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方法文章

利用亲和素-生物素系统通过非遗传性表面修饰在卡介苗（Mycobacterium bovis BCG）疫苗中表达外源性抗原

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DOI：

10.3791/56421

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2018年1月31日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

本文内容

摘要

介绍了一种在细菌表面快速展示抗原的新技术，该技术涉及表面生物素化，随后使目标蛋白与单体亲和素融合后与细菌结合。通过在卡介苗（BCG）表面加载选定的抗原，可有效增强其免疫原性，表明表面修饰有望替代传统的基因工程方法。

摘要

结核病（TB）是一种严重的传染病，目前唯一可用的疫苗——牛分枝杆菌卡介苗（M. bovis bacillus Calmette-Guérin, BCG）——在预防儿童重症结核性脑膜炎和某些类型的播散性结核病方面安全且有效，但无法预防肺结核，而肺结核是该病最常见的一种形式。当前改善卡介苗的有前景策略主要依赖于将编码免疫优势结核分枝杆菌（M. tuberculosis, Mtb）特异性抗原的基因导入卡介苗，和/或补充编码可激活抗原呈递细胞的辅助因子的基因。然而，这些方法的主要局限性包括转化效率低、稳定性差，以及表达载体安全性水平不确定。在本研究中，我们提出了一种改进疫苗的替代策略，即通过在细菌表面直接修饰外源目的蛋白来实现卡介苗的功能增强，而非使用编码相应基因的质粒进行遗传转化。首先，在标准的大肠杆菌（E. coli）表达系统中表达与单体亲和素融合的目的蛋白，然后将其用于修饰经生物素化处理的卡介苗表面。利用表面修饰了替代抗原卵清蛋白的卡介苗进行动物实验的结果表明，这种修饰后的细菌具有完全的免疫原性，并能够诱导特异性的T细胞免疫应答。综上所述，本文提供的数据有力支持了一种重塑现有卡介苗疫苗的全新且高效的方法，该方法取代了传统上依赖外源核酸补体化的繁琐技术路径。

引言

已提出多种策略以取代当前的结核病疫苗BCG，包括蛋白质佐剂系统、病毒载体技术、减毒活M.tb菌株以及基因改造的BCG菌株，其目的或是引入在感染期间表达不足的BCG抗原的过表达基因1，或是引入BCG中不存在的Mtb特异性抗原2。然而，基因工程面临诸多障碍，包括安全性水平不确定、操作过程耗时以及表达载体效率低下4,5。在改进BCG方面，亟需一种无需依赖不确定性基因改造即可增强免疫原性的替代方法。

本研究介绍了一种基于亲和素与生物素之间高亲和力相互作用的新型策略，用于在卡介苗（BCG）细胞表面展示目标重组蛋白。该方法可实现重组亲和素融合蛋白在生物素化BCG表面的快速、可重复性结合，从而便于对BCG进行广泛改造，以最大程度地提高其有效性，同时保持其数十年应用中所证实的良好安全性记录。

Avidin 对生物素的亲和力极高（Kd = 10−15 M），一旦形成，生物素-亲和素复合物非常稳定，只能在变性条件下被破坏6然而，若要将此类相互作用作为基因转移方法的替代方案，需要实现重组蛋白的长期但可逆的展示。因此，本文引入了一种低亲和力的单体亲和素（Kd = 10−7 M），从而在抗原呈递细胞内吞后实现蛋白质从表面修饰的卡介苗（BCG）上可逆释放。为验证该概念，我们采用一种单体亲和素嵌合蛋白进行了方法测试，该蛋白对应于源自卵清蛋白（OVA）的替代抗原。7,8结果显示，BCG 细胞表面可快速、简便地修饰单体亲和素融合蛋白，且该结合在细菌生长和存活未见明显改变的情况下，仍具有稳定性和可重复性。此外，我们发现，用单体亲和素与卵清蛋白融合蛋白（AviOVA）修饰的 BCG 所诱导的免疫反应，与通过基因表达相同抗原的 BCG 所诱导的免疫反应相似 体外 和 体内因此，这种可逆地在细菌表面展示目标蛋白的技术可有效替代传统的基因转移方法，并为卡介苗（BCG）的广泛改造及其在疫苗开发中的进一步应用提供了一个平台。

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方案

所有动物的饲养均遵循不列颠哥伦比亚大学动物护理与使用委员会批准的方案。实验经动物护理与使用委员会批准，并按照加拿大动物护理委员会指南进行。动物福利保证编号为 A11-0247。

1. 单体亲和素融合蛋白表达质粒的构建

  1. 亚克隆单体亲和素序列12 pDEST17 质粒的 "循环肿瘤细胞" 和 "GAA" 对应于133-134bp的位点。即，位于6-His标签与pDEST17之间 Attr1 重组位点）以获得 p17-Avi。
    注意：以下显示的是单体亲和素的DNA序列。为获得单体亲和素，在野生型亲和素中引入的三个突变以加粗字符标出。
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. 设计两端带有侧翼的引物 AttB1 和 Att对应于OVA多肽的B2位点757-1035 (I-Ab- 和 H-2Kb-受限制的表位）DNA序列。引物序列如下： Attb1-OVA
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT 和 Attb2-OVA
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGCAttb1 和 Attb2 序列以粗体显示。
    1. PCR扩增OVA多肽757-1035 使用pUC57-OVA质粒作为模板，以上述引物进行DNA测序。
    2. 将PCR产物通过位点特异性克隆至pDONR-221中 体外 重组反应（例如，BP Clonase）以获得 pDONR-OVA。
  3. 将目的基因通过LR Clonase反应转入p17-Avi载体，获得p17-Avi-OVA。
    注意：有关BP和LR重组克隆的详细信息，请参见生产商手册。

2. 单体亲和素融合蛋白的表达、纯化与复性

  1. 将p17-Avi-OVA质粒转化至 E. coli BL21 并诱导 250 mL 的 E. coli BL21 培养物在 37 °C 下用 IPTG（0.1 M）诱导 3 小时。
  2. 细菌裂解与包涵体溶解
    1. 将250 mL诱导表达的BL21菌液在4 °C、4,000 × g条件下离心30 min，收集菌体。
    2. 将沉淀重悬于10 mL裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，6 M Guanidine-HCl，pH 1.5–2.5）中，95 °C孵育15分钟。随后在旋转摇床上室温孵育过夜。
    3. 在 15,000 × g 和 4 °C 条件下离心 30 分钟，收集上清液。
  3. 使用 Ni-NTA 柱从上清液（溶解的包涵体组分）中纯化 Avi-OVA。
    1. 用裂解缓冲液将包涵体按1:2比例稀释。
    2. 每250 mL培养物来源的包涵体使用4 mL Ni-NTA树脂。
    3. 用10 mL裂解缓冲液（pH 7.0）洗涤3次。
    4. 用10 mL洗脱缓冲液（含250 mM咪唑的裂解缓冲液，pH 7.0）进行洗脱。
  4. 通过逐步稀释（1:10）并在含有1 mM DTT、200 mM NDSB256（3-(苄基二甲基铵)丙磺酸盐）、0.5 mM Tween 80、500 mM 精氨酸和200 mM NaCl的Tris缓冲液（pH 7.5）中快速涡旋，于室温下复性30分钟。
  5. 使用蛋白浓缩装置，按照生产商说明书将复性后的蛋白从Tris缓冲液脱盐并置换至PBS缓冲液中。
  6. 通过离心去除聚集体，3,500 × g 离心 30 分钟 x g 并在4°C下保存，将可溶性蛋白分装后于-20°C储存。

3. BCG 细胞表面生物素标记

  1. 在含有10% OADC（油酸、白蛋白和葡萄糖溶液）和0.05% Tween 80的Middlebrook 7H9液体培养基中，于37 °C、50 rpm振荡培养箱中培养BCG，直至OD值达到0.5–1。
    注意：BCG属于生物安全二级病原体，所有涉及BCG的实验均应在生物安全柜内进行，并佩戴适当的个人防护装备。
  2. 用500 µL冰浴的无内毒素PBS（pH 8.0）加0.1% Tween80（PBST）洗涤109个BCG细胞3次。将BCG菌体沉淀重悬于无菌、无内毒素的PBS中。
  3. 使用前立即配制1 mL 10 mM Sulfo-NHS SS生物素溶于无菌过滤水中。
    1. 将细菌与1 mL 0.5 mM Sulfo-NHS SS生物素在室温下孵育30分钟。
  4. 用500 µL冰浴的PBST洗涤标记后的细菌3次，以去除未反应的生物素化试剂。
    1. 将菌体沉淀重悬于1 mL PBST中。
  5. 为评估生物素化效率，取108个生物素化的BCG，加入链霉亲和素-FITC（1:100，25 µL），室温避光染色20分钟。
    1. 将染色后的细菌在1 mL 2%多聚甲醛（PFA）中室温固定20分钟，随后通过流式细胞术分析生物素化水平。

4. 生物素标记分枝杆菌的表型：生长与存活

  1. 在含有10% OADC（油酸、白蛋白和葡萄糖溶液）和0.05% Tween 80的Middlebrook 7H9液体培养基中，于37 °C、50 rpm振荡培养BCG菌株。
    1. 记录细菌培养物在8天内的光密度（OD600）。
  2. 使用BCG-Luc（先前已有描述9）检测细菌在巨噬细胞中的存活情况。
    1. 用生物素标记的BCG-Luc（感染复数MOI 10:1）或未处理的BCG-Luc（对照）感染RAW264.7细胞，并在37 °C孵育48小时。
    2. 洗涤细胞单层，然后用0.025% SDS裂解以释放被吞噬的细菌。
    3. 使用荧光素酶检测试剂盒和发光仪测定生物发光信号。
      注意：发光信号反映细菌的活力。有关荧光素酶检测的详细步骤，请参阅试剂盒制造商的操作手册。

5. 单体亲和素融合蛋白与生物素化BCG表面的结合

  1. 在摇床平台上，将 5 × 108 个生物素标记的 BCG 与 Avi-蛋白（在 PBS-T 中终浓度为 10 μg/mL）于室温下混合孵育 1 小时。
  2. 用 500 µL 冰冷的 PBST 洗涤细菌 3 次，然后在室温下用兔抗亲和素抗体（Ab）（1:100 稀释，先前已描述10）孵育 20 分钟，随后在相同条件下用 FITC 标记的羊抗兔 IgG 抗体孵育。
  3. 用 500 µL PBST 洗涤细菌 3 次，通过流式细胞术分析以评估表面修饰程度。

6. 分枝杆菌的冻干

  1. 根据步骤 3.1–3.4 对细菌进行生物素标记，并根据步骤 5.1 用 Avi-OVA 包被生物素标记的细菌。
  2. 取等份生物素标记并包被的细菌（108），用 PBS 洗涤后重悬于 0.5 mL 冻干保护液中（25% Sauton 培养基，75% H2O 和 1.5% Na-谷氨酸）。
  3. 将细菌转移至玻璃小瓶中，在 -80 °C 冰箱中冷冻过夜。
  4. 使用冷冻干燥机对已填充并冷冻的玻璃小瓶进行 24 小时冻干。
  5. 将干燥样品在室温下保存，使用时用 PBS 重悬。
  6. 重复步骤 3.5 以评估生物素标记及表面包被的稳定性。

7. 吞噬作用检测

  1. 在含有5%胎牛血清（FCS）、1% L-谷氨酰胺、1% HEPES、1%非必需氨基酸以及1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中，将RAW 264.7巨噬细胞培养于直径10 cm的培养皿中，直至细胞融合度达到70–80%。
  2. 将2 × 106个RAW 264.7巨噬细胞接种至6孔板中，在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜，使细胞充分贴壁。
  3. 根据步骤3.1–3.4和5.1制备携带Avi-OVA的DsRed BCG（DsRed BCG-Avi-OVA）（方法先前已有描述9）。
  4. 以感染复数（MOI）20:1的条件，在37 °C下用DsRed BCG-Avi-OVA或未经处理的DsRed BCG感染RAW细胞，持续24小时。
  5. 用1 mL浓度为0.25%的胰蛋白酶在37 °C孵育10分钟，洗涤细胞三次并进行消化，以去除部分松散附着的细菌。
  6. 在室温下用PBS配制的2.5%多聚甲醛固定20分钟。
  7. 用PBS洗涤三次后，通过流式细胞术进行分析。

8. 巨噬细胞中OVA修饰的生物素化BCG的细胞内转运

  1. 荧光显微镜技术
    1. 接种 3 × 105 24孔板中盖玻片上的RAW 264.7巨噬细胞。于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜，使细胞贴壁。2.
    2. 在37 °C、5% CO₂条件下，用分枝杆菌（感染复数为10:1）在不含抗生素的维持培养基中感染巨噬细胞2 4 至 24 小时。
    3. 洗涤细胞并进行胰蛋白酶消化，以去除表面附着的未被吞噬的细菌，步骤同7.5。
    4. 在室温下用含2.5%多聚甲醛的PBS固定感染细胞20分钟，随后用PBS洗涤3次。
    5. 在室温下用封闭/通透缓冲液（PBS 中含 0.1% Triton X-100 和 3% BSA）孵育细胞 20 分钟以进行细胞通透处理。
      1. 使用感兴趣的特异性抗体（例如，兔抗avidin一抗）以10 μg/mL溶于通透缓冲液，室温孵育20分钟，随后加入二抗（例如，FITC-山羊抗兔IgG）孵育20分钟。
    6. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，再用水洗涤 1 次，然后将细胞置于载玻片上，加入 10 μL 水溶性封片剂封片，以尽量减少荧光淬灭。
    7. 使用配备63x/1.4 Plan-Apochromat物镜的落射荧光显微镜，通过数字共聚焦显微镜技术观察载玻片。利用与显微镜软件连接的数字相机采集图像。
  2. 免疫金染色与电子显微镜技术
    1. 接种 2 × 106 6 孔板中的 RAW 264.7 巨噬细胞
    2. 在室温下用4%多聚甲醛固定感染BCG的巨噬细胞4小时。
    3. 用 PBS 清洗样品两次。
    4. 将样品包埋于4%低熔点琼脂糖中，并用70%乙醇脱水。
    5. 将样品转移至丙烯酸树脂中，并在 50 °C 下聚合。
    6. 使用切片机切取60 nm的切片，并将切片收集于镍网上。
    7. 在孵育液（PBS 和 0.1% BSA）中，室温下加入 10 μg/mL 亲和素抗体标记样品 1 小时，或 4 °C 过夜，随后用孵育液洗涤，再加入胶体金标记的 F(ab')2 在孵育液中，室温下用超小型山羊抗兔IgG（1/20）孵育1小时。
    8. 用蒸馏水冲洗切片，用2%戊二醛染色，再次冲洗，风干后用电子显微镜观察。

9. 动物免疫与器官处理

注意：所有步骤均应在生物安全柜中进行。

  1. 将生物素化且包被蛋白的细菌通过271/2G针头10次，以制备单细胞悬液。
  2. 取1 × 106个细菌溶于100 μL无内毒素的PBS中，皮下注射至雌性C57BL/6小鼠（I-Ab，H-2Kb，5–6周龄）颈背部进行免疫。
    1. 对照组小鼠仅注射100 μL PBS。
  3. 免疫后第20天，通过CO2吸入法处死免疫小鼠，随后行颈椎脱位确认死亡。
    1. 取出脾脏并转移至RPMI培养基中。
  4. 用5 mL注射器活塞将脾脏组织研磨通过70 µm细胞筛网。
    1. 用5 mL RPMI洗涤。离心（800 × g，3分钟）以获得单细胞悬液。
    2. 使用小鼠生物素阳性选择试剂盒（含生物素标记的Ter119/红系细胞抗体）去除红细胞。
    3. 离心后将细胞重悬于10 mL完全RPMI培养基（含10% FCS、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素、1%链霉素和50 μM 2-ME）中。

10. 使用 I-Ab 四聚体染色法检测免疫动物中抗原特异性CD4+ T细胞频率及通过胞内细胞因子染色法检测抗原特异性T细胞释放细胞因子的频率

  1. 四聚体染色
    1. 用PE标记的I-Ab-OVA323-339四聚体（1/12.5稀释度）在37 °C下于结合缓冲液（含2% FCS和0.1% NaN3的PBS）中孵育对照组和免疫小鼠的脾细胞（约20 × 106个细胞）1小时。
    2. 加入AF647标记的CD4抗体（1:25）和7-AAD（用于检测死亡细胞），室温避光孵育20分钟。
    3. 通过流式细胞术分析样品。
    4. 在CD4阳性区域采集500,000个事件，以确定四聚体阳性事件的频率。
      注：总脾细胞通过SSC/FSC点图定义，活细胞通过排除7-AAD阳性事件确定，CD4亚群通过圈选AF647阳性事件获得。
  2. 抗原特异性胞内细胞因子释放T细胞频率检测
    1. 将约1 × 107个脾细胞转移至六孔板中，加入4 mL完全RPMI培养基，分别加入或不加入重组OVA蛋白（10 µg/mL），37 °C孵育16小时。
    2. 加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A，1:1,000）继续孵育5小时。
    3. 用PBS洗涤细胞，随后进行胞内细胞因子染色，步骤如下：
      1. 在室温下用PE-CD8或PE-Cy7-CD4抗体（1:50，溶于结合缓冲液）染色细胞样本30分钟。
      2. 用4%多聚甲醛（PFA）室温固定20分钟。
      3. 根据试剂说明书使用通透液对细胞进行通透处理。
      4. 洗涤细胞后，在室温下用AF647标记的IFN-γ抗体（1:50）孵育20分钟。
      5. 再次洗涤细胞，并按上述方法进行流式细胞术分析。

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结果

采用上述通用实验步骤，检测了BCG表面生物素化及偶联替代抗原OVA的可行性，随后评估了修饰后BCG的免疫原性。 体内细菌表面可轻松用生物素标记，从而快速展示亲和素嵌合抗原，且未检测到细菌表型发生任何改变。所获得的修饰型BCG可被抗原呈递细胞高效摄取，并能在小鼠中诱导产生OVA特异性免疫反应。

单体亲和素融合质粒及蛋白的制备
表达质粒p17-Avi经构建后可兼容Gateway技术，用于制备单体亲和素融合蛋白。将OVA克隆至p17-Avi中并进行表达 E. coli，然后纯化并复性 如上所述（图1).

生物素可高效结合至细菌表面，且不影响细菌的生长或存活

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讨论

本研究报道了一种非遗传学方法，可快速有效地将外源蛋白展示于卡介苗（BCG）表面，从而赋予该菌株特定抗原或特定功能特性，有望显著增强其免疫原性。我们证明，卡介苗细胞表面可轻松实现生物素化，进而实现与亲和素融合蛋白的即时表面修饰。整个操作过程可在2小时内完成，而遗传转化及阳性克隆筛选则需2至3个月的时间。表面修饰不影响细菌的生长与存活。携带替代抗原卵清蛋白（OVA）的修饰细菌能够将抗原递送至抗原呈递通路，并诱导特异性免疫应答。 体内 通过流式细胞术检测，包括MHC四聚体染色和细胞内细胞因子染色（ICS）进行评估。更重要的是， 体内 研究结果明确显示，表面修饰的细菌能够诱导与表达相似抗原的基因工程卡介苗（BCG）相当的免疫反应水平。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 R. Stokes 博士提供 BCG Pasteur 菌株，感谢 A. Talal 提供技术支持。我们还感谢 GenScript 在基因合成方面的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无内毒素 RPMI 1640StemCell Technologies 36750
磺基-NHS SS 生物素Thermo Fisher 21328
FITC 标记的链霉亲和素Sigma-AldrichS3762
藻红蛋白（PE）标记的 I-Ab-OVA323-339 四聚体 MBL International TS-M710-1
7-AADBD Pharmingen559925
TALON 聚组氨酸标签纯化树脂 Clontech635501
Alexa Fluor (AF) 647 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体BD Bioscience 557681
AF647 标记的大鼠抗小鼠 IFN-γ 抗体BD Bioscience 557735
AF647 标记的大鼠抗小鼠 I-A/I-E 抗体BD Bioscience 562367
PeCy7 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体BD Bioscience 552775
PE 标记的大鼠抗小鼠 CD8 抗体BD Bioscience 561095
AF 647 标记的大鼠抗小鼠 H-2kbBD Bioscience562832
FITC 标记的山羊抗兔抗体Thermo Fisher31635
AF 647 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体BD Bioscience 557681
超小金标山羊抗兔 IgGElectron Microscopy Sciences25100
Middlebrook 7H9 肉汤BD Diagnostic Systems271310
OADCBD Diagnostic SystemsB11886
吐温 80Sigma-AldrichP1379
RAW 264.7 小鼠巨噬细胞系美国模式培养物集存库
pDEST17 质粒 Invitrogen11803012
pUC57-OVA 质粒 GenScriptSD1176
BP Clonase Invitrogen11789020
LR Clonase Invitrogen11791043
pDONR221 质粒Invitrogen12536017
Ni-NTA 柱 Qiagen31014
Pierce 蛋白浓缩器 Thermo Fisher 88527
FlurosaveCalbiochem-Novabiochem345789
Axioplan II 正置荧光显微镜Carl Zeiss Inc
CCD 数码相机 Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV 透射电子显微镜 FEI CompanyG2 200Kv 
70μm Falcon 细胞筛 Thermo Fisher 87712
EasyStep 小鼠生物素阳性选择试剂盒 StemCell18556
生物素标记的 Ter119/红系细胞抗体BioLegend116203
布雷菲德菌素 ABD Pharmingen555029
Cytofix/Cytoperm 试剂盒 BD Pharmingen554714
Bright-Glo 荧光素酶检测试剂系统Promegae2620
Turner Biosystem 发光仪 PromegaTD-20/20
Leica EM UC6 超薄切片机 Leica MicrosystemsUC6
Novalyphe NL 500 冷冻干燥机Savant Instruments NL 50
Wheaton 硼硅酸盐玻璃小瓶Wheaton VWR 66011-675

参考文献

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