利用亲和素-生物素系统通过非遗传性表面修饰在卡介苗（Mycobacterium bovis BCG）疫苗中表达外源性抗原

摘要

介绍了一种在细菌表面快速展示抗原的新技术，该技术涉及表面生物素化，随后使目标蛋白与单体亲和素融合后与细菌结合。通过在卡介苗（BCG）表面加载选定的抗原，可有效增强其免疫原性，表明表面修饰有望替代传统的基因工程方法。

摘要

结核病（TB）是一种严重的传染病，目前唯一可用的疫苗——牛分枝杆菌卡介苗（M. bovis bacillus Calmette-Guérin, BCG）——在预防儿童重症结核性脑膜炎和某些类型的播散性结核病方面安全且有效，但无法预防肺结核，而肺结核是该病最常见的一种形式。当前改善卡介苗的有前景策略主要依赖于将编码免疫优势结核分枝杆菌（M. tuberculosis, Mtb）特异性抗原的基因导入卡介苗，和/或补充编码可激活抗原呈递细胞的辅助因子的基因。然而，这些方法的主要局限性包括转化效率低、稳定性差，以及表达载体安全性水平不确定。在本研究中，我们提出了一种改进疫苗的替代策略，即通过在细菌表面直接修饰外源目的蛋白来实现卡介苗的功能增强，而非使用编码相应基因的质粒进行遗传转化。首先，在标准的大肠杆菌（E. coli）表达系统中表达与单体亲和素融合的目的蛋白，然后将其用于修饰经生物素化处理的卡介苗表面。利用表面修饰了替代抗原卵清蛋白的卡介苗进行动物实验的结果表明，这种修饰后的细菌具有完全的免疫原性，并能够诱导特异性的T细胞免疫应答。综上所述，本文提供的数据有力支持了一种重塑现有卡介苗疫苗的全新且高效的方法，该方法取代了传统上依赖外源核酸补体化的繁琐技术路径。

引言

已提出多种策略以取代当前的结核病疫苗BCG，包括蛋白质佐剂系统、病毒载体技术、减毒活M.tb菌株以及基因改造的BCG菌株，其目的或是引入在感染期间表达不足的BCG抗原的过表达基因¹，或是引入BCG中不存在的Mtb特异性抗原²。然而，基因工程面临诸多障碍，包括安全性水平不确定、操作过程耗时以及表达载体效率低下^4,5。在改进BCG方面，亟需一种无需依赖不确定性基因改造即可增强免疫原性的替代方法。

本研究介绍了一种基于亲和素与生物素之间高亲和力相互作用的新型策略，用于在卡介苗（BCG）细胞表面展示目标重组蛋白。该方法可实现重组亲和素融合蛋白在生物素化BCG表面的快速、可重复性结合，从而便于对BCG进行广泛改造，以最大程度地提高其有效性，同时保持其数十年应用中所证实的良好安全性记录。

Avidin 对生物素的亲和力极高（K_d = 10⁻¹⁵ M），一旦形成，生物素-亲和素复合物非常稳定，只能在变性条件下被破坏⁶然而，若要将此类相互作用作为基因转移方法的替代方案，需要实现重组蛋白的长期但可逆的展....

方案

所有动物的饲养均遵循不列颠哥伦比亚大学动物护理与使用委员会批准的方案。实验经动物护理与使用委员会批准，并按照加拿大动物护理委员会指南进行。动物福利保证编号为 A11-0247。

1. 单体亲和素融合蛋白表达质粒的构建

1. 亚克隆单体亲和素序列¹² pDEST17 质粒的 "循环肿瘤细胞" 和 "GAA" 对应于133-134bp的位点。即，位于6-His标签与pDEST17之间 Attr1 重组位点）以获得 p17-Avi。
   注意：以下显示的是单体亲和素的DNA序列。为获得单体亲和素，在野生型亲和素中引入的三个突变以加粗字符标出。
   gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
   agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
   acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc ac....

结果

采用上述通用实验步骤，检测了BCG表面生物素化及偶联替代抗原OVA的可行性，随后评估了修饰后BCG的免疫原性。 体内细菌表面可轻松用生物素标记，从而快速展示亲和素嵌合抗原，且未检测到细菌表型发生任何改变。所获得的修饰型BCG可被抗原呈递细胞高效摄取，并能在小鼠中诱导产生OVA特异性免疫反应。

单体亲和素融合质粒及蛋白的制备
表达质粒p17-Avi经构建后可兼容Gateway技术，用于制备单体亲和素融合蛋白。将OVA克隆至p17-Avi中并进行表达 E. coli，然后纯化并复性 如上所述（图1).

生物素可高效结合至细菌表面，且不影响细菌的生长或存活

讨论

本研究报道了一种非遗传学方法，可快速有效地将外源蛋白展示于卡介苗（BCG）表面，从而赋予该菌株特定抗原或特定功能特性，有望显著增强其免疫原性。我们证明，卡介苗细胞表面可轻松实现生物素化，进而实现与亲和素融合蛋白的即时表面修饰。整个操作过程可在2小时内完成，而遗传转化及阳性克隆筛选则需2至3个月的时间。表面修饰不影响细菌的生长与存活。携带替代抗原卵清蛋白（OVA）的修饰细菌能够将抗原递送至抗原呈递通路，并诱导特异性免疫应答。 体内 通过流式细胞术检测，包括MHC四聚体染色和细胞内细胞因子染色（ICS）进行评估。更重要的是， 体内 研究结果明确显示，表面修饰的细菌能够诱导与表达相似抗原的基因工程卡介苗（BCG）相当的免疫反应水平。

亲和素-生物素相互作用是自然界中已知最强的非共价相互作用，其解离常数（K_d）为 10⁻¹⁵ M¹³。它不仅是生物研究中常用的有用工具¹⁴，而且最近也被证明可用于癌.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无内毒素 RPMI 1640	StemCell Technologies	36750
磺基-NHS SS 生物素	Thermo Fisher	21328
FITC 标记的链霉亲和素	Sigma-Aldrich	S3762
藻红蛋白（PE）标记的 I-Ab-OVA323-339 四聚体	MBL International	TS-M710-1
7-AAD	BD Pharmingen	559925
TALON 聚组氨酸标签纯化树脂	Clontech	635501
Alexa Fluor (AF) 647 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体	BD Bioscience	557681
AF647 标记的大鼠抗小鼠 IFN-γ 抗体	BD Bioscience	557735
AF647 标记的大鼠抗小鼠 I-A/I-E 抗体	BD Bioscience	562367
PeCy7 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体	BD Bioscience	552775
PE 标记的大鼠抗小鼠 CD8 抗体	BD Bioscience	561095
AF 647 标记的大鼠抗小鼠 H-2kb	BD Bioscience	562832
FITC 标记的山羊抗兔抗体	Thermo Fisher	31635
AF 647 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体	BD Bioscience	557681
超小金标山羊抗兔 IgG	Electron Microscopy Sciences	25100
Middlebrook 7H9 肉汤	BD Diagnostic Systems	271310
OADC	BD Diagnostic Systems	B11886
吐温 80	Sigma-Aldrich	P1379
RAW 264.7 小鼠巨噬细胞系	美国模式培养物集存库
pDEST17 质粒	Invitrogen	11803012
pUC57-OVA 质粒	GenScript	SD1176
BP Clonase	Invitrogen	11789020
LR Clonase	Invitrogen	11791043
pDONR221 质粒	Invitrogen	12536017
Ni-NTA 柱	Qiagen	31014
Pierce 蛋白浓缩器	Thermo Fisher	88527
Flurosave	Calbiochem-Novabiochem	345789
Axioplan II 正置荧光显微镜	Carl Zeiss Inc
CCD 数码相机	Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV 透射电子显微镜	FEI Company	G2 200Kv
70μm Falcon 细胞筛	Thermo Fisher	87712
EasyStep 小鼠生物素阳性选择试剂盒	StemCell	18556
生物素标记的 Ter119/红系细胞抗体	BioLegend	116203
布雷菲德菌素 A	BD Pharmingen	555029
Cytofix/Cytoperm 试剂盒	BD Pharmingen	554714
Bright-Glo 荧光素酶检测试剂系统	Promega	e2620
Turner Biosystem 发光仪	Promega	TD-20/20
Leica EM UC6 超薄切片机	Leica Microsystems	UC6
Novalyphe NL 500 冷冻干燥机	Savant Instruments	NL 50
Wheaton 硼硅酸盐玻璃小瓶	Wheaton	VWR 66011-675