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方法文章

测定增殖与静息状态下人成纤维细胞全基因组转录本降解速率

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DOI：

10.3791/56423

⸱

2018年1月2日

 ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, 3Molecular Biology Institute Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

我们描述了一种用于生成增殖和静息状态的原代人皮肤成纤维细胞、监测转录本降解速率以及鉴定差异降解基因的实验方案。

摘要

静止期是一种暂时且可逆的状态，在此状态下细胞已停止细胞分裂，但仍保留增殖能力。包括我们的研究在内的多项研究表明，静止期伴随着基因表达的广泛变化。其中部分变化是通过增殖相关转录因子（如 E2F 和 MYC）的水平或活性改变而发生的。我们已证明，mRNA 降解也可导致增殖细胞与静止细胞之间基因表达的变化。在本实验方案中，我们描述了建立人皮肤包皮成纤维细胞增殖与静止培养体系的步骤。随后，我们介绍了使用放线菌素 D（Actinomycin D, ActD）抑制增殖期和静止期细胞中新转录过程的操作流程。ActD 处理是一种简单且可重复的方法，可用于区分新转录与转录本降解过程。ActD 处理的一个缺点是，其时间进程必须限制在较短的时间范围内，因为 ActD 会影响细胞活力。通过在不同时间点监测转录本水平，以确定转录本的降解速率。该方法可用于鉴定在增殖与静止成纤维细胞中表现出差异降解的基因及转录本异构体。

引言

转录本的稳态水平反映了转录合成与转录本降解两方面作用的共同结果。受调控且协调进行的转录本降解是控制生物过程的重要机制1,2,3,4。例如，已有研究显示，转录本的降解速率在炎症细胞因子肿瘤坏死因子激活后所引发的一系列时序性事件中发挥重要作用5。

我们先前已表明，原代人成纤维细胞在增殖与静息状态之间的转换与许多基因转录水平的变化相关6。其中部分变化反映了这两种状态下转录因子活性的差异。

转录本降解速率的变化也可能导致同一转录本在两种不同状态下表达水平的改变7,8。根据我们先前的研究发现，增殖与静息状态之间的转换与多种微小RNA（microRNA）水平的变化相关9，我们进一步探讨了在增殖与静息成纤维细胞的基因表达变化中，是否存在转录本差异性降解的贡献。

为了监测转录本的稳定性，我们测定了增殖细胞与静息细胞中全基因组范围内转录本的降解速率。为此，我们通过引入一种新转录抑制剂，并监测各个转录本随时间推移而消失的速率，从而比较增殖与静息成纤维细胞中的降解速率。该方法的优势在于，与仅检测整体基因表达水平的方法相比，通过抑制新转录本的合成，我们能够独立于转录速率，单独测定这些转录本的降解速率。

通过放线菌素D（ActD）处理以抑制新的转录并确定转录本降解速率的方法已在多项先前研究中成功应用。ActD已被用于解析RNA稳定性在促炎性细胞因子处理引起转录本丰度变化中的重要性5。类似方法也被用于分析增殖状态与分化状态的C2C12细胞在获得分化肌肉表型过程中转录本降解速率的差异10。另一个例子中，已在多能性和已分化的鼠胚胎干细胞中检测了全局mRNA半衰期11。在这些研究中，mRNA降解被证明在调控转录本丰度以及细胞向不同细胞状态转变过程中具有重要作用。

通过应用下述方法，我们在比较增殖状态与静息状态的成纤维细胞时，发现约500个基因的转录本降解速率发生了变化12。特别是，我们发现微小RNA miR-29（在静息细胞中表达下调）的靶基因在细胞进入静息状态时变得更加稳定。本文描述了我们用于测定增殖期和静息期细胞中转录本降解速率的方法。该方法适用于在两种不同但相似的条件下，当需要获取快速降解基因信息时，进行全局mRNA降解速率的比较。该方法也可用于探讨其他问题，例如细胞培养条件对转录本降解的影响，如二维培养与三维培养之间的差异。可通过微阵列或RNA-Seq等方法在全基因组范围内测定降解速率；或者，也可采用实时定量qPCR或Northern印迹法，逐个基因或逐个剪接异构体地测定降解速率。随后可利用这些速率计算每个被监测基因的半衰期，并鉴定出在两种条件下具有不同降解速率的基因。

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方案

所描述的所有实验均获得了普林斯顿大学和加州大学洛杉矶分校机构审查委员会的批准。

1. 为放线菌素D时间过程实验准备增殖期和接触抑制的成纤维细胞

注意：本实验方案采用包含四个时间点的时间序列。每个时间点可通过一次实验中收集不同的组织培养板获得三个生物学独立重复样本，也可通过多次重复实验并使用不同的细胞培养物来实现。根据我们的经验，一个直径为10 cm的组织培养皿（一个培养板）即可提供足量的RNA用于分析。如有需要，可将多个组织培养皿的样本合并，以增加每个时间点的细胞数量。此外，也可使用从不同个体分离的成纤维细胞进行相同的实验，作为真正独立的生物学重复。

  1. 为转录本降解分析建立增殖期和静止期的细胞培养体系。对于增殖期细胞，每三天传代一次，而接触抑制细胞则需培养至发生接触抑制。
    1. 对于接触抑制细胞，每2天更换一次培养基，持续7天。在接触抑制的成纤维细胞准备收集前2天，对增殖期细胞进行传代。细胞培养方案示例见图1。本节后续步骤提供了建立和传代细胞的详细操作流程。
  2. 根据已建立的实验方案13，从新生儿皮肤中分离原代真皮成纤维细胞。对成纤维细胞进行传代以确保获得均一的细胞群体。
    注：如需保存，成纤维细胞可进行冻存与复苏。
  3. 如需使用，复苏或重新接种成纤维细胞。在无菌条件下，将成纤维细胞置于含10%血清的DMEM培养基中，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养。使用传代次数少于10代的成纤维细胞。在传代当天，成纤维细胞的融合度应<80%，以用于制备增殖期和静止期细胞群体。
  4. 若需将一个组织培养皿中的细胞分种至多个培养皿，提前将PBS、胰蛋白酶溶液和含血清的培养基置于37 °C水浴中预热20分钟。
  5. 用移液器吸取或抽吸方式去除待传代细胞培养皿中的培养基。
  6. 向每个培养皿中加入预热的PBS（150 mm培养皿加10 mL，100 mm培养皿加5 mL，6孔板每孔加2 mL，12孔板每孔加1 mL）。
  7. 用移液器吸取或抽吸方式去除各组织培养皿中的PBS。
  8. 轻柔地向每个培养皿中加入1x Trypsin-EDTA溶液（150 mm培养皿加8 mL，100 mm培养皿加3 mL，6孔板每孔加2 mL，12孔板每孔加1 mL）。
    注：通过将无菌的10x Trypsin-EDTA用无菌PBS稀释，配制1x Trypsin-EDTA工作液。最终的1x溶液应含有0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA。
  9. 将胰蛋白酶与细胞共同孵育5分钟。
  10. 轻敲培养皿底部，使细胞从皿底脱落。
  11. 用移液器吹打，使细胞重悬为单细胞悬液。
  12. 将含有胰蛋白酶的细胞悬液转移至锥形管中，并加入等体积的含10%血清的DMEM培养基（150 mm培养皿对应8 mL，100 mm培养皿对应3 mL，6孔板每孔对应2 mL，12孔板每孔对应1 mL）以终止消化。
  13. 在4 °C条件下，以1,000 × g离心5分钟，去除胰蛋白酶。
  14. 用适量培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板计数，确定细胞浓度。
  15. 以每100 mm组织培养皿接种5 × 105个细胞的标准，分别接种增殖期和接触抑制状态的细胞。
  16. 采用该方法，建立转录本降解分析所需的增殖期和接触抑制期细胞样本（图1）。

2. 放线菌素D时间进程

  1. 将放线菌素D（ActD）重悬至1 mg/mL的储存浓度（每1 mg ActD，加入950 µL无菌PBS和50 µL无菌DMSO）。
    注意：放线菌素D（ActD）的冷冻储备液在-20 °C下可稳定保存一个月。稀释后的溶液应弃用，不得储存再用。
  2. 向为 0、120、240 和 480 分钟时间点设置的所有生物学重复细胞培养板的预热培养基中加入适当体积的放线菌素 D（ActD）图2。加入放线菌素D（ActD），使其终浓度为每毫升培养基15 µg。充分混匀后，吸除旧培养基，向细胞中加入含ActD的培养基。
    1. 对于1 mg/mL的储存液，每毫升培养基中加入15 µL的ActD。 例如，对于100 mm培养皿的10 mL培养基，加入150 µL ActD。
  3. 为收集零时间点样本，轻柔吸除放线菌素D培养基，用移液器将预热的PBS加入细胞中。对于150 mm培养皿加入10 mL溶液，100 mm培养皿加入5 mL溶液，6孔板每孔加入2 mL溶液，12孔板每孔加入1 mL溶液。
  4. 轻轻吸出或用移液器移除 PBS。
    注意：所有涉及RNA提取的步骤均应使用无RNase的水、无RNase的微量离心管和无RNase的移液器进行操作。操作RNA时应佩戴手套，并频繁更换。
  5. 加入苯酚-胍基异硫氰酸盐溶液（1 mL/10 cm 培养皿，含 4 × 105 至 4 × 107 细胞）直接接种到组织培养板中。
    注意：苯酚-胍异硫氰酸溶液是一种单相溶液，可在裂解细胞的同时保持RNA质量，并实现RNA、DNA和蛋白质之间的分离。
    警告：苯酚和异硫氰酸胍具有腐蚀性。请使用适当的防护措施。
  6. 用移液器将苯酚-硫氰酸胍溶液与细胞混合物上下吹打数次，以形成均一的混合液。
    注意：苯酚-胍异硫氰酸盐溶液裂解物可在4 °C下保存过夜，或在-20 °C下保存长达一年。
  7. 在经过相应时间后，使用步骤 2.3–2.6 中所述方法收集每个时间点的样本。

3. 从苯酚-胍异硫氰酸盐溶液裂解物中分离总RNA

  1. 将样品在室温下孵育 5 分钟，以确保 RNA-蛋白质复合物完全溶解。
    注意：除非另有说明，苯酚-硫氰酸胍溶液法的各步骤均可在室温下进行。
  2. 加入可被所用方法检测到的外参对照转录本。将这些对照以已知的数量和浓度加入每个样品中。
    注意：外部 RNA 对照联盟（ERCC）外参对照混合物14是专为 RNA-Seq 设计的外参对照，也可用于 Northern 印迹或实时定量 PCR。另有专为微阵列技术设计的外参对照可供使用（见材料表）。
  3. 用移液器将苯酚-硫氰酸胍溶液混合物转移至 2.0 mL 微离心管中。每使用 1 mL 苯酚-硫氰酸胍溶液，加入 0.2 mL 氯仿（例如，向 1.5 mL 苯酚-硫氰酸胍溶液混合物中加入 0.3 mL 氯仿）。
  4. 剧烈振荡微离心管 15 秒，然后将氯仿-苯酚-硫氰酸胍混合物在室温下孵育 3 分钟。
  5. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 20 分钟。
    注意：初次离心后，样品应分为三层——底部为红色有机层，中间为白色/粉红色界面层，顶部为透明水相层（图 3）。
  6. 使用微量移液器将水相层转移至新的 2.0 mL 微离心管中。
    注意：此过程中应小心避免扰动界面层。允许残留部分水相，但切勿混入界面层，否则会导致 DNA 污染 RNA。水相层体积约为初始体积的一半，若苯酚-硫氰酸胍溶液/氯仿混合物体积为 1.8 mL，则水相层约为 0.9 mL。
  7. 弃去界面层和有机相。
  8. 向水相中加入等体积的异丙醇，并上下颠倒混匀 10 次。每 20 µL 样品中最多加入 1 µL 20 mg/mL 的糖原水溶液，尤其当预期产量较低（收集细胞数少于 106 个）时更应添加。
    注意：这将形成致密的固体沉淀，便于在后续离心步骤后观察。
  9. 将样品在室温下孵育 10 分钟。
  10. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 20 分钟。确保离心结束后 RNA 已沉淀，在管底形成白色沉淀。
  11. 用移液器小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动白色 RNA 沉淀。
    注意：可用手握住松动的吸头吸除多余乙醇。若 RNA 沉淀被扰动但未被丢弃，可重复离心一次并再次去除上清液。切勿丢弃沉淀，否则需重新进行整个实验流程。
  12. 配制 75% 乙醇与 25% 无核酸酶水的混合溶液。每 1 mL 苯酚-硫氰酸胍溶液试剂中加入 1 mL 75% 乙醇用于洗涤沉淀。
  13. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
  14. 去除大部分上清液后，用移液器尽可能吸除残留乙醇，同时仍需小心避免扰动沉淀。
    注意：此步骤中 RNA 沉淀较为松散且易移动。此时操作应格外谨慎，以防 RNA 损失。
  15. 在室温下以 12,000 × g 离心 2 分钟，使所有过量乙醇沉淀。
  16. 用微量移液器彻底吸除管内所有过量乙醇，注意不要扰动沉淀。
  17. 将 RNA 沉淀在空气中干燥 5 分钟。
  18. 向 RNA 沉淀中加入 50 µL 无核酸酶水，并将沉淀重悬于无核酸酶水中。
  19. 每样品加入 1 µL DNase（2 单位/µL）以去除 DNA，随后灭活 DNase 和阳离子（见材料表）。
  20. 将 RNA 样品储存于 2.0 mL 微离心管中，并置于 -80 °C 保存。

4. 转录本丰度分析

  1. 使用分光光度计定量RNA并检测RNA纯度。
    注意：RNA在260 nm与280 nm处的吸光度比值应约为2.0。
  2. 使用1%琼脂糖凝胶电泳或等效技术分析RNA，以观察其降解程度。
    注意：应清晰可见代表18S和28S rRNA的两条明显条带（图4）。若这些条带不可见，则RNA可能已降解。有关RNA降解问题的故障排除建议详见“讨论”部分。
  3. 利用微阵列15、RNA-Seq16、实时定量PCR17或Northern印迹18，监测所收集RNA样品中各转录本的丰度，并与加入的已知丰度内参标准品进行比较。
    1. 将每个时间点各转录本的丰度与已知丰度的内参对照进行比较。
      注意：对于微阵列，结果为荧光强度值；对于Northern印迹，可对X射线胶片上的条带进行定量；对于实时定量PCR，可通过与已知标准品比较，采用2-σσCT法19确定转录本丰度；对于RNA-Seq，可将标准化值表示为FPKM（每百万比对读段中每千碱基外显子的片段数）或每百万比对读段中每千碱基外显子的片段数。对于异构体特异性的衰减速率，可使用能够区分异构体的方法（如DEXSeq20）分析RNA-Seq数据。异构体特异性的衰减速率最好通过RNA-Seq确定。若需使用微阵列数据进行分析，则必须以探针为单位而非基因为单位进行数据分析。分析人员在解释有限数量探针提供的信息时需格外谨慎。例如，可能仅有5个或更少的探针能提供关于某一特定异构体的有效信息。此时，分析人员需判断这些探针的行为是否具有一致性，以确保结果的可靠性。
  4. 对所收集样品中分离的RNA进行实时定量PCR17，分析快速降解基因（如c-Myc）和缓慢降解基因（如GAPDH），以确认转录本衰减速率被准确检测。
    注意：为进一步验证，可设计并使用异构体特异性的实时定量PCR探针，随时间监测特定异构体的丰度变化21。

5. 衰变速率常数的测定

  1. 针对每个时间点，对每条转录本（基因特异性或转录本特异性）的丰度值进行对数转换。
    注意：对数值进行对数转换可将指数衰减曲线转化为直线，从而可用线性衰减模型进行拟合22。
  2. 将每条转录本（基因特异性或转录本特异性）的表达谱拟合至线性衰减模型。该模型的公式为 f(t) = C - r*t。在此方程中，C 是表示转录本初始量的常数，r 是下降速率，t 是自实验开始以来的时间。由该方程可得衰减速率为 r*ln(10)（参见参考文献11）。
    注意：maSigPro 软件包是一种基于回归的分析方法，旨在检测时间序列数据中显著的基因表达谱差异23。maSigPro 的示例代码和结果可访问以下网址获取：https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf。
  3. 过滤掉无法拟合对数线性衰减模型的基因。可通过方差分析 F 检验实现此步骤。
    注意：F 检验基于 F 统计量，其定义为样本均值间变异与样本内变异的比值。通过应用线性递增的 Benjamini 和 Hochberg 错误发现率校正法对多重比较的 p 值进行校正24。F 检验中 q 值大于 0.05 可作为无法拟合对数线性衰减模型基因的筛选阈值。
  4. 进行方差分析 F 检验，以确定在分类的细胞周期条件与时间之间具有显著交互作用项的转录本（错误发现率，FDR <0.05）。

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结果

我们此前已报道了在8小时时间过程中，对增殖期和接触抑制期原代人成纤维细胞中转录本降解速率进行微阵列分析的结果12。在增殖期与接触抑制期成纤维细胞之间，转录本稳定性发生显著变化的基因列表见补充表1。该表提供了放线菌素D（ActD）处理前（时间零点）及处理后时间过程中的荧光强度数据。通过方差分析F检验（ANOVA F-test）确定在增殖期和接触抑制条件下衰减速率斜率显著不同的基因，并将其列入该列表。在增殖期和静止期成纤维细胞中具有不同降解速率的基因示例见图5。

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讨论

静息状态可由多种外部信号诱导，包括有丝分裂原或血清的撤除、细胞黏附的缺失以及接触抑制。接触抑制是诱导静息状态的多种可行方法之一，是一种在进化上高度保守的过程，细胞在此过程中因细胞间的接触而退出增殖性细胞周期。本文以接触抑制为例，阐述诱导静息状态的方法。既往研究报道，细胞间接触可影响微小RNA（microRNA）的生成25因此，该结果提供了一种静息状态诱导方法的相关信息，但仍需进一步研究以确定哪些变化与静息状态相关 本身.

我们使用了从新生儿皮肤中分离得到的原代人类二倍体成纤维细胞。实验所用成纤维细胞的传代次数少于10次。我们弃用了高代次传代的成纤维细胞，因为它们会发生衰老。尽管本方案主要针对增殖期和静止期的皮肤成纤维细胞，但所述方法也可用于在不同类型的细胞及不同条件下监测衰变速率。

我们通过转录关闭时间过程，在全基因组范围内监测了mRNA的降解速率。转录关闭时间过程是目前最常用的用于将mRNA降解与mRNA转录解耦的方法，从而计算mRNA的半衰期

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披露

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

HAC 是丽塔·艾伦基金会（http://www.ritaallenfoundation.org）的米尔顿·E·卡塞尔学者。本研究获得了以下资助：美国国立普通医学科学研究所卓越中心项目 P50 GM071508（项目负责人：David Botstein）、PhRMA 基金会项目 2007RSGl9572、美国国家科学基金会项目 OCI-1047879（授予 David August）、美国国立普通医学科学研究所 R01 GM081686 项目、美国国立普通医学科学研究所 R01 GM0866465 项目以及伊莱 & 埃迪丝·布罗德再生医学中心 & 干细胞研究、加州大学洛杉矶分校CTSI虹膜·坎托妇女健康中心NIH资助号UL1TR000124，以及白血病淋巴瘤学会。本出版物所报告的研究由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助，资助编号P50CA092131。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥作用。HAC是伊莱 & 埃迪丝·布罗德再生医学中心 & 干细胞研究，加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所，以及加州大学洛杉矶分校生物信息学跨系项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可达到 12,000 x g 且温度为 4 ℃ 的微量离心管离心机°C
琼脂糖凝胶电泳设备
无菌组织培养板和锥形管
杜尔贝科改良伊格尔培养基Life Technologies11965-118
胎牛血清VWR35-010-CV
无菌血清移液管、移液器及组织培养用移液管吸头
单独包装、一次性使用的RNase-free移液器、移液器吸头和离心管，用于RNA提取与分析
处理试剂和RNA样本时应佩戴一次性手套
RNaseZapInvitrogenAM9780用于去除工作台面的RNase污染
2.0 ml 离心管
胰蛋白酶-EDTA  10X 溶液Millipore Sigma9002-07-07
无菌 PBSLife Technologies14190-250
Trizol赛默飞世尔科技15596018
放线菌素DMillipore SigmaA1410-2 mg抑制转录
无菌DMSOFisher Scientific31-761-00ML放线菌素D的溶剂
氯仿赛默飞世尔科技ICN19400225MP Biomedicals, Inc 产品
异丙醇Fisher ScientificBP2618500分子生物学级
乙醇Fisher ScientificBP28184分子生物学级
无RNase的糖原（20 mg/ml 水溶液）赛默飞世尔科技R0551RNA沉淀载体
TURBO DNA-free 试剂盒赛默飞世尔科技AM1907用DNase去除DNA，然后在后续步骤中  使DNA失活并去除二价阳离子
琼脂糖赛默飞世尔科技ICN820721MP Biomedicals, Inc 产品
RNA凝胶上样染料赛默飞世尔科技R0641即使在变性电泳条件下也适用
Millenium RNA 标记物赛默飞世尔科技AM7150RNA阶梯分子量标记
单色RNA外参试剂盒安捷伦科技5188-5282Agilent 芯片分析的示例外参对照
Tris 碱Fisher ScientificBP152-1分子生物学级，用于TAE缓冲液
冰醋酸Fisher ScientificA38-500用于TAE缓冲液
EDTAFisher ScientificBP120-500电泳级，用于凝胶
溴化乙锭Millipore SigmaE7637用于分子生物学
外部RNA对照联盟RNA加标混合物赛默飞世尔科技4456740RNA测序中的外源加入对照
TruSeq Stranded mRNA 文库制备试剂盒 A（48 个样本，12 个索引）IlluminaRS-122-2101用于RNA测序
96孔0.3 ml PCR板赛默飞世尔科技AB-0600用于实时定量 PCR
Microseal B 黏性封膜Bio-RadMSB1001用于实时定量 PCR
无RNase/DNase试剂储液槽VWR89094-662用于实时定量 PCR
无RNase/DNase八联管及管盖赛默飞世尔科技AM12230用于实时定量 PCR
SuperScript 逆转录酶Invitrogen18090010用于实时定量 PCR
AMPure XP 磁珠贝克曼库尔特A63880用于实时定量 PCR

参考文献

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