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鼻腔与支气管液体的吸收：人体呼吸道黏膜的精确采样及样本实验室处理

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DOI：

10.3791/56413

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2018年1月21日

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1National Heart and Lung Institute, Faculty of Medicine, Imperial College London, St Mary's Hospital, 2St Mary's Hospital, Imperial College Healthcare Trust

本文内容

摘要

本文描述了鼻腔和支气管吸收技术的应用，特别是使用合成吸收基质（SAM）来采集上、下呼吸道的黏膜衬液（MLF）。这些方法相较于现有的呼吸道采样技术具有更高的标准化程度和耐受性。

摘要

鼻腔吸收（NA）和支气管吸收（BA）方法采用合成吸收基质（SAM）来吸收人体呼吸道黏膜衬液（MLF）。NA 是一种非侵入性技术，可从下鼻甲吸收液体，几乎无不适感。NA 已获得可重复的结果，并能够频繁重复采样上呼吸道。

相比之下，采集呼吸道黏膜样本的其他方法（如鼻咽抽吸法（NPA）和传统拭子采样）更具侵入性，可能导致数据变异性更大。其他方法也存在局限性，例如，活检和支气管镜检查具有侵入性，痰液含有大量死亡或濒死细胞且需要液化处理，呼出气冷凝物（EBC）含有水分和唾液，而灌洗样本则较为稀释且成分不稳定。

在临床中，支气管镜检查可通过支气管镜的工作通道进行支气管灌洗（BA）。该取样方法耐受性良好，可在气道内的多个部位进行。BA获得的微量液体样本（MLF）比支气管肺泡灌洗（BAL）样本的稀释程度更低。

本文展示了鼻吸收（NA）和支气管吸收（BA）技术，以及所获得样本的实验室处理方法，这些方法可根据拟进行检测的下游生物标志物进行相应调整。这些吸收技术是临床呼吸系统研究中常规采样技术的有效替代方法。

引言

大多数呼吸系统疾病都会引发炎症反应，在变应性鼻炎、病毒和真菌感染、结核病、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化及肺癌等疾病中，迫切需要采集呼吸道黏膜表面样本1。鼻咽抽吸液（NPA）、鼻腔灌洗和支气管肺泡灌洗（BAL）是采集上、下呼吸道样本的常用技术。然而，这些方法存在诸多问题，包括耐受性差、炎症介质被稀释，以及难以频繁重复采样2。NPA采样的一个替代方法是使用拭子，如尼龙植绒拭子、棉质拭子或人造丝拭子3,4，但这些方法也存在局限性，因其可能引起不适并损伤鼻上皮，某些情况下还会导致炎症介质发生不可逆结合5。这些技术通常无法在一小时内连续重复操作，而在检测低丰度细胞因子和趋化因子方面，其他替代技术可能更为有效5,6。此外，这些技术的操作者间差异可能导致数据不一致，从而需要更大的患者队列来满足研究需求。

此外，已有研究采用天然和合成海绵的吸附技术从黏膜表面收集黏膜液（MLF）。由天然纤维素制成的眼科海绵（例如，Weck-cel）已被用于采集唾液、宫颈和阴道分泌物7。此外，还使用了由聚乙烯醇（PVA）和羟基化聚乙酸乙烯酯（HPVA）制成的合成海绵8。在检测抗体前取样口腔液体时，曾比较过七种不同的吸附材料9，而聚氨酯微型海绵则被用于采集人泪液10。

自1992年Alam及其同事的开创性研究以来，由棉花植物天然纤维素制成的滤纸已广泛用于吸收鼻腔分泌物11,12,13,14,15,16,17。滤纸圆片由滤纸卡（例如 Shandon）制备，已被用于在受控鼻腔变应原激发及自然变应原暴露后测定组胺和细胞因子18,19,20,21。然而，不同批次的滤纸在蛋白质结合能力方面存在差异，部分滤纸无法有效释放细胞因子。因此，已开发出使用合成吸收基质（SAM）的方法2,22,23。目前，SAM已普遍用于通过鼻腔吸收法（NA）获取鼻腔黏膜液（MLF）。这类吸收材料使用舒适，即使在长时间内频繁采集，也能从炎症状态的鼻腔中有效获取MLF。

鼻腔吸收是一种利用SAM从上呼吸道采集黏膜淋巴基质液（MLF）的精准黏膜采样方法。NA采样装置采用医疗级材料在洁净室中生产，符合CE认证医疗器械标准，无尘且不含过敏原。NA采样器由手柄和置于无菌冻存管中的SAM组成。SAM由聚合物构成，通常为纤维形式，也可为泡沫形式，其材质选择柔软且具有高吸附性，并具备快速毛细渗透能力以利于样本采集。SAM的蛋白质结合能力极低，可实现吸附分泌物的高效洗脱。NA是一种极为温和、无创的技术，适用于所有年龄段的供体。此外，可进行连续多次采样，甚至每隔数分钟采样一次。NA已通过与现有上呼吸道采样技术的对比验证5，重复采样已被用于在气道接触过敏原23,24,25、细菌内毒素26以及病毒型TLR激动剂（Jha, A. et al.， manuscript in preparation）后获取动力学数据。NA还已被用于婴儿群体，以研究特应性疾病的自然病程27,28,29以及病毒性细支气管炎30。

支气管镜下微采样（BMS）是一种由 Olympus 开发的用于采集下呼吸道黏膜衬液（MLF）的技术31,32,33。然而，该 BMS 系统目前仅在日本获得许可。Olympus 提供两种 BMS 系统：一种配备纤维状羟基化聚酯（FHPE）探针34,35,36,37，另一种配备棉质探针33,38,39,40,41,42,43。该技术面临的主要障碍是，在哮喘患者中使用 BMS 探针时会引起黏膜接触性出血，导致半数样本被血液污染。研究者得出结论：使用该 BMS 系统从哮喘患者的外周气道采集 MLF 是不可行的43。

作为一种替代方法，我们开发了使用软性采样贴片（SAM）的支气管采样（BA）技术，可在支气管镜检查下呼吸道时进行，包括在哮喘患者经鼻病毒实验性感染后的检测6。BA装置包括：外部中空导管、可在激活时推出SAM的手持部件，以及末端带有SAM的中央塑料导丝。与鼻采样（NA）类似，BA试剂盒采用医用级材料在洁净室中制造，无尘且不含过敏原。此外，该装置已通过CE认证，并经伽马射线辐照灭菌。SAM条柔软、具有强吸收性，能快速毛细吸收以采集样本，同时具有极低的蛋白质结合特性，有利于吸收分泌物的高效洗脱。该装置可穿过支气管镜的工作通道，能够快速、准确地从气道内特定感兴趣部位采集黏膜表面液体（MLF）。与支气管肺泡灌洗（BAL）或支气管黏膜刮取（BMS）不同，BA操作不会导致接触性出血或术后患者额外不适。

在处理鼻咽拭子（NA）和支气管肺泡灌洗液（BA）样本时应仔细考虑。样本可直接冷冻后批量处理，也可立即进行处理。处理方式可根据特定的下游应用进行调整，包括用于检测细胞因子、趋化因子和免疫球蛋白的免疫测定，或病毒、细菌及宿主细胞相关RNA的洗脱。本文介绍了与NA和BA相关的临床采集及实验室处理技术，为临床研究人员提供参考指南。

方案

以下方案中使用的技术已获得伦敦西部研究伦理委员会的批准（参考编号 15/lO/0444）。

1. 鼻腔吸收（NA）

  1. 采样前准备
    1. 进行鼻黏膜采样（NA）时，应先洗手并戴上手套，最好在患者面前完成此操作。
    2. 使用头戴式照明灯检查鼻腔，并让临床医生用非优势手的拇指轻轻牵拉患者的鼻部，以充分暴露鼻腔结构。
      注意：通常不需要使用鼻窥器。
    3. 采样前应清晰观察鼻腔及下鼻甲的解剖结构。
      注意：鼻孔（鼻前庭）的横截面并非圆形，且走向为向后直行。一般可见下鼻甲为鼻腔外侧壁上的隆起或凹陷结构，而鼻中隔则构成光滑平坦的内侧壁。采样部位应选择下鼻甲区域，因其下方的上皮为呼吸道的单层纤毛柱状上皮44。
  2. 鼻黏膜采样（NA）操作
    1. 采样时，将鼻黏膜采样器（NA SAM）轻柔地沿鼻孔腔道向上推进，并调整其方向，使其紧贴下鼻甲表面。
    2. 请受试者用食指将采样器压紧于鼻黏膜表面。由于黏膜淋巴液（MLF）被吸收，可能会引起轻微的痒感，甚至出现流泪现象。
      注意：在成人中，通常采样时间为60秒。
    3. 吸收MLF后，将NA采样装置从鼻孔中取出，并放回原试管中。
    4. 应立即在实验室处理样本，或按本方案后续说明进行冷冻保存。
      注意：目前NA技术已被应用于多种鼻黏膜激发模型研究，以及不同呼吸道疾病的研究中。然而，针对每项研究和特定患者人群，均应与其他呼吸道采样方法进行对比验证。

2. 支气管吸收（BA）

  1. 支气管活检采样前的准备
    注意：支气管活检（BA）应由专业人员在支气管镜检查室中进行。
    1. 在将BA装置插入导管之前，检查SAM是否能够从导管中伸出并顺利回缩至导管内。
    2. 在患者身上进行BA操作前，应先在支气管镜模拟器上进行一次模拟BA操作。
  2. 支气管活检采样
    1. 将支气管镜经气管插入右主支气管，到达中间支气管水平，位置在右下叶与右中叶分支的近端。
      注：我们通常从中间支气管取样，但也可选择气道内的其他部位。观察导管和SAM时，无法看到支气管镜的尖端。当支气管镜到达目标采样位置后，我们遵循以下简单的BA操作步骤。
    2. 导管下送（CATHETER DOWN）：将BA导管经支气管镜的操作通道插入，直至白色尖端刚好可见于气道内，最多不超过支气管镜末端远端1 cm。保持支气管镜和导管尖端位于气道管腔中央。操作时需小心，尽量减少导管尖端与支气管黏膜的接触，以降低黏膜擦伤的风险。
    3. SAM伸出（SAM OUT）：按压BA装置的手柄，使SAM伸出并进入右中叶或右下叶气道的管腔内。在直视下，弯曲支气管镜尖端，确保SAM与气道壁上的黏膜下层（MLF）接触。使SAM平贴于黏膜壁，保持30秒。
    4. SAM回缩（SAM IN）：通过支气管镜观察，确认湿润的SAM探针呈直线状，未反折至导管末端。如有需要，可将导管和支气管镜尖端回撤以拉直SAM。在直视下，轻柔地将伸直的SAM重新收回导管内。
      注：若SAM难以回缩至导管内，可将整个装置在SAM伸出状态下从气道中撤出。
    5. 导管上提（CATHETER UP）：将整个导管从支气管镜的操作通道中撤出。
    6. 切断SAM（CUT OFF SAM）：使用无菌剪刀将SAM剪下，并立即放入冰上的冻存管中。这些样本可采用多种方法进行后续处理，具体方法详见本实验方案的后续部分。

3. NA 和 BA 样本的处理

注意：针对核酸扩增（NA）和碱裂解法（BA）产生的样本，实验室处理方法有多种选择。这些方案旨在将样本储存以备后续使用，并从样本采集模块（SAM）中洗脱出磁珠裂解液（MLF）样本。

  1. NA 和 BA 样本的即时处理方案
    1. 方案 1：将湿润的 SAM 置于冰上数小时，随后进行进一步处理。
    2. 方案 2：将 NA SAM 立即在采集管中进行深冻保存。类似地，使用剪刀将 BA SAM 从采样装置上取下后，立即放入冻存管中冷冻。
    3. 方案 3：将分离的 SAM 置于洗脱缓冲液（300 µL）中，随后直接处理或进行深冻保存。
  2. NA 和 BA 样本的洗脱缓冲液选择
    注意：洗脱缓冲液的选择取决于 MLF 样本中拟分析的目标物质，我们建议以下四种主要替代方案：
    1. 使用预先配制的、适用于免疫分析程序的分析缓冲液。此类缓冲液应含有少量去污剂（0.05%）以及蛋白质，例如，1% 的牛血清白蛋白（BSA）。
    2. 或者，使用含有较高浓度去污剂的缓冲液，以实现细胞裂解。
      注意：我们使用的缓冲液含有 1% 浓度的 Triton-X 或 NP40。细胞裂解缓冲液可从 SAM 中洗脱出细胞内外的细胞因子，通常可获得更高水平的细胞因子和趋化因子。此类缓冲液也应含有蛋白质，并以 1% BSA 配制。
    3. 对于 RNA 检测，如病毒 RNA 的定量 PCR 或宿主 RNA 的检测，可将 RNA 提取缓冲液直接加入湿润的 SAM 中。
      注意：变性 RNA 提取缓冲液含有可使蛋白质变性的胍盐。另一种方法是将 RNA 提取缓冲液加入含有免疫分析缓冲液或细胞裂解缓冲液的 MLF 液体中。
    4. 使用有机溶剂（如三氟乙酸）提取脂质和代谢物，用于质谱分析。
      注意：所有这些试剂的详细信息均包含在材料部分。
  3. 洗脱技术
    1. 对于上述任一洗脱技术，将 SAM 插入含有所需提取缓冲液的 2 mL 微离心管中。
    2. 将样本涡旋混合 30 秒，以冲洗 SAM 上松散附着的液体和生物分子。
    3. 为确保样本完全回收，将湿润的 SAM 加入插入同一 2 mL 微离心管（用于洗涤）的离心过滤小柱中，进行离心洗脱。
      注意：可使用两种类型的离心过滤小柱。第一种仅含塑料网筛，可固定 SAM 位置，实现液体的完全洗脱。或者，在处理传染性材料时，可使用孔径为 0.22 µm 的离心过滤器。此类过滤器可对样本进行灭菌，适用于疑似分枝杆菌感染的样本。然而，此类过滤器应预先用缓冲液孵育，以尽量减少介质通过非特异性相互作用与过滤器结合。
    4. 使用灭菌镊子将湿润的 SAM 转移至离心过滤器中。在不同样本之间更换镊子，以防止污染。
    5. 在 4 °C 冷却的微型离心机中，以 16,000 x g 离心 20 分钟。
  4. 示例性总结方案
    1. 在实验室中，为 2 mL 微离心管标记样本编号，并加入所需体积的洗脱缓冲液（通常 NA 为 300 µL，BA 为 100 µL）。密封管盖并置于冰上。
    2. 采样后（立即或在实验室中），使用镊子将 SAM 从手柄上取下，并放入含有缓冲液的收集管（前一步骤制备）中。确保微离心管管盖紧密闭合，并将样本置于冰上转移至实验室进行进一步处理。
    3. 从转运容器中取出含有 SAM 和洗脱缓冲液的试管，涡旋混合 30 秒。
    4. 使用无菌镊子取出 SAM 并放入离心柱中（可含或不含 0.22 µm 醋酸纤维素滤膜）。
    5. 收集收集管中的洗脱缓冲液并保留。
    6. 将含有 SAM 的离心柱放入原始收集管中（若需无菌过滤样本则使用新管），并向离心柱中加入收集缓冲液。通过此方式，洗涤液将穿过离心柱回流至收集管，有助于从 SAM 中洗脱样本。
    7. 密封管盖后离心样本（16,000 x g，20 分钟，4 °C）。
    8. 将样本从离心机中取出并放入试管架中。
    9. 打开密封管盖，取出含有 SAM 的离心柱。将 SAM 和离心柱丢弃至适当的废弃物容器中。
    10. 小心地将管内洗脱液分装至标记好的冻存管中。记录洗脱液总体积及每份分装的体积。
    11. 将密封的冻存管转移至 -80°C 冰箱中，直立保存直至使用。

结果

NA 已在多项研究中被用于简便且无创地测量黏膜炎症。在向鼻腔给予过敏原后，可在数分钟内观察到前列腺素 D2（PGD2）水平的升高和下降。图1），符合肥大细胞脱颗粒（Thwaites 等，正在准备中的手稿）。此外，II型炎症的介质，如IL-5（图2，经许可转载自 24），可在鼻腔变应原激发后的数小时内进行测定23,24在对过敏性哮喘患者和健康对照者进行的实验性感染研究中，采用NA方法检测了一组介质，包括干扰素-γ（IFN-γ），持续监测7天（图3，经许可转载自 6）。此外，在婴幼儿自然呼吸道合胞病毒（RSV）感染中，NA 研究表明，与患支气管炎但无 RSV 感染的婴幼儿及健康对照组相比，RSV 感染与炎症性细胞因子（如 IFN-γ）水平升高相关。图 4，经许可转载自 30）。有趣的是，在时间匹配的鼻咽抽吸物样本中，RSV 与非 RSV 毛细支气管炎之间的这种区分并不显著（图 4).

在对过敏性哮喘患者进行鼻病毒实验性感染期间，也使用了BA。在鼻病毒感染后的第4天，IFN-γ、CXCL11、IL-10和IL-5的水平较基线升高（图5；分别为A、B、C和D）。此外，该技术显示，在鼻病毒感染期间，过敏性哮喘患者下呼吸道中的IL-5水平较健康对照组升高（图5D）（图5经6许可重印）。

这些代表性结果来自使用含有 0.05% Tween-20 和 1% BSA 的检测缓冲液洗脱的样本（参见 材料表).

PGD2 浓度随时间变化的曲线图；激素分泌峰值的数据分析；实验结果。
图 1：鼻腔过敏原激发后前列腺素-D2 的快速生成与清除。 在鼻腔过敏原激发（使用梯牧草花粉，n=5）后，通过连续采集鼻腔吸收液样本测得的前列腺素-D2（PGD2）水平。每条曲线代表一名个体的数据。请点击此处查看该图的放大版本。

NAC后IL-5水平随时间变化；浓度-时间曲线；细胞因子分析；显示误差线。
图 2：鼻腔变应原激发后IL-5的动态变化测定。 鼻腔变应原激发后连续采集的鼻腔吸收液样本中IL-5的生成情况。共进行了三次重复的变应原激发研究，参与者（n=19）在变应原给予前1小时分别接受安慰剂（蓝色）、低剂量（10 mg）口服泼尼松（橙色）或高剂量（25 mg）口服泼尼松（红色）。曲线表示几何平均值，误差线表示所有参与者的95%置信区间。（图示经Leaker et al., Mucosal Immunology, 2017许可转载）。请点击此处查看该图的放大版本。

IFN-γ 表达结果；显示细胞因子水平随时间变化的图表；实验数据分析。
图 3：鼻病毒攻击期间干扰素-γ的诱导。 在对健康成人（n = 11，蓝色）和过敏性哮喘患者（n = 28，红色）进行鼻病毒-16感染攻击期间，采用鼻腔吸收采样法检测干扰素-γ（IFN-γ）的水平。数据以 A）个体原始的线状图（spaghetti plots）和 B）中位数水平（误差线表示四分位间距）表示。（图改编自 Hansel et al.6，经许可重印）。请点击此处查看此图的放大版本。

IFN-γ 浓度柱状图；RSV 研究；鼻吸收法 vs. 鼻咽抽吸法；统计分析。
图 4：鼻吸收法可区分与婴幼儿呼吸道合胞病毒（RSV）感染相关的干扰素-γ 升高水平。 采用鼻腔吸收法和鼻咽抽吸法（NPA）检测患有与呼吸道合胞病毒（RSV）感染相关细支气管炎的婴幼儿（红色，n=12）、非 RSV 呼吸道病原体感染者（绿色，n=12）以及健康对照组（蓝色，n=9）的干扰素-γ 水平。数据采用Kruskall-Wallis检验进行分析，并对多重比较进行Dunns校正（***p<0.001）。线条表示中位数，误差线表示四分位距。（经Thwaites et al.30许可修改。）请点击此处查看该图的放大版本。

比较基线期和感染阶段 IFN-γ、CXCL11、IL-10、IL-5 的细胞因子反应图
图 5：鼻病毒 感染期间支气管吸收样本中的炎性介质。
在健康对照者（n=10，蓝色）和过敏性哮喘志愿者（n=23，红色）感染鼻病毒-16 后，采用支气管吸收法检测 A) IFN-γ、B) CXCL11、C) IL-10 和 D) IL-5 在基线期及感染第 4 天的水平。数据采用 Wilcoxon 符号秩检验（配对样本）和 Mann-Whitney 检验（非配对样本）进行分析。图示经 Hansel et al.6 许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

现有气道采样技术的结果被认为具有高度变异性；该领域内的研究亟需替代性采样技术以实现标准化5。鼻腔采样（NA）和支气管采样（BA）能够以非侵入性方式采集黏膜衬液（MLF），在检测健康与病变气道中的免疫应答方面具有广阔前景。相较于现有技术，这些方法具备多项潜在优势，包括更高的耐受性、更快的采样速度、可频繁重复采样、操作者间变异更小，以及免疫介质的稀释程度更低5。吸收持续时间及所用处理方法应针对每项研究进行优化，并在各次采样过程中严格保持一致。此外，对于支气管采样（BA），应在不同个体间精确复制气道内的采样部位。

鼻吸（NA）尤其是支气管吸出（BA）仍是临床研究中相对较新的技术。然而，这些技术的优势已使其被广泛应用于多项研究中，包括与其他替代技术进行严谨的验证对比5。目前这些设备已获得CE认证，可广泛用于呼吸系统研究。尽管NA和BA所获得的样本体积远小于其他采样技术，但其较高的目标物浓度可能使低丰度免疫介质的检测灵敏度更高。

根据预期的下游应用，NA 和 BA 样本可直接冷冻以备后续处理，从而提高临床研究环境中的研究可行性。样本处理方案也可根据特定的下游应用进行调整。建议的处理技术可用于收集蛋白质或脂质免疫介质以及核酸，但应针对每项研究进行优化。特别是，MLF 可使用不同的缓冲液进行洗脱。首先，可使用免疫测定缓冲液来检测黏膜细胞因子、趋化因子和抗体6,45。也可使用去污剂浓度较高的缓冲液，以确保发生细胞裂解，从而检测细胞内细胞因子。对于病毒性感染、病毒载量、宿主 mRNA 和微生物组的检测，应使用变性剂类 RNA 提取缓冲液。此外，脂质组学和质谱分析可使用有机溶剂。

综上所述，从黏膜表面直接吸收 MLF 是一种具有潜力的技术，可用于呼吸系统、胃肠道、泌尿生殖系统及其他黏膜相关疾病的检测。然而，这些颇具前景的吸收技术需要针对每种疾病环境中的具体检测项目（生物标志物）对采样与处理技术进行精确验证。此外，这些新型精准黏膜采样技术还需与传统样本（如血液、呼出气及痰液）进行对比验证。利用这些技术，MLF 可用于检测微生物、细胞因子、趋化因子、前列腺素类物质以及抗体。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

基金支持：本工作获得了帝国理工学院国家健康研究所（NIHR）生物医学研究中心（BRC）、帝国理工学院国家健康研究所健康保护研究单位（HPRU）呼吸系统感染项目（与英国公共卫生署 PHE 合作）以及帝国理工学院国家健康研究所患者安全转化研究中心的资助。文中表达的观点仅为作者观点，不一定代表英国国家医疗服务体系（NHS）、国家健康研究所、卫生部或英国公共卫生署的观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
鼻部吸附管（成人，7mm 宽度）Hunt DevelopmentsNSFL-FXI-11针对不同患者群体/年龄提供不同规格。
支气管吸附管Hunt DevelopmentsBSFL-FXI-11支气管镜最小通道直径为 2mm；最大工作长度为 815mm。
Corning Costar Spin-X 离心管滤器（无膜）Sigma AldrichCLS9301-1000EA
Corning Costar Spin-X 离心管滤器（0.22μm 膜）Sigma AldrichCLS8160-24EA用于具有感染风险样本的灭菌处理。
检测（洗脱）缓冲液MilliporeAB-33k未在 Millipore 官网列出，但可通过咨询或通用实验室耗材公司（如 Cedarlane）获取。含有 0.05% Tween-20 和 1% BSA。
NP-40 细胞裂解缓冲液Life TechnologiesFNN0021加入牛血清白蛋白至终浓度 1%（w/v）。可回收更高的绝对介质水平。
Buffer RLT（RNA 提取）Qiagen79216可用于从鼻部吸附和支气管吸附样本中提取 RNA。
三氟乙酸Sigma Aldrich302031-100ML-M用于需进行高效液相色谱（HPLC）分析样本的洗脱。
2.0 ml 微量离心管Costar3213Spin-X 管滤器需使用 2 ml 离心管，传统的 1.5 ml 管不适用。

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