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方法文章

封闭系统中长期培养脑片期间实现精确定位与重复间歇成像的改良滚筒管法

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DOI：

10.3791/56436

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2017年12月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种改良的滚管法，可用于对啮齿类动物脑片进行长期培养，并在光刻蚀盖玻片上实现精确复位的间歇性高分辨率成像。该方法能良好维持神经元的存活率和脑片的形态结构。文中还展示了利用该完全封闭系统，结合病毒实现细胞类型特异性表达的应用实例。

摘要

培养的啮齿类动物脑片可用于研究神经元和胶质细胞在保持其多数正常特性的环境中所表现出的细胞与分子行为 体内 相互作用。利用多种转基因小鼠品系制备脑片，或在野生型脑片中使用病毒载体表达荧光标记蛋白或报告分子，可实现荧光显微镜下的高分辨率成像。尽管已有多种脑片成像方法被开发出来，但将脑片培养与对活体脑片中特定细胞进行长期、重复的高分辨率成像相结合仍存在挑战。当使用病毒载体表达外源蛋白时，这一问题尤为突出，因为此类操作最好在封闭系统中进行，以保护操作者并防止交叉污染。本文报道了对滚管式脑片培养方法进行的简单改进，可在封闭系统中实现脑片持续数周的重复高分辨率成像。将脑片培养在光刻蚀盖玻片上，可利用定位标记快速而精确地重新定位载物台，从而在不同处理前后对同一视野进行长时间追踪成像。本文展示了该方法结合特异性神经元染色与表达，用于观察海马脑片结构的变化、病毒介导的神经元荧光蛋白表达，以及cofilin病理的发育过程——后者此前已在阿尔茨海默病（AD）模型中被观察到，即在脑片经淀粉样β肽（Aβ）寡聚体处理后，海马区出现cofilin病理改变。

引言

从啮齿类动物脑区分离神经元进行原代培养，是研究人员用于观察神经元对病理相关刺激反应的重要工具。然而，这类研究存在局限性，即只能在二维条件下观察神经元，且缺乏胶质细胞的支持系统。此外，除非在极高密度（640个神经元/mm2，约占表面积的16%）条件下培养，否则在距离胞体较远的位置难以追踪树突或轴突的随机生长过程；而在这种高密度之外，海马神经元在培养4周后的存活率会显著下降1，从而限制了原代培养体系在衰老相关病理长期研究中的应用。相比之下，将啮齿类动物脑组织制备成脑片进行培养是一种更具吸引力的选择，该方法能够维持细胞的有序结构，并在数周甚至数月内保持良好的细胞活性，从而克服上述局限。已有研究报道了多种啮齿类动物脑区脑片培养的适宜条件2。

目前广泛用于脑片长期培养的两种主要方法是：在膜上进行气液界面培养3，或在密封管内的盖玻片上培养，并将管子置于滚筒式培养箱中旋转以提供通气4。在膜上培养的脑片可直接使用直立显微镜和水浸物镜通过高分辨率荧光显微镜进行成像5。此外，也可将膜上培养的脑片转移至玻璃底培养皿中，利用倒置显微镜实现树突棘的高分辨率观察6。然而，这两种在膜上成像的方法均为开放式系统，需要定期更换培养基，且常需添加抗真菌剂和/或抗生素以预防或减少污染5,6。处于气液界面膜上的脑片能保持良好的形态结构和细胞存活率，但在高倍镜下重复成像时，若需返回精确的同一位置，则极为困难，除非实验仅追踪表达荧光标记的小群细胞。尽管膜上培养的脑片已用于病毒介导的外源基因表达5,6，但根据生物安全规范，某些用于表达荧光标记蛋白及细胞生理报告分子的病毒载体可能需要采用封闭式培养系统。此外，浸液物镜在连续追踪不同样本时，需在样本之间进行去污染处理5。膜界面培养的一个重要应用是将高分辨率成像与单时间点的电生理记录相结合7。

在塑料管内放置盖玻片的滚管法，若不取出盖玻片，则无法进行电生理记录或高分辨率成像。因此，该方法最常用于长期研究，且通常在固定后进行观察8。本文所述方法采用滚管培养技术，但使用经过钻孔处理的培养管，将组织切片置于盖玻片上，可在培养维持期间反复成像。该封闭系统在成像过程中无需更换培养基，并采用光刻蚀盖玻片提供定位标记，使得在数天甚至数周后仍能在高倍镜下准确重现先前成像的特定视野。

我们应用该方法来研究啮齿类动物海马体中的变化，海马体是参与记忆和学习的主要脑区。啮齿类动物海马体常被用作研究认知功能障碍（如阿尔茨海默病，AD）发展过程中所出现的病理或与年龄相关变化的模型9。我们的方法特别适用于研究单一片段内随着时间推移、在环境变化（例如Aβ肽水平升高，这是AD的特征之一8）诱导下发生的病理改变。人类和啮齿类动物AD脑组织中的一种病理特征是存在cofilin-actin聚集体和棒状结构（rods），后者包含成束的丝状结构，其中cofilin与actin的摩尔比为1:110,11,12。在经Aβ处理的大鼠海马固定切片中，以及在表达cofilin-GFP并经受缺氧处理的活体啮齿类动物脑片中，均已观察到棒状结构8，这些结构可能与AD和脑卒中中所见的突触功能障碍有关。本文中，我们利用这种新的培养方法，观察由不同病毒导入的外源性嵌合荧光蛋白在脑片内的表达时间进程及其分布情况。随后，我们利用神经元特异性表达的cofilin报告基因构建体，追踪可溶性Aβ寡聚体（Aβo）处理后海马脑片中cofilin棒状结构和聚集体病理的形成过程。

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方案

动物使用遵循经批准的繁育和动物使用方案，符合科罗拉多州立大学动物护理与使用指南。

注意：以下方案描述了用于长期孵育和间歇成像的海马脑片的制备与培养方法。将单个海马脑片通过血浆凝块固定于经特殊制备的光刻蚀盖玻片上，随后将盖玻片密封至经钻孔处理的滚筒培养管的平面端，并置于滚筒培养箱中维持培养。在进行病毒感染以表达荧光蛋白并实现高分辨率成像前，需用纤溶酶（plasmin）溶解血浆凝块。使用荧光神经元活体染料对脑片内的神经元进行成像。

1. 滚管架的准备

  1. 使用按比例尺所示尺寸打印的 图1A 所示模板。用钉子在模板上每个孔的中心位置打小孔（孔径需足够插入细头记号笔）。
  2. 将模板置于一个直径为15 cm的组织培养皿（标称直径14 cm）底部，标记出孔的位置。对第二个培养皿重复此操作。
  3. 使用适用于塑料材料的钻头，在每个培养皿底部以六边形阵列方式（孔中心间距4.8 cm，距培养皿边缘2.5 cm）钻出六个直径为1.5 cm的孔。在两个大孔之间等距位置，距边缘12 mm处再钻三个直径为3 mm的小孔，如 图1A 所示。
  4. 将两个培养皿的底部相对放置，将一根长2.5英寸、直径3/16英寸的机械螺钉依次穿过其中一个小型孔、一个平垫圈、一段聚乙烯管（间隔套管，长4.7 cm）、另一个平垫圈、第二个组织培养皿、另一个平垫圈、一个锁紧垫圈，最后拧上螺母。
  5. 对另外两个机械螺钉重复步骤1.4的操作，先松缓拧紧，待所有螺钉就位后再将螺母牢固拧紧。
  6. 将护孔圈（厚5/16英寸，内径5/8英寸）压入底部培养皿的孔中，制成最终的滚瓶架（图1B；图中显示已放置两个滚瓶）。在每个滚瓶架上贴上带有唯一编号的标签。

2. 滚管和盖玻片的制备

  1. 制作用于在滚管上钻孔的夹具
    1. 在一块 2 × 4 × 5.5 英寸的木块侧面中心处，以一定角度钻一个直径 1.5 cm、深 8 cm 的孔，使得当滚管插入时其平面侧几乎与木块平行（图 2A）。
    2. 使用圆形木工锉扩大该孔，同时加宽并修整成锥形，以便于插入管子（滚管靠近管帽端的直径略大）（图 2B）。
    3. 在距离木块侧面 5.5 cm 处钻一个直径 1.5 cm 的垂直孔，并使其位于侧孔正上方的中心位置（图 2C）。
    4. 当侧孔已充分修整成锥形后，插入一根在预定位置已做标记的滚管，使切片用孔的中心对准，并将管子定位，使标记点位于 1.5 cm 垂直孔的中心。
    5. 取出管子，测量标记点到管端的距离。在夹具的孔中心处量出相同距离并插入一根钉子，作为钻孔时正确放置管子的限位挡块（图 2C 中的箭头所示）。
    6. 使用钢锯将钉子切割至与木块表面齐平，以防造成伤害。
    7. 如果钻床带有可固定夹具的槽，则在夹具底部加装弹簧夹（图 2D 黑色箭头所示）；否则使用 C 型夹将夹具牢固地固定在钻床上。
  2. 使用上述夹具固定并定位一根平面朝上的 11 cm 塑料培养管（图 2A），在距管底 1.0 cm 处、管壁两侧之间中心位置钻一个直径 6 mm 的孔。
    注意：应使用专为塑料设计的钻头。
  3. 使用旋转去毛刺工具修整孔的边缘（图 2E），并在孔的内缘制作 4 条凹槽（图 2E 插图），以利于旋转过程中液体从孔中排出。
  4. 使用 12 mm 打孔器从无毒双面粘性硅橡胶片上切割出直径 12 mm 的圆片。使用标准单孔打孔器（直径 6 mm）在每个圆片中心打孔。
  5. 用 70% 乙醇冲洗钻孔后的管子，在生物安全柜中晾干，并将管子和打孔的粘性圆片置于生物安全柜内，在紫外灯下（平均距离 70 cm，功率 30 W）照射 40 分钟进行灭菌。
  6. 20 分钟后重新调整管子和圆片的位置，确保所有暴露表面均被灭菌。在无菌条件下，撕下粘性圆片的白色背衬，将硅橡胶贴附于管子外侧，使孔对齐（图 2F）。
    警告：为避免紫外线暴露，开启紫外灯前应佩戴眼部防护装备并关闭柜门。
  7. 清洗直径 12 mm 的光刻蚀德国玻璃盖玻片（中心区域为 100 个 1 mm 方格）。用镊子轻轻夹住盖玻片，依次浸入无水乙醇、水、再次无水乙醇中，最后将盖玻片在火焰上灼烧以去除残留乙醇。让盖玻片自然冷却。
  8. 用镊子夹住盖玻片，浸入 2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷丙酮溶液中 10 秒。用超纯水冲洗盖玻片，然后自然晾干。
  9. 将盖玻片放置于生物安全柜内的无菌滤纸上，打开紫外灯，每侧各照射 20 分钟。
    警告：为避免紫外线暴露，开启紫外灯前应佩戴眼部防护装备并关闭柜门。

3. 海马脑片制备

  1. 开始解剖前，准备双刃剃须刀片的一半用于组织切片机。用手小心地沿长度方向对折刀片，然后折断成两半。
  2. 使用棉签蘸丙酮清洗刀片的一半，随后用无水乙醇冲洗，并在空气中晾干。在将刀片的一半安装到组织切片机之前，用70%乙醇冲洗以进行灭菌。
  3. 遵循机构动物护理与使用委员会批准的方案；在异氟烷麻醉后，通过断头法处死一只4至7日龄的幼鼠或幼大鼠，并用剪刀或断头器取下头部。
    注意：脑片培养方案与小鼠或大鼠品系或基因型无关。已使用多种不同遗传背景的转基因小鼠品系。
  4. 用70%乙醇冲洗头部，并将其放入60 mm的培养皿中。从此时起直至脑片最终固定于滚管上，所有后续步骤均需在层流罩内进行，以保持无菌状态。
  5. 使用#21外科刀片，在皮肤和颅骨上做矢状切口。用#5 Dumont镊子剥离皮肤和颅骨，以暴露脑组织。
  6. 闭合镊子，轻柔地分离整个脑组织，通过镊子夹住小脑后方的脑干部位将其释放。将脑组织放入含有4 °C Gey's平衡盐溶液/0.5%葡萄糖（GBSS/葡萄糖）的无菌60 mm培养皿中。
  7. 在解剖显微镜下观察脑组织（图3A），将脑组织背侧朝上放置，用外科刀片切除脑前部三分之一和小脑（图3B）。
    1. 用镊子夹住修剪后的脑组织，使其后侧朝上，腹侧紧贴培养皿侧壁以保持稳定。用尖头精细的Dumont #5镊子轻轻剥离矢状中线周围的软脑膜，并去除中脑组织（图3C，虚线圈内）。
    2. 沿脑组织两侧各做一次切口，使其展开（图3C，虚线）。当脑组织背侧朝下并完全展开后，应可见海马裂（图3D，箭头所示）。
    3. 将展开的脑组织转移至一片聚三氟氯乙烯塑料膜上，并将其定位在组织切片机的平台上准备切片。用GBSS/葡萄糖润湿刀片，将海马切成约300 µm厚的切片。
    4. 用移液器将切好的脑组织从塑料膜上冲洗下来，转移到另一个含有GBSS/葡萄糖的新鲜60 mm培养皿中（图3E）。用尖头精细镊子轻轻夹取并剥离切片上残留的软脑膜及其他非海马组织（图3F）（图3G, H）。

4. 切片铺板

  1. 获得脑片后，将 2 µL 鸡血浆置于已制备的盖玻片光蚀刻面的中央。轻轻涂抹血浆，使其形成直径为 3–4 mm 的斑点。
    注意：当通过解剖显微镜观察时，光蚀刻面为盖玻片的上表面，此时编号方向为正向。
  2. 使用无菌窄头刮铲（图 4A）将 1 片脑组织转移至血浆斑点处（图 4B）。用闭合的镊子夹住刮铲尖端以固定脑片，并将其从 GBSS/葡萄糖溶液中提起。
  3. 将刮铲接触盖玻片上的血浆斑点，并用闭合的镊子将脑片推至盖玻片表面。
  4. 在另一离心管中混合 2.5 µL 血浆与 2.5 µL 凝血酶。迅速取 2.5 µL 该混合液覆盖并环绕脑片，轻轻吹打混匀（图 4B）。
    注意：血浆将在 10–15 秒内凝固，因此操作必须迅速。若脑片粘附困难，可将 5 µL 血浆与 5 µL 凝血酶混合，取 4–5 µL 加于脑片上，混匀后吸除部分液体，使脑片平整贴附于盖玻片。
  5. 移除先前固定在滚轴管上的硅橡胶粘合剂暴露侧的透明塑料保护层，将带有脑片的盖玻片放置于粘合剂上，使脑片对准孔洞位置（图 4C）。
  6. 为确保牢固粘附，在将盖玻片转移至生物安全柜的过程中，用拇指轻柔而均匀地按压盖玻片，使其均匀受力并保持约 1 分钟。
  7. 在生物安全柜内，向每根滚轴管中加入 0.8 mL 完全 Neurobasal A 培养基（材料表）（图 4D）。
  8. 通过夹具固定带有无菌棉塞的巴斯德移液管，通入 5% CO2/95% 空气混合气体。用该气体冲洗滚轴管后，迅速将管子从移液管周围撤出并立即盖紧管帽。
  9. 在管壁上标记脑片编号和管编号。将滚轴管插入滚轴架中，确保其几何分布平衡。若管数为奇数，需添加空管以保持平衡。
  10. 将滚轴架放入 35 °C 滚轴培养箱中，调节滚轴转动速度至约 10–13 RPH（图 4E）。为使培养基始终位于管底，可用木板垫高培养箱前部，使其向后倾斜约 5°。
  11. 将脑片编号和管编号录入电子表格，用于记录所有脑片处理信息及观察日期。
  12. 体外培养约第 6 天时，向每管中加入 1 µL（0.002 U）活性纤溶酶。
  13. 待血凝块完全溶解后（通常在数小时内），吸除培养基并更换为不含纤溶酶的新鲜培养基。必要时，可将脑片与纤溶酶共孵育过夜，并于次日更换培养基。
  14. 脑片通常需孵育至少 7–10 天后方可用于实验。分别在第 3 或第 4 天、第 7 天以及此后每隔 7 天吸除旧培养基并更换新鲜培养基。

5. 用于转基因表达的病毒载体的制备

注意：脑片培养物中神经元的转基因表达可通过使用基因工程啮齿类动物的脑组织，或通过感染重组复制缺陷型病毒来导入转基因。腺病毒（AV）、腺相关病毒（AAV）以及重组慢病毒载体均已用于本实验室的海马脑片培养，以在脑片中表达不同的荧光蛋白融合蛋白。

  1. 根据已有文献所述方法制备用于表达目的RNA的复制缺陷型腺病毒（AV）13,14。采用系列稀释法对病毒进行滴度测定（以感染性单位U/mL表示），具体方法如文献所述，使用针对病毒表达蛋白的抗体进行检测14。为观察cofilin聚集体及cofilin-肌动蛋白棒状结构的形成，可使用cofilin-R21Q-mRFP cDNA（质粒#51279）16。
    注：synapsin 1启动子是实现神经元特异性表达的优良选择15，而巨细胞病毒（cytomegalovirus）启动子则适用于在多种细胞类型中驱动高水平表达13。
  2. 通过共转染含有目的基因的转移质粒和rep/cap质粒，以及可选的辅助质粒至HEK293包装细胞中来制备AAV，该细胞可提供病毒E1基因，具体操作如前所述17,18。
    注：重组AAV也可用于实现目的基因在宿主细胞基因组中的靶向插入19。对于转移质粒，我们使用将人cofilin 1与C端mRFP1荧光蛋白标签融合的序列（质粒#50856），将其克隆至含有synapsin启动子的AAV质粒中，位于钙离子传感器GCaMP5G下游20。在转移质粒构建过程中，通过PCR插入一段编码P2A自剪切肽序列的DNA片段，位于GCaMP5G与cofilin-RFP之间，从而实现单个AAV转录本同时表达两种蛋白21。
  3. 通过共转染含有目的基因或cDNA及整合信号的转移质粒，以及第三代慢病毒包装混合物（将病毒gag、pol、rev和vsv-g基因分别分布于三个独立质粒上），制备重组慢病毒载体22,23。
  4. 对于转移质粒，使用一步克隆系统24，将synapsin启动子和cofilin-R21Q-mRFP cDNA（来自质粒#51279）组装至pLKO.1-GFP（质粒#30323）中，分别替换原有的hPGK启动子和GFP cDNA。
  5. 按照先前描述的方法23，通过磷酸钙法将最终质粒转染至HEK293T细胞中。
  6. 收集来自四个10 cm培养皿的培养基，使用150K截留分子量的离心浓缩器浓缩至500 µL，并在液氮中快速冷冻后，将最终的慢病毒分装保存于-80 °C。感染细胞时仅解冻一次。
  7. 通过设置多个不同脑片培养样本，使用不同体积的病毒感染后检测转基因表达水平，从而经验性地确定每种病毒所需用量，以达到预期的表达程度。
    注：通常每片脑片使用1–10 µL病毒。

6. 切片处理

  1. 用病毒感染脑片
    1. 在适用于该载体的生物安全等级的生物安全柜中操作，将一份病毒溶液（通常为 1–10 µL）与 0.8 mL 完全培养基混合。
    2. 使用无菌巴斯德吸管将脑片中的培养基吸出，并收集至含有漂白剂的收集瓶中。在第一个收集瓶与真空源之间必须使用二级收集瓶。
    3. 用上述制备的含病毒溶液替换原培养基，将培养管放回试管架，并置于培养箱中。
    4. 在生物安全柜中将脑片与病毒共同孵育 2–5 天后，使用无菌移液管移除含病毒的培养基，并将其转移至含有经批准的抗病毒试剂的瓶子中以灭活病毒。
  2. 使用活体染料对神经元染色
    1. 将荧光神经元活体染料25分装为每份 4 µL，在液氮中快速冷冻，浓度为 100 µM，并于 -20 °C 保存。染料避免反复冻融，仅限冻融一次。
    2. 为通过荧光显微镜观察神经元，将一份神经元活体染料解冻，并用完全 Neurobasal 培养基稀释至 4 mL（最终染料浓度为 100 nM）。
    3. 通过抽吸（若培养基含病毒则使用移液管）移除脑片中的培养基，替换为 0.8 mL 含 100 nM 神经元活体染料的培养基，然后将脑片放回培养箱中的滚筒装置。
    4. 脑片在含染料培养基中孵育 2 小时后，在生物安全柜中抽吸去除染料培养基，并替换为 0.8 mL 新鲜完全培养基。
      注意：脑片中神经元的活体染料标记需要数小时的孵育时间。首次成像通常在染色处理后 24 小时进行。尽管染料特异性地标记神经元，但存在背景荧光，该背景荧光在 2–3 天内逐渐减弱，从而获得更清晰的神经元图像。活体染料的荧光强度在 72 小时后开始下降。
    5. 若需长期观察脑片形态的变化，应每隔 7 天重新标记一次脑片。

7. 切片成像

  1. 在倒置显微镜下观察切片。为了获得最明亮的荧光成像效果，在成像前24小时，将培养基更换为不含酚红pH指示剂的完全Neurobasal A培养基。
    注意：本文所报告的实验中，切片在配备线性编码x、y载物台和压电z控制装置以及高灵敏度高分辨率数字相机的倒置转盘共聚焦荧光显微镜上进行观察。
  2. 将装有需成像切片培养物的试管从滚筒管装置转移到定制的试管支架（图5A），再将该支架置于载物台适配器（图5B）中，以保持盖玻片与物镜垂直，并在长时间间隔的重复成像过程中维持切片方向的一致性。
  3. 推动载物台适配器上的滑块紧贴试管，以固定试管位置（图5B）。通过定制载物台适配器内置的加热带和温控装置，在成像期间将切片温度维持在35 °C（图5C）。
    注意：试管支架、载物台适配器和加热装置的详细信息可通过以下网址获取：https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/。
  4. 使用低倍物镜（例如，4X）和明场透射照明，聚焦于切片下方的光刻网格图案（图6A）。在首次成像时，快速扫描整个切片，定位并记录需要高倍成像的不同区域编号（例如，海马（CA）1区、CA3区、齿状回（DG）、等）。
  5. 移动载物台至包含目标区域的第一个网格方格。切换至20X空气物镜，并定位一个参考标记（例如，刻蚀数字的尖端）（图6B）。
  6. 切换至更高倍数的物镜（40X或60X），定位参考标记，然后记录载物台的x和y坐标位置。移动载物台，找到附近的感兴趣视野，并记录它们相对于参考标记的x和y偏移量（图6B，箭头）。如有需要，可在其他网格区域重复此操作。
    注意：这些相对于参考标记的偏移量可在后续成像时精确定位同一盖玻片位置，即使在移除和重新安装试管或载物台适配器后，原始参考标记的x、y坐标发生变化。
  7. 使用显微镜物镜控制或压电载物台控制（如具备），在每个选定视野内采集图像Z轴层扫数据。
    注意：图像平面通常以0.5 µm至2 µm的间隔采集，具体取决于图像特征的大小和所需分辨率。构建高质量的三维图像要求图像特征跨越多个采集平面，因此要观察较小结构，需采用更小的层间间隔。
  8. 尽量缩短每一切片的总成像时间。
    注意：本文所报告的大多数成像过程均少于18分钟/切片。然而，我们曾对某些切片进行十次以上重复成像，甚至单次成像长达40分钟，均未观察到对切片长期存活产生明显损害。

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结果

为了确定标志点在随时间推移后重新定位同一视野中相同细胞的准确性，我们检测了生长在光蚀刻盖玻片上的脑片（图6A）。通过使用活细胞染料（100 nM，孵育2小时；不染色非神经元细胞）对神经元进行标记可视化，该染料会随着时间在不损伤细胞的情况下从神经元中逐渐消失25。我们在单个网格方格内识别出一个标志点（图6A, B），在标记后24小时找到一片被活细胞染料标记的神经元区域，记录该区域相对于标志点的x和y方向偏移位置（图6B），并使用60倍物镜连续4天重复采集该区域的共聚焦图像堆栈。图中展示了在相同位置采集的30 µm图像堆栈的最大投影图像（图6C–F）。尽管在4...

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讨论

本文所述的滚管法可用于脑组织切片的长期培养和高分辨率活体成像。在此应用的切片技术中，一个主要问题在于切片的安装与维持。盖玻片涂层虽可促进切片黏附，但会刺激神经突起的外延生长以及细胞从切片中迁移出来，从而导致切片变薄；因此，我们避免使用此类基质。通过3-氨丙基三乙氧基硅烷处理在玻璃表面引入氨基，可改善切片的黏附性，但盖玻片上鸡血浆过多或过少均可能导致黏附不良，进而造成切片丢失。血浆的适宜用量取决于培养脑切片的大小，因此大鼠海马切片所需的血浆量更大，因其面积约为小鼠脑切片的4倍。若切片下方血浆凝固过多，细胞与盖玻片之间的黏附将受到阻碍，此时使用纤溶酶处理会使切片松动，导致其移位或完全脱落。然而，凝块中血浆过少则可能导致切片在培养箱旋转培养的最初几天内丢失。在最近一项涉及39个切片的实验中，有3个切片丢失，但其中部分丢失可能源于切片制备过程中的机械损伤。尽管如此，我们通常会比实验所需数量多准备约50%的切片。培养过程中第二常见的问题是培养液从盖玻片密封处泄漏。若在固定盖玻片后未将其牢固按压至少1分钟，该问题会加剧。用拇指施加压力时产生的热量可能有助于完成密封。发生的泄漏通常源于盖玻片下方微小的气道，可在解剖显微镜下观察到。这类气道通常可通过延...

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 cm 培养皿底部VWR Scientific25384-326
十字头机械螺钉（#10-32）Ace Hardware2.5" 长，3/16" 直径
#10 平垫圈ACE Hardware
机械螺母（#10-32）ACE Hardware
橡胶护圈 ACE Hardware5/16" 厚；5/8" 孔径；1.125" 外径
聚乙烯管（5/16" 外径，3/16" 内径）ACE Hardware切成 1.8" 长度
#10 弹簧垫圈ACE Hardware
台式钻床，5 速 Ace HardwareProTech Model 1201
Nunclon Delta 平壁管VWR62407-076
钻头，3 mm、6 mm 和 15 mm Ace HardwareDiablo freud 品牌用于切割塑料的钻头。
木工钻头，1.5 cm 和 1 mmAce Hardware
1/4" 圆形木工锉Ace Harware
弹簧夹，16 mm 卡扣式Ace Hardware
万向头去毛刺工具，5"Ace Hardware26307
粘性硅胶片（Secure Seal）Grace Bio-Labs666581厚度 0.5 mm
6 mm 打孔器Office Max
12 mm 打孔器thepunchbunch.com
70% 乙醇
光刻法盖玻片，直径 12 mmBellco Glass, Inc.1916-91012
本生灯
无水乙醇
超纯水
3-氨基丙基三乙氧基硅烷Sigma-AldrichA3648
丙酮Sigma-Aldrich179124
#5 Dumont 镊子Fine Science Tools11251-30
McIlwain 组织切片机Ted Pella, Inc.10180
双刃剃须刀片Ted Pella, Inc.121-6
Whatman 滤纸VWR28450-182裁成直径 5.8 cm 的圆片
聚氯三氟乙烯（Aclar）Ted Pella, Inc.10501-10裁成直径 5.8 cm 的圆片
#21 外科刀片VWR Scientific25860-144
#5 Dumont 镊子Fine Science Tools11251-30
不锈钢刮勺，尖端渐细VWR82027-518
Gey's 平衡盐溶液Sigma-AldrichG9779 
 葡萄糖ThermoFisher Scientific15023-02125% (w/v) 溶液，经 0.2 mm 滤膜过滤除菌
鸡血浆Cocalico Biologicals30-0300-5L用无菌水重悬，4 °C 下以 2500 × g 离心 30 分钟，分装后迅速在液氮中冷冻，并于  -80 °C 保存。
外用凝血酶（牛源）PfizerThrombin-JMI用提供的稀释液配制成 1,000 国际单位/mL，分装后迅速在液氮中冷冻，并于 -80°C 保存。使用时稀释至 250 单位/mL。
细胞滚瓶系统Bellco BiotechSciERA
滚筒式培养箱FormaModel 3956
N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
青霉素/链霉素（100X）ThermoFisher Scientific15140122
200 mM 谷氨酰胺ThermoFisher Scientific25030081
葡萄糖ThermoFisher Scientific15023-02125% (w/v) 溶液，经 0.2 mm 滤膜过滤除菌
Neurobasal AThermoFisher Scientific10888-022 完全培养基：48 mL Neurobasal A，1 mL N21-MAX，0.625 mL 200 mM 谷氨酰胺，0.180 mL 25% 葡萄糖，0.250 mL 100 倍青霉素/链霉素。
第三代慢病毒包装系统Life TechnologiesK4975-00
159 K 截留分子量离心过滤器（Centricon）EMD Millipore
慢病毒克隆系统（InFusion）Clonetech
质粒 30323、50856、51279Addgene
神经元细胞活力染料（NeuO）Stemcell technologies1801仅解冻一次，分装为 4 µL 每份并迅速冷冻。-20 °C 保存
倒置显微镜OlympusIX83
显微镜物镜Olympus空气镜：4X、20X；油镜：40X、60X
转盘共聚焦系统YokagawaCSU22
显微镜 EMCCD 相机PhotometricsCascade II
线性编码（x,y）、压电 z 轴平顶载物台ASI
显微镜激光器及集成系统Intelligent Imaging Innovations
HEK293T 细胞美国模式培养物集存库（ATCC）CRL-3216
人纤溶酶Sigma AldrichP18670.002 U/mL 溶于含 0.1% 牛血清白蛋白的溶液中（经 0.2 mm 滤膜过滤除菌），分装后迅速在液氮中冷冻，并于 -80 °C 保存。

参考文献

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