方法文章

增殖和静止人成纤维细胞的全基因组转录衰变率的测定

DOI：

10.3791/56423

⸱

2018年1月2日

 ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, 3Molecular Biology Institute Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

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我们描述了一种生成增殖和静止的主要人真皮成纤维细胞的协议, 监测转录衰变率, 并识别差异腐烂的基因。

摘要

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静止是一种暂时的可逆状态, 其中细胞停止了细胞分裂, 但保留了增殖的能力。包括我们在内的多项研究表明, 静止与基因表达的广泛变化有关。其中一些变化发生在扩散相关转录因子的水平或活动的变化, 如 E2F 和 c-myc。我们已经证明, mRNA 的衰变也可以促进增殖和静止细胞之间基因表达的改变。在本协议中, 我们描述了建立人真皮包皮成纤维细胞增殖和静止培养的过程。然后, 我们描述的程序, 抑制新的转录在增殖和静止细胞与放线菌 D (ActD)。ActD 治疗是一种直接和可重复的方法, 游离新转录从成绩单衰变。ActD 治疗的一个缺点是, 由于 ActD 影响细胞的生存能力, 时间过程必须限制在短时间内。成绩单的水平被监测的时间, 以确定成绩单衰变率。这一过程允许鉴定的基因和异构体, 表现出差异衰变的增殖与静止成纤维细胞。

引言

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成绩单的稳定状态反映了成绩单合成和成绩单衰减的贡献。调节和协调转录衰减是控制生物过程的重要机制1,2,3,4。例如, 成绩单衰变率已被证明是贡献的时间序列事件后, 激活的炎症细胞因子肿瘤坏死因子5。

我们以前已经表明, 在原始人成纤维细胞的增殖和平静之间的过渡与许多基因的转录水平的变化有关6。其中一些变化反映了这两个国家之间转录因子活动的差异。

成绩单的衰变率的变化也会导致在两个不同状态7,8中的成绩单的表达水平的变化。根据我们早先的发现, 扩散与静止之间的过渡与多个 rna9的级别的变化有关, 我们询问是否也有来自差异成绩单衰减的贡献增殖与静止成纤维细胞的基因表达。

为了监测成绩单的稳定性, 我们确定了在增殖与静止细胞中转录的全基因组的衰变率。为了达到这....

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方案

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所有的实验都是由普林斯顿大学和加州大学洛杉矶分校的机构评审委员会批准的。

1. 制备增殖和接触抑制成纤维细胞 ActD 时间课程

注意: 本协议使用 timecourse 四 timepoints。三生物独立样品可以收集每 timepoint 通过收集不同的组织培养板在一个实验, 或者实验可以重复多次与细胞的不同的文化。在我们的经验, 一个10厘米 (直径) 组织培养皿 (一盘) 提供足够的 RNA 进行分析。如果需要, 可以为每个样本汇集多个组织培养皿, 以增加每个 timepoint 的细胞数量。此外, 同样的实验可以进行与孤立的成纤维细胞从不同的人真正独立的生物复制。

  1. 建立细胞增殖和静止培养的转录衰变分析。对于增殖细胞, 每三天分裂细胞, 而接触抑制细胞则成为接触抑制。
    1. 对于接触抑制细胞, 每2天改变培养基7天。在接触抑制的成纤维细胞准备收集前2天分裂增殖细胞。图 1中显示了一个单元格区域性方案的示例。本节中的其余步骤提供了用于建立和拆分单元格的详细协议。
  2. 根据已建立的协议, 从新生儿皮肤中分离原发真皮成纤维细胞13。传代成纤维细胞, 以确保均匀的人口。
    注: 成纤维细胞可以....

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结果

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我们以前曾报道过在8小时的时间课程12中, 增殖和接触抑制主要人成纤维细胞的转录衰变率的微阵列分析结果。在补充表 1中提供了与增殖和接触抑制成纤维细胞比较的转录稳定性有显著变化的基因列表。荧光强度在时间零和在时间路线以后 ActD 治疗提供。基因被列入了名单上, 通过测定在增殖和接触抑制条件下有明显不同的斜坡的基因, 使用方差分析 f-试验。在图 5中显示了在增殖和静止成纤维细胞中有不同衰变率的基因的例子。

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图 1: 用于建立 ActD 时间过程分析的增殖和接触抑制板的协.......

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讨论

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静止可由外部信号诱发, 包括 mitogens 或血清的提取、细胞黏附缺乏和接触抑制。接触抑制是诱发静止的多种可能的方法之一, 是一种高度进化的保守过程, 细胞在反应细胞接触时退出增殖细胞周期。我们在这里的重点是接触抑制作为一个例子的方法来诱导平静。以前的研究报告说, 细胞接触可以影响 rna 生物25, 因此, 结果提供了一个静止方法的信息, 需要额外的研究来确定哪些变化是与静止相关的本身。

我们使用的主要人二倍体成纤维细胞, 我们从新生儿皮肤分离。我们发起这些实验的纤维细胞传代少于10次。我们丢弃后通道成纤维细胞, 因为它们衰老。虽然本议定书的重点是增殖和静止真皮成纤维细胞, 所描述的程序可以用来监测衰变率在不同类型的细胞和在不同的条件。

我们使用转录关闭时间过程来监测基因组范围内的 mRNA 衰变率。关闭时间课程是最广泛使用的方法, 解耦 mrna 衰变的 mrna 转录, 以计算 mrna 半衰期1

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披露

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作者没有竞争利益透露。

致谢

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文森特卡塞尔是丽塔. 艾伦基金会 (http://www.ritaallenfoundation.org) 的弥尔顿学者。这项工作的经费来自国家普通医学科学研究所授予的 P50 GM071508 (私家侦探大卫博特斯坦), PhRMA 基金会赠款 2007RSGl9572, 国家科学基金会授予 OCI-1047879 8月大卫,国立普通医学科学院 R01 GM081686, 国立普通医学科学院 R01 GM0866465, 伊莱 & #38; 伊蒂丝再生医学和 #38 的广泛中心; 干细胞研究, 虹膜康托妇女健康中心/加州大学洛杉矶分校 CTSI 国立卫生研究院格兰特 UL1TR000124 和白血病淋巴瘤协会这份出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家癌症研究所的 P50CA092131。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备原稿方面没有作用。是 Eli 和 #38 的成员; 伊蒂丝广泛的再生医学和 #38 中心; 干细胞研究, 加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所, 加州大学洛杉矶分校生物信息学部际计划。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于微量离心管的离心机，能够达到 12,000 x g 和 4°C
琼脂糖凝胶
无菌组织培养板和锥形管
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-118
胎牛血清VWR35-010-CV
用于组织培养的无菌血清移液管、移液器和移液管吸头
独立包装的一次性无 Rnase 移液器、移液器吸头和试管，用于 RNA 分离和分析
处理试剂和 RNA 样品
RNaseZapInvitrogenAM9780用于去除 RNase
2.0 ml eppendorf 管
胰蛋白酶-EDTA 溶液 10XMillipore Sigma9002-07-07
无菌 PBSLife Technologies14190-250
TrizolThermo Fisher Scientific15596018
放线菌素 DMillipore SigmaA1410-2 mg抑制转录
DMSOFisher Scientific31-761-00ML放线菌素 D 溶剂
氯仿Thermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals， Inc 产品
异丙醇Fisher ScientificBP2618500分子生物学级
Fisher ScientificBP28184分子生物学级
无 RNase 糖原（20 mg/ml 水溶液）Fisher ScientificR0551载体，用于 RNA 沉淀
TURBO 无 DNA 试剂盒Thermo Fisher ScientificAM1907用 DNase 去除 DNA，然后在后续步骤中灭活 DNA 并去除二价阳离子
琼脂糖Thermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals， Inc 产品
用于 RNA 凝胶的上样染料Thermo Fisher ScientificR0641甚至适用于变性电泳
千年 RNA 标志物Thermo Fisher ScientificAM7150RNA 分子量标准
色 RNA 加标试剂盒Agilent Technology5188-5282用于 Agient 微阵列分析的加标对照示例
Tris 碱Fisher ScientificBP152-1分子生物学级，用于 TAE 缓冲液
冰醋酸Fisher ScientificA38-500，用于 TAE 缓冲液
EDTAFisher科学BP120-500电泳级，用于凝胶 用于凝胶
分子生物学溴化乙锭Millipore SigmaE7637
外部 RNA 对照 联盟 RNA 加标混合物Thermo Fisher Scientific4456740用于 RNA Seq 的加标对照
TruSeq 链式 mRNA 文库制备试剂盒 A（48 份样品，12 个标签）IlluminaRS-122-2101，用于 RNA Seq
96 孔 0.3 ml PCR 板Thermo Fisher ScientificAB-0600，用于实时 qPCR
Microseal B 粘性密封Bio-RadMSB1001用于实时 qPCR
不含 Rnase/Dnase 的试剂储液槽VWR89094-662用于实时 qPCR
不含 Rnase/Dnase 的 8 个联排管和管盖Thermo Fisher ScientificAM12230，用于实时 qPCR
用于实时 qPCRInvitrogen18090010
AMPure XP 微珠实时荧光定量 PCRBeckman CoulterA63880
电泳设备时应佩戴一次性手套的工作表面 无菌 乙醇 Thermo 单基 级 用于的，，的 SuperScript 逆转录酶 用于 的

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
  2. Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R.

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