双光子荧光相关光谱法17）需要使用成本高昂的仪器。
本文介绍了一种在膜插件系统中直接测量屏障通透性的方法，该系统可用于培养皮肤模型。该方法能够在紧凑的系统中对大量小尺寸样品（孔径最大4.26 mm）进行通透性实验。相比之下，Franz扩散池需要为每个样品配备独立的装置，且每个样品必须安装在设备上，对于小尺寸样品（直径4.26 mm）而言难以实现。此外，该方法无需复杂的仪器设备（例如，使用共聚焦或双光子显微镜），可实现时间和成本的双重降低。
所有实验均在微孔膜插入系统中进行，样品（屏障）由在膜上构建的琼脂糖凝胶或胶原细胞模型组成。将不同分子大小的荧光物质（供体）施加于样品顶部，使用荧光酶标仪检测底部（受体）中渗透物质的浓度（见图1）。为验证该方法并测试此模拟的准确性，制备并使用了琼脂糖凝胶作为屏障。水凝胶通常用于生物科学中多孔介质内扩散与渗透过程的研究13。随后，该方法在接种细胞的系统中进行测试，该系统由原代成纤维细胞和人成人低钙高温度角质形成细胞（HaCaT）构成的胶原基质（细胞-基质模型）组成，是一种简化的皮肤模型18,19。
此外，通过计算流体动力学的流动模拟对渗透过程进行了仿真。研究发现，通过参数优化，可从实验数据中计算出扩散系数。总体而言，该模拟具有多种应用；例如，可根据短时间实验预测渗透过程，且该模拟可显著减少实验次数。
实验方法与模拟旨在应用于器官芯片系统1,20,21，特别是已实现商业化开发的双器官芯片（2-OC）1,22,23,24,25。原则上，基于膜插件系统的任何器官模型的渗透过程均可通过此方式描述。
方案
1. 准备用于通透性研究的样品
注意：为了验证渗透测量结果和模拟实验，使用了由琼脂糖凝胶或基于皮肤模型培养构建的细胞基质模型组成的样品。
- 琼脂糖凝胶
- 将0.2 g高分辨率琼脂糖粉末溶解于10 mL H2O（双蒸水）
- 混合溶液并加热至 80 °C保持温度8分钟。
- 应用 28.6 µL 将琼脂糖凝胶置于96孔膜插件系统（直径4.26 mm）的膜上，或使用 226 µL 用于12孔膜插件系统（直径12 mm）（例如，Transwell 系统）
- 等待10分钟，直至凝胶完全凝固。
- 胶原凝胶
注意：所有步骤均在无菌条件下进行，且溶液需置于冰上以减缓胶原凝胶的聚合。- 混合 125 µL 含1 mL 0.4% 胶原酶R溶液（大鼠尾胶原）的Hanks'平衡盐溶液（HBSS）
- 用 1 M NaOH（氢氧化钠）滴定溶液（约6 µL直至酚红颜色由黄色变为红色。
- 添加 125 µL 向胶原凝胶中加入杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）+ 10% 胎牛血清（FCS），并用移液器吸头轻轻混匀。
- 应用 28.6 µL 将胶原凝胶加入96孔膜插件系统的膜上或 226 µL 用于12孔膜插件系统。
- 将凝胶置于孵育箱中（37 °C，5% CO₂230 分钟
- 成纤维细胞胶原细胞模型
注意：所有步骤均在无菌条件下进行。- 实验前5-7天准备原代成纤维细胞。将成纤维细胞接种于细胞培养瓶（75 cm²）中，使用DMEM + 10% FCS培养基进行培养。2）并每2-3天更换一次培养基。
注意：根据实验设置的不同，可使用更多的细胞。 - 从细胞培养瓶（80% 汇合度）中移除培养基，用 10 mL（培养瓶 75 cm²）预温的 PBS 洗涤两次2磷酸盐缓冲液（PBS）中。加入3 mL 0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），于37°C孵育3分钟 37 °C.
- 轻轻敲击培养瓶，使细胞从瓶壁脱落。加入3 mL DMEM + 10% FCS终止反应。将溶液转移至离心管中。
- 将细胞悬液在120 × g条件下离心，弃去上清液，并用0.5 mL DMEM + 10% FCS重悬细胞。
- 计数细胞并调整浓度至 0.5 x 106 cells/mL
注意：以下步骤均在冰上操作，以减缓胶原凝胶的聚合。 - 混合 125 µL 含1 mL 0.4%胶原酶R溶液的HBSS
- 用 1 M NaOH 滴定溶液（约 6 µL直至酚红颜色由黄色变为红色。
- 添加 125 µL 细胞悬液（DMEM + 10% FCS + 0.5 x 106 细胞/mL）加入胶原凝胶中，并用移液器小心混匀。
- 应用 28.6 µL 在96孔膜插件系统的膜上制备胶原凝胶 226 µL 用于12孔膜插件系统。
- 将凝胶置于孵育箱中（37 °C，5% CO₂230 分钟
- 应用 75 µL DMEM + 10% FCS 加于凝胶表面 300 µL 96孔膜插件系统的接收板。对于12孔膜插件系统，使用相应体积的 590 µL 用于表面和 1,846 µL 用于接收板。
- 从细胞基质模型（气液界面）表面移除培养基，并将细胞基质模型继续培养7天。使用 100 μl 底部培养基，每天更换培养基。
- 实验前5-7天准备原代成纤维细胞。将成纤维细胞接种于细胞培养瓶（75 cm²）中，使用DMEM + 10% FCS培养基进行培养。2）并每2-3天更换一次培养基。
- HaCaT 胶原细胞模型
注意：所有步骤均在无菌条件下进行。- 在进行以下步骤前5-7天准备HaCaT细胞。将HaCaT细胞接种于细胞培养瓶（75 mm）中，使用DMEM + 5% FCS培养基进行培养。2）并每2-3天更换一次培养基。
注意：根据实验设置的不同，可使用更多的细胞。 - 从培养瓶中移除培养基，用10 mL（培养瓶75 cm²）洗涤两次2) 的 PBS。加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，于 10 分钟内孵育 37 °C用3 mL DMEM + 10% FCS终止反应。将溶液转移至离心管中。
- 以 120 × g 离心细胞悬液，弃上清，加入 0.5 mL DMEM + 10% FCS 重悬细胞。
- 计数细胞并调整浓度至 0.5 x 106 cells/mL
注意：以下步骤均在冰上操作，以减缓胶原凝胶的聚合。 - 混合 125 µL 含1 mL 0.4%胶原酶R溶液的HBSS
- 用 1 M NaOH 滴定溶液（约 6 µL直至酚红颜色由黄色变为红色。
- 添加 125 µL 将 DMEM + 10% FCS 加入胶原凝胶中，并用移液器小心混匀。
- 应用 28.6 µL 96孔膜插件系统膜上的细胞悬液 226 µL 用于12孔膜插件系统。
- 将凝胶置于孵育箱中（37 °C，5% CO₂230 分钟
- 应用 75 µL 将细胞悬液加入凝胶表面并添加 300 µL DMEM + 10% FCS 加入至 96 孔膜插件系统的接收板中。对于 12 孔膜插件系统，使用相应体积的 590 µL 用于表面的细胞悬液 1,846 µL DMEM + 10% FCS 用于接收板。
- 将细胞基质模型孵育3天；在第2天更换培养基。
- 从细胞基质模型表面移除培养基，并将细胞基质模型继续孵育7天。使用 100 µl 底部培养基，每天更换培养基。
- 在进行以下步骤前5-7天准备HaCaT细胞。将HaCaT细胞接种于细胞培养瓶（75 mm）中，使用DMEM + 5% FCS培养基进行培养。2）并每2-3天更换一次培养基。
- 成纤维细胞与HaCaT细胞的胶原细胞模型
注意：所有步骤均需在冰上无菌操作，以减缓胶原凝胶的聚合。按照步骤1.3至1.3.5所述方法制备成纤维细胞，并于次日按照步骤1.4至1.4.4所述方法制备HaCaT细胞。- 混合 125 µL 0.4% 胶原酶R溶液中的HBSS
- 用 1 M NaOH 中和溶液（约6 µL直至酚红颜色由黄色变为紫红色。
- 添加 125 µL 由DMEM + 10% FCS + 0.5 x 10组成的原代成纤维细胞悬液6 细胞/mL加入胶原凝胶中并小心混匀。
- 应用 28.6 µL 将细胞悬液加入96孔膜插件系统的膜上 226 µL 用于12孔膜插件系统。
- 将凝胶置于孵育箱中（37 °C，5% CO230 分钟
- 接下来，应用 75 µL DMEM + 10% FCS 加于凝胶表面 300 µL 转移到96孔膜插件系统的接收板中。对于12孔膜插件系统，加入一定体积的 590 µL 用于表面和 1,846 µL 用于接收板。
- 在37°C、5% CO₂培养箱中孵育1天 37 °C 和5% CO2.
- 移除表面的培养基，加入含有0.5 x 10⁶个HaCaT细胞的细胞悬液6 细胞/mL。体积与步骤1.5.6中所述相同。
- 将细胞基质模型孵育3天；在第2天更换培养基。
- 移除细胞基质模型表面的培养基，并将细胞基质模型继续培养7天。使用 100 µl 底部培养基，每天更换培养基。
注意：本研究中，为12孔膜插件系统制备了3个凝胶/细胞模型样品。对于96孔膜插件系统，凝胶/细胞模型使用了6个样品。通常进行统计分析时，3个样品较为常见。但由于在96孔膜插件系统中使用胶原基质模型进行细胞培养时，预计可能出现培养失败或数据偏差，因此我们选择了更多的样品数量。
2. 膜插入系统中的通透性研究
- 供体物质
注意：制备两种荧光素钠盐（NaFl）。- 将NaFl溶于H2O中，浓度分别为0.1 mg/mL和0.01 mg/mL。将分子量为4,000、10,000、20,000和40,000 g/mol的不同荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（FD）溶于H2O中，浓度为2 mg/mL。将这些溶液用作琼脂糖凝胶渗透实验的供体物质（见图1）。
- 对于胶原细胞模型的实验体系，所有溶液均使用DMEM + 10% FCS代替水进行配制。
注意：请预先配制供体物质的储备液（浓度为10倍）。供体浓度的微小变化可能影响渗透实验的结果。
- 实验方法
注意：渗透实验在37 °C、湿度> 90%的条件下进行。该参数可确保细胞的活性。由于温度会影响扩散过程，因此琼脂糖凝胶、胶原凝胶及胶原细胞模型的实验均采用相同的参数。括号中的体积信息适用于12孔膜插件系统。- 使用由琼脂糖凝胶（见方案1.1）或细胞模型（见方案1.2–1.5）构成的屏障，并加入荧光供体物质，组装96孔（或12孔）膜插件系统。
- 为建立标准曲线，将供体物质配制成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160和1:320的系列稀释液。每种稀释液取300 µL（1,846 µL）加入接收板的三个孔中。对于12孔膜插件系统，应使用独立的接收板。该系列稀释液用于将测得的荧光值[RFU]转换为相应的浓度[mg/mL]。
- 在样品（琼脂糖凝胶或细胞模型）上方加入75 µL（590 µL）供体物质，并在接收板中加入300 µL（1,846 µL）受体物质（H2O或DMEM + 10% FCS）（见图1）。
注意：确保膜插件系统与接收板中液体的液面处于相同高度，以避免产生静水压。 - 将整个系统置于培养箱内的摇床上。调节振荡参数以实现均匀混合（总行程轨道为1.5 mm，速度调至3.5档，相当于约480 转/分钟），以避免浓度梯度，从而影响扩散过程。
- 每隔一小时定期测定荧光强度。测量时，将膜插件系统转移至空板中，使用酶标仪检测接收侧内的荧光强度。荧光素的激发波长设为485 nm，发射波长设为535 nm。
- 实验持续运行5小时。
注意：实验过程中，整个系统中的液体会发生蒸发。蒸发会改变供体和受体中的浓度，从而影响实验结果。在运行时间为5小时的情况下，该效应可忽略不计；但对于更长时间的实验，应予以考虑。
- 渗透系数的计算
- 为建立标准曲线，以系列稀释液的荧光强度对浓度作图，并对数据进行线性回归分析。
- 利用线性回归的斜率将渗透实验的荧光数据转换为浓度。为便于模拟，将单位转换为mol/m3。
- 以浓度对时间作图，确定数据的线性区段（见图2）。
- 确定该线性部分的斜率，并根据以下公式计算渗透系数（示例见图2）：
其中dcA/dt表示受体侧物质浓度随时间的变化率（即斜率）；CD为供体侧浓度；P为渗透系数；A为渗透面积；VA为受体体积。该方程源自菲克第一定律，仅在CD » CA6,22时适用。 - 注意：供体中的浓度必须远高于受体中检测到的浓度。本实验体系已验证了该条件。
3. 模拟
注意：模拟使用 COMSOL Multiphysics 5.1 完成，假定用户已具备该软件的基本知识。进行扩散模拟时，采用以下假设：（a）物质在 H2O 中的扩散系数远高于在凝胶中的扩散系数。为补偿这一差异，模拟中采用 1 × 10-9 m2/s 的数值，该值比 NaFl 在 2% 琼脂糖凝胶中的扩散系数高 10 至 100 倍。（b）在实验中，物质先通过屏障，再穿过膜插件系统的膜。而与实验设置不同的是，虚拟的琼脂糖凝胶或细胞基质与膜被视为一个均一相。（c）膜插件系统中壁面的边界效应设为“无滑移”，忽略所有壁面上的滑移效应（但不包括液体与凝胶之间或液体与细胞模型之间的界面），且这些效应对扩散过程无显著影响。
- 扩散模拟的设置
注意：这些步骤演示了通透性实验模拟的设置过程。96孔和12孔膜插件系统的模拟分别进行设置。“化学物质传输”模块采用基于菲克第二扩散定律的方程：
其中，c 为物质的浓度，t 为时间，u 为流速，D 为扩散系数，R 为反应速率。由于扩散过程中未发生化学反应，反应速率项被忽略。- 打开程序并创建一个新模型。选择“模型向导”，选取三维模型，在下拉菜单中将“稀物质传递”添加到物理场接口，点击“研究”，选择“瞬态”研究，然后点击“完成”。
- 转到“全局定义”，右键单击并添加“参数”。在网格中输入几何和物理参数（参见 表1, 表 2，以及 图3e).
注意：在96孔膜插件系统中，琼脂糖凝胶的凹面通过浸入球进行近似模拟。 - 根据实验设置膜插件系统的几何结构。在步骤3.2中，展示了如何构建96孔膜插件系统的几何结构示例。长度单位设定为米。
注意：为节省计算时间，无需构建完整的几何模型。可通过使用几何结构四分之一部分的中心线来简化模型（参见 图3a 和 图3b). - 在“Definitions”中添加两个“Domain Probes”（右键单击“Definitions”，找到“Probe”），并将其中一个探针设为受体区域，另一个设为供体区域。为两者均选择类型为“Average”，表达式为“c”，单位为“mol/m”3".
注意：此步骤为可选步骤，用于显示模拟过程中受体和供体的浓度。 - 在“稀释组分的传递”中，将“传递属性 1”内的扩散系数（Dc）设置为“Dif_w”。
注意：“Transport Properties 1”同时用于受体和供体区域。在下一步中，该设置将被势垒区域的参数覆盖。 - 右键单击“稀释物质传递”，添加第二个“传递属性 2”，并在“域选择”中选择屏障（2）。根据模拟目标，扩散系数可设置为屏障的数值，或设为一个虚拟变量“D”。在首次测试运行中，将扩散系数设为 2E-10 m2/ s.
注意：“D”将在步骤 3.3 中稍后定义。 - 在“稀释组分传输”中，为“初始值 1”将浓度定义为零。
注意：“初始值1”用于屏障域和受体域。在下一步中，供体域将被覆盖。 - 右键单击“稀释物质的传递”，添加第二个“初始值 2”，并选择供体区域（3）作为域。将浓度设置为供体物质的初始浓度例如，表2中的C_fl。
- 右键单击“稀物质传递”，添加“对称性 1”，并选择“边界选择”中所有与整个几何体呈镜像关系的表面（对于步骤 3.2 中的几何示例，即边界编号 1、2、4、5、7、8）。
注意：如果已设置完整几何结构，则可忽略此步骤。 - 右键单击“Mesh”，添加两个“Free Tetrahedral”。选择屏障（2）作为域（将几何实体级别更改为“Domain”）。右键单击“Free Tetrahedral 1”，添加“Size”，针对12孔膜插件系统选择预定义网格“Finer”，针对96孔膜插件系统选择“Extra Fine”。
- 在第二个“自由四面体”中，选择受体和供体作为域，并为12孔膜插件系统选择预定义网格“Normal”，或为96孔膜插件系统选择“Finer”（参见 图3c 和 图3d).
注意：也可选择较粗的网格以节省计算时间，但这可能会降低结果的准确性。在“网格设置”中点击“生成全部”以对几何体进行网格划分。 - 在“研究1”中，点击“计算”以启动模拟。
- 几何结构示例装置
注意：此处以96孔膜插件系统（带凹面屏障）的几何结构设置为例进行说明。所有步骤均在程序的几何模块中执行。长度单位设置为米。- 生成圆柱体1（右键单击“Geometry 1”），半径为 d_w/2，高度为 h_sp+h_b+h_a。
- 生成一个圆柱体2，其半径为 d_tran/2，高度为 h_b+h_a，z 轴位置为 h_sp。
- 使用“差集”选项（右键单击“Geometry 1”，找到“Booleans and Partition”），从圆柱体1中减去圆柱体2。在“要添加的对象”中选择“cyl1”，激活“要减去的对象”并选择“cyl2”。新生成的体积即为受体的几何结构。
- 生成一个圆柱体3，其半径为 d_a/2，高度为 h_b，z 轴位置为 h_sp。
- 生成一个半径为 r、z 坐标为 r_z 的球体 1。
- 使用“差集”选项从圆柱体3（cyl3）中减去球体1（sph1）。新生成的体积称为差集2。
- 生成一个圆柱体4，其半径为d_a/2，高度为h_b+h_a，z轴位置为h_sp。
- 使用“差异”选项将圆柱体4（cyl4）从差异2中减去。新生成的体积即为受体的几何形状。
- 重复步骤 3.2.4–3.2.6 以构建屏障（实验中的琼脂糖凝胶或细胞模型）。
- 右键单击“Geometry 1”，找到“Booleans and Partition”，对所有几何元素执行并集操作。
- 生成一个块1，其所有边的长度均设置为 d_tran*2，x 位置为 -d_tran，y 位置为 d_tran*2。
- 生成一个所有边长为 d_tran*2 的方块2，其 x 位置为 -d_tran*2，y 位置为 -d_tran。
- 使用“差集”选项从块1和块2中减去并集1。
- 将参数优化加入模拟
注意：通过参数优化，可将扩散系数拟合到先前生成的实验数据。以下说明介绍如何将优化部分整合到扩散模拟中。在开始这些步骤之前，请确保扩散模拟已能正常运行。- 使用“添加物理场”将“优化”物理模块（可在“数学”类别下的“优化与灵敏度”中找到）添加到仿真中。单击“添加到组件”。
- 在“定义”下（组件内局部）右键单击，添加“变量”，并输入以下变量 表3.
注意：参数优化使用实数， 即，因子 1-10 扩散系数必须单独定义。 - 在“组件耦合”部分的“定义”上右键单击，添加一个“平均值 1”，并输入算子名称“Acceptor”。
- 生成一个包含实验数据的独立文本文件。
注意：分号分隔列，换行分隔行。时间声明以秒为单位，浓度以 mol/m 表示3。去除滞后期中的第一个和第二个数据点（参见 图2以避免可能出现的拟合误差。以下是一个文本文件可能呈现的示例：
3540; 0.00216
7140; 0.00724
12240; 0.01707
15180; 0.02230
18660; 0.02697
21540; 0.02931
此示例可用于测试模拟。 - 右键单击“优化”，添加“全局最小二乘目标”，将步骤 3.3.4 中的文本文档附加到“实验数据”，然后右键单击“全局最小二乘目标”，将第一列定义为“时间列 1”，再右键单击“全局最小二乘目标”，将第二列定义为“值列 1”。在“值列”的“表达式”中输入变量“C”。
- 右键单击“Optimization”，添加“Global Control Variables 1”，并将“D_search”声明为变量，初始值为“1”，下限为“0”，上限为“1000”。
- 右键单击“Study 1”，添加“优化”，并选择“SNOPT”作为优化求解器方法。将最优性容差设置为1E-9。
注意：如果模拟未收敛，请增大最优性容差。需注意，若最优性容差设置过大，模拟结果将不准确。 - 在“study”中以“compute”开始参数优化。不要忘记将屏障上的扩散系数设置为“D”。
结果
为了评估模拟的准确性，采用96孔膜插件系统并以2%琼脂糖凝胶作为屏障进行通透性实验。使用荧光素钠盐（NaFl）和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FD）来验证扩散物质分子大小的影响，其斯托克斯半径范围为5 × 10-10 m 至 45 × 10-10 m（分子量376.27–40,000）。通过模拟的固有参数优化，使模拟结果与实验数据相拟合。
为此，仅将模拟渗透率曲线的线性部分的斜率与实验结果进行比较。对于较小的分子尺寸，模拟数据与实验数据吻合良好，NaFl 为 99.2%，FD 4,000 为 80.2%（见图 4a 和 图 4b）。对于较大的分子尺寸，偏差增大，FD 10,000、FD 20,000 和 FD 40,000 的相关性分别为 50.5%、79.7% 和 53.6%。模拟曲线在初始阶段表现出延迟，在后续过程中上升更为显著（见图 4c-4e）。
渗透系数和模拟扩散系数如表4所示。渗透系数随分子尺寸增大而减小。标准偏差介于0.08 × 10-8 m/s至0.47 × 10-8 m/s之间（N = 7），对应的绝对误差为4.18%至46.15%。较大分子的实验显示出更大的绝对误差。模拟扩散系数的变化趋势与实验测得的渗透系数非常相似。具有较大斯托克斯半径的物质，其扩散系数降低，绝对误差范围为9.09%至18.46%（N = 3）。
在额外的渗透实验中，采用四种不同的胶原细胞模型类型作为12孔膜插件系统中的屏障。这些模型包括无细胞模型，以及在胶原凝胶中包含不同组合的原代成纤维细胞、在表面培养HaCaT细胞的细胞模型。具体组合如下：仅胶原（Col.）作为无细胞模型、胶原+成纤维细胞（Col.+F.）、胶原+HaCaT（Col.+H.），以及胶原+成纤维细胞+HaCaT（Col.+F.+H.）。以含10% FCS的DMEM溶解荧光素钠盐作为供体物质。对胶原细胞模型进行图像分析时，采用苏木精-伊红（HE）染色，操作依照试剂生产商的方案进行。在图5中展示了代表性Col.+F.+H.模型的HE染色结果。HE染色轻微着色胶原基质的组织结构。成纤维细胞位于基质内部，其细胞核与HaCaT细胞的细胞核均被染成深紫色。在胶原基质顶部存在一层富含细胞核的结构，应为HaCaT细胞的细胞核，形成覆盖于模型表面的封闭层。
在表5中列出了实验测得的渗透系数和模拟的扩散系数。对于大多数含有HaCaT的模型，可以观察到其渗透/扩散系数均低于不含HaCaT的模型。渗透系数的绝对误差为10.9–24.4%，扩散系数的绝对误差为5.2%–12.9%。
图1：膜插件系统中通透性实验的侧视图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：渗透性实验的典型图示。 图示为受体中浓度随时间的变化。两条虚线标出了曲线中接近线性的部分。该线性部分的斜率用于确定渗透系数。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：模拟中膜插件系统的几何结构与网格。（a）96孔膜插件系统的几何结构。（b）12孔膜插件系统的几何结构。（c）96孔膜插件系统的网格。（d）12孔膜插件系统的网格。（e）膜插件系统的横截面及参数。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：渗透实验的实测数据与优化后模拟结果的对比。 (a) 荧光素钠盐，(b) 异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（分子量4,000），(c) 分子量10,000，(d) 分子量20,000，以及(e) 分子量40,000。 请点击此处查看该图的高清版本。
图5：胶原细胞模型（胶原 + 成纤维细胞 + HaCaT）的代表性苏木精-伊红（HE）染色结果。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：在96孔膜插件系统中，使用荧光素钠盐和异硫氰酸荧光素-葡聚糖，渗透系数与1/斯托克斯半径的关系。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 名称 | 96孔系统的表达式（单位：mm） | 12孔系统的表达式（单位：mm） | 描述 |
| d_tran | 5.65 [mm] | 14.7 [mm] | 孔的直径 |
| d_a | 4.26 [mm] | 12.1 [mm] | 膜的直径 |
| d_w | 8.79 [mm] | 21.97 [mm] | 受体的直径 |
| h_b | 2 [mm] | 2 [mm] | 屏障的高度 |
| h_sp | 1 [mm] | 1 [mm] | 孔与底部之间的距离 |
| h_a | 4.73 [mm] | 5.24 [mm] | 受体的高度 |
| b | h_b/2 | - | 浸入深度 |
| r | ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) | - | 浸入球的半径+ |
| r_z | r+h_b | - | 浸入球的 z 轴位置+ |
表1：“化学物种传输”模拟的几何参数。+仅用于96孔膜插件系统中琼脂糖凝胶的模拟。
| 名称 | 表达式 | 数值 | 描述 |
| C_fl | 0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol] | 0.26576 mol/m2 | Fl.So. 的浓度 |
| C_4 | 2 [mg/ml]/4000 [g/mol] | 0.5 mol/m2 | FD 4.000 的浓度 |
| C_10 | 2 [mg/ml]/10000 [g/mol] | 0.2 mol/m2 | FD 10.000 的浓度 |
| C_20 | 2 [mg/ml]/20000 [g/mol] | 0.1 mol/m2 | FD 20.000 的浓度 |
| C_40 | 2 [mg/ml]/40000 [g/mol] | 0.05 mol/m2 | FD 40.000 的浓度 |
| Dif_w | 1e-9 [m^2/s] | 1E-9m2/s | 混合水的扩散系数 |
表2：“化学组分传输”模拟的物理参数。
| 名称 | 表达式 | 描述 |
| C | Acceptor(c) | 受体浓度的定义 |
| D | D_search*1e-10 | D 的变化因子 |
表3：“优化”模拟的参数。
| 渗透物 | 渗透系数 (m/s)×10-8 | 扩散系数 (m/s2)×10-10 | 渗透物的斯托克斯半径 (m)×10-10 |
| Fl.So. | 4.79 ± 0.20 | 1.94 ± 0.34 | 5 |
| FD 4,000 | 2.37 ± 0.31 | 0.65 ± 0.12 | 14 |
| FD10,000 | 1.67 ± 0.47 | 0.22 ± 0.02 | 23 |
| FD 20,000 | 0.65 ± 0.30 | 0.29 ± 0.04 | 33 |
| FD 40,000 | 0.27 ± 0.08 | 0.14 ± 0.02 | 45 |
表4：在96孔膜插件系统中，不同斯托克斯半径的物质通过2%琼脂糖凝胶+膜的渗透性与扩散系数。（荧光素钠盐 = Fl. So.，FITC葡聚糖 = FD）
| 模型 | 通透系数 (m/s)×10-8 | 扩散系数 (m/s2)×10-10 |
| Col. | 2.18 ± 0.29 | 1.22 ± 0.06 |
| Col.+F. | 1.77 ± 0.38 | 0.93 ± 0.12 |
| Col.+H. | 1.64 ± 0.40 | 0.96 ± 0.05 |
| Col.+F.+H. | 1.65 ± 0.18 | 0.88 ± 0.11 |
表5：荧光素钠盐通过12孔胶原细胞模型的通透性与扩散系数-细胞培养小室膜系统（Col. = 胶原蛋白，F. = 成纤维细胞，H. = HaCaT）
讨论
本研究记录了一种用于量化通过膜上构建的组织模型的渗透作用的方法。首先通过琼脂糖凝胶测试了不同分子大小物质的渗透，以验证该方法及其相应模拟的准确性。众所周知，较小的分子能更快地穿过基质网格（凝胶过滤渗透色谱效应除外）。类似现象也见于物质通过巩膜26、人表皮膜27、人皮肤17和大鼠皮肤28的排阻实验。已有研究显示，渗透系数与相应的斯托克斯半径（即与所描述分子具有相同扩散速率的刚性球体的半径，通常小于分子的有效半径）呈负相关26,28，本实验中对不同分子大小物质的测试也观察到了类似关系。将渗透系数对1/斯托克斯半径作图后，在分子尺寸最小的四组物质中发现了良好的线性相关性（R2 = 0.93）（图6）。这表明，采用本研究所建议方法模拟得到的渗透系数处于合理范围内。
实验中46.15%的误差略高于使用Franz扩散池系统进行通透性实验所报道的结果10。一个可能的解释是异硫氰酸荧光素标记葡聚糖的尺寸分布，这一点将在后文讨论。
与使用 Franz 扩散池系统的方法相比，所描述的方法具有重要优势。首先，装置更为紧凑；实验直接在膜插件系统中进行，其尺寸与商用孔板相当（∼ 13 cm × 8.5 cm），可同时运行多个样本，而每个样本使用Franz扩散池则需单独的装置。其次，皮肤模型的通透性可直接在培养发生的膜插件中进行测量。使用Franz扩散池时，需将样本取出并安装至系统中，对于小样本而言操作更为繁琐，且更加耗时。
胶原细胞基质的渗透实验表明，该方法可成功应用于接种细胞的体系。本文提出的方法已针对皮肤模型进行了验证；然而，该方法也可应用于其他类型的有机细胞培养，例如肾脏或肝脏模型。
本研究采用了一种胶原-细胞模型，其中HaCaT细胞完全覆盖了模型表面（参见 图5）。这导致了渗透系数的降低，表明该方法具有足够的灵敏度，能够区分含有与不含HaCaT细胞层的胶原-细胞模型之间的渗透系数差异。理想的皮肤模型应能形成接近真实皮肤表皮的屏障结构。29，并因此验证其质量至关重要（例如，皮肤模型在实际使用前的真皮和表皮构建。皮肤模型的发育可通过染色技术进行可视化，并通过皮肤蛋白和胶原蛋白的检测进行定量分析30,31,32渗透系数也可能是评估皮肤模型发育的重要因素，但需要进一步实验加以验证。如前所述，该方法支持多个样品的平行操作，也可在培养过程中取样测量渗透性，从而监测皮肤模型该参数的发育变化。
需要注意的是，通透性是通过凝胶/胶原-细胞模型和膜同时测量的。所检测到的通透系数具有系统特异性，因此只有使用相同的膜插件时，不同皮肤模型的结果才可相互比较。此外，皮肤模型必须完全覆盖整个培养区域，以确保测试物质仅通过模型本身渗透，而非从其周围旁路渗透，否则将导致测得的通透性出现误差。另一个在未来的实验中应考虑的因素是皮肤所处的自然环境。通常情况下，皮肤表面温度低于内部区域，这可能会影响渗透条件。
为了将实验室实验与计算机模拟相结合，本文提出了一种可用于优化模拟参数的方法。对于分子尺寸较小的物质，模拟结果与实验数据吻合良好。然而，对于分子尺寸较大的物质，模拟结果与实验数据之间出现了偏差。大分子多糖可能增加摩擦力，从而减缓凝胶中的扩散过程。这种效应会导致反常扩散，可能是实验值与模拟值之间产生偏差的原因之一33,34。另一种可能的解释是荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（fluorescein-isothiocyanate-dextran）中存在较小或较大的颗粒。制造商提供的该物质分子量为给定范围内的平均值，这意味着其中可能包含不同大小的颗粒。目前尚不清楚这些颗粒的分布情况，因为较小的颗粒在凝胶和流体通道中的渗透速度更快。未来可对模拟进行扩展，以考虑这些扩散和摩擦效应。
该通透性实验及模拟方法是为在双器官芯片（2-OC）中应用而开发的。借助该模拟，此实验方法可直接推广至更复杂的实验装置。例如，膜插件系统的模拟可轻松适配双器官芯片（2-OC）的几何结构，或其他具有类似配置的系统。这种对模拟进行调节的选项可用于支持未来实验的设计。此外，还可将蒸发、异常扩散和膜效应等副作用纳入模拟，以提升模拟的准确性。该模拟程序允许修改或优化模拟方程，并可集成其他物理模块，以探究皮肤模型构建的其他方面。一个实例是在胶原细胞模型中模拟葡萄糖消耗和乳酸生成过程。
在医学物质测试中，一个特别值得关注的方面是物质在器官芯片系统中的分布情况。该模拟方法与渗透参数有助于回答诸如物质进入系统的速度有多快，以及在多器官芯片中其他组织可获得的浓度是多少等问题。该方法可支持并促进此类器官芯片系统的开发与测试。
披露
Uwe Marx 是 TissUse GmbH 公司的首席执行官及股东，Gerd Lindner 是该公司股东。该公司负责制造和商业化 MOC 技术。其他作者声明，对本文的发表不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）项目编号 PO413/12-1 和 LA 1028/7-1 的资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Carl Roth | K297.2 | 高分辨率粉末 |
| 胶原蛋白 | Serva | 47256.01 | 0.4% 胶原蛋白 R 溶液 |
| DMEM | Lonza (Biozym Scientific GmbH) | 880010-12 | 高糖含 L-谷氨酰胺 |
| FCS | Biochrom GmbH | S0615 0114F | 胎牛血清 |
| 荧光素钠盐 | Sigma-Aldrich | 46960-25G-F | |
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | 46944-500MG | 4000 g/mol |
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | FD10S-250MG | 10 000 g/mol |
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | FD20S-250MG | 20 000 g/mol |
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | FD40S-250MG | 40 000 g/mol |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170120 | 无钙、无镁，含酚红 |
| NaOH | Merck | 1.06467.9010 | 颗粒状 |
| PBS | Gibco | 18912-014 | 片剂 |
| Transwell 细胞培养小室 | Corning | 3391 | 96 孔，0.4 µm 孔径 |
| Transwell 细胞培养小室 | Corning (VWR) | 734-1563 | 12 孔，0.4 µm 孔径 |
| 胰蛋白酶 | Biochrom GmbH | L2143 | 含 EDTA |
参考文献
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