整体透明化与染色 拟南芥 花器官与角果

摘要

在本实验方案中，我们介绍了正确解剖拟南芥花朵和角果的技术、一些基本的透明化方法，以及用于生殖结构整体观察的特定染色步骤。

摘要

由于其在分子遗传学研究中具有强大的工具，Arabidopsis thaliana 是植物生物学尤其是植物生殖生物学中最突出的模式物种之一。然而，传统的植物形态学、解剖学和超微结构分析通常需要耗时的包埋和切片步骤，以用于明场显微镜、扫描电镜和透射电镜观察。近年来，共聚焦荧光显微镜技术的进步、先进的三维计算机辅助显微分析方法，以及对经最少处理的整体样本所使用的分子技术的不断优化，使得开发高效且简化的样本处理技术的需求日益增加。在本实验方案中，我们介绍了正确解剖拟南芥花朵和角果的技术、基本的透明化方法，以及用于生殖结构整体观察的一些染色步骤。

引言

花是被子植物最重要的界定器官之一。开花植物大约在9000万至1.3亿年前出现¹，其快速多样化使得其突然出现曾被查尔斯·达尔文称为“"令人厌恶的谜团"”²。植物研究人员对花发育的研究兴趣广泛多样。一些研究集中于理解花作为一个整体的进化起源，或花特定解剖、结构和功能特性的演化过程^3,4,5,6。花形态与结构的高度变异，以及依赖于花的有性与无性繁殖方式，使花成为一种高度复杂的结构。这促使研究人员采用光学和电子显微技术，并结合遗传学与分子生物学手段，对花器官的解剖结构和形态特征进行多种表征尝试⁷。此外，作为果实和种子的来源，花对人类和动物营养具有至关重要的意义。因此，对花和果实发育过程的解析在应用研究中具有广泛意义，包括为不断增长的人口保障粮食安全，以及在环境变化背景下制定生态保护策略^8,9,10。

方案

1. 花朵和角果的固定

1. 在首朵花开放时同步采集植株的花和角果。
   注意：在本实验所用条件下，植株从Murashige和Skoog（MS）培养基平板移栽至土壤后约21天开始开花。种子在4 °C下层积处理3–4天，随后在22 °C、16小时光照/18 °C、8小时黑暗条件下于MS平板上萌发并生长8至10天，之后将幼苗移栽至盆中富含养分的土壤，并在相同环境条件下继续培养（图1）。重复次数取决于具体研究目的，但建议每处理至少使用5个花序（来自5株独立植株）。若以花为实验单位，建议每个重复至少包含10朵花。
2. 使用小型剪刀（例如，指甲剪）剪下花序或花（图1E-H），并立即放入含有新鲜配制的Carnoy固定液、甲醇/乙酸或FPA50固定液（根据应用选择，见下文）的微量离心管（用于单个花序/花固定）或锥形管（用于批量固定）中，并置于冰上。
   注意：样品应完全浸没于固定液中。
3. 将组织在固定液中于4 °C下固定4小时至过夜。
   注意：可采用真空渗透以加快固定液进入组织的速度，但这可能不利于组织结构的保存。作者未采用真空渗透法。
4. 移除固定液，加入足量70%乙醇覆盖样品，并于4 °C下保存至少24小时；样品可无限期保存于此溶液中。去除乙醇后应立即进行下一步操作，即解剖....

结果

拟南芥 属于十字花科，具有总状花序，花为两性花，排列成伞房状图1）。每朵花有四个萼片、四个花瓣、六枚雄蕊（四长两短），以及一个由两个合生心皮组成的合心皮雌蕊。图1F- H）排列成四个同心螺旋^25,26. 拟南芥 具有薄珠心、倒生胚珠，每室两列，以壁着胎座方式排列于子房的两个室中（每列12–20枚胚珠），每个子房共45–80枚胚珠（未发表数据及参考文献）^27,28,29,30）。为了在单株植物内或不同植物间（作为重复或.......

讨论

单个花序中存在多个花芽 拟南芥，涵盖花发育的所有阶段，为研究处理效应或发育特征在花发育不同阶段的同步表现提供了独特的机会。不同个体植株之间的良好参照点是主花序第一朵花的开放。植株应以尽可能同步开花的方式进行处理（例如，4 °C下层积处理3–4天可最大程度地实现种子同步萌发，从而获得更整齐的开花时间），仅将同一天开放第一朵花的植株作为同一批次用于不同处理和重复之间的分配；连续数天内准备就绪的批次可用于实验的重复。通过该流程，可进行更为可靠的比较分析，有效控制植株内外部环境与发育差异带来的影响。

结合卢戈氏碘液染色与Herr的透明溶液，不仅使透明样品的对比度较传统透明溶液有所提升，而且能够表征花和胚胎发育过程中淀粉的动态变化，这一点在最近关于Arabidopsis⁴⁶的研究中已有报道。通过这一简单方法，我们揭示了花药发育过程中存在新一轮的淀粉合成-降解波动，并将淀粉动态变化与编码参与糖和淀粉代谢蛋白的基因表达整体变化相关联。分析表明，GPT6是将细胞质中的糖磷酸转运至淀粉体以合成淀粉的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂与材料
乙醇	Scharlau	ET00102500
乙酸	Applichem	A3686,2500	100% 分子生物学级
冰乙酸	Sigma-Aldrich	320099	分子生物学级
甲醇	Scharlau	ME03062500
甲醛溶液	Sigma-Aldrich	F1635
丙酸	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
水合氯醛	Sigma-Aldrich	15307
甘油	Roth	3783.1
阿拉伯胶	Fluka	51198
乳酸	Fluka	69773
苯酚	Sigma-Aldrich	77607-250ML	我们使用液态苯酚（使用密度计算溶液所需体积）
丁香油	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
二甲苯	Roth	4436.1
碘	Fluka	57665
碘化钾	Merck	5043
孔雀石绿	Fluka	63160
酸性品红	Fluka	84600
橙黄G	Sigma	7252
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771	分子生物学级
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	71690
磷酸二氢钠	Applichem	A1047,1000
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
磷酸钾	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
卡氏荧光增白剂	Sigma	F6259	荧光增白剂28
金胺O	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	有毒
吐温X-100	Sigma	T8787
苯胺蓝	Merck	1275
MS培养基	Carolina	19-57030
营养丰富的基质	Einheitserde	ED73
钟表匠用玻璃片			无特定品牌
15 ml 离心管	VWR	62406-200
Dumont镊子	Actimed	0208-5SPSF-PS
镊子	DUMONT BIOLOGY	0108-5
注射器	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
制片针	BD	BD Microlance 304000
显微镜载玻片	Thermo Scientific	10143562CE	切边
盖玻片	Thermo Scientific	DV40008
湿盒			内含湿润纸巾和载玻片支撑架的塑料盒
名称	公司	目录编号	备注
溶液
固定液
卡诺氏（法默氏）固定液			无水乙醇 : 冰乙酸，3:1（ml:ml）
甲醇/乙酸固定液			50%（v/v）甲醇，10%（v/v）冰乙酸，溶于去离子水中
FPA50固定液			甲醛、丙酸、50%乙醇；5:5:90（ml:ml:ml）
透明液
水合氯醛/甘油			水合氯醛 : 甘油 : 水，8:1:2（g:ml:ml）。可用于所有花发育阶段及角果发育阶段的微分干涉差显微镜（DIC）观察。最佳固定液为基于甲醛的FPA50
改良Hoyer透明液			阿拉伯胶7.5 g，水合氯醛100 g，甘油5 ml，水30 ml。可用于所有花发育阶段及角果发育阶段的DIC观察。最佳固定液为基于甲醛的FPA50
Herr's 4½ 透明液			乳酸、水合氯醛、苯酚晶体、丁香油、二甲苯；按重量比2:2:2:2:1混合。可用于所有花发育阶段（尤其适用于雄蕊发育）及角果发育阶段的DIC观察。最佳固定液为基于甲醛的FPA50
SDS/NaOH溶液			将SDS和NaOH储备液稀释至1% SDS / 0.2 N NaOH（10倍稀释）。适用于花和角果发育的所有阶段。最佳固定液为甲醇/乙酸固定液；其他两种固定液也可使用。可与卡氏荧光增白剂、金胺O、DAPI和苯胺蓝染色液联合使用。
SDS储备液			10%（w/v）十二烷基硫酸钠。将10 g十二烷基硫酸钠溶于80 ml去离子水中，定容至100 ml。
NaOH储备液			2 N NaOH溶液：将4 g NaOH溶于40 ml去离子水中，定容至100 ml
透明与染色联合溶液
Herr's IKI-4½			在标准4½（共9 g）中加入：100 mg碘，500 mg碘化钾。该透明液可用于所有花发育阶段和角果发育阶段，既可用于增强对比度，也可用于淀粉动态的表征。结构分析使用FPA50固定液，定量淀粉分析使用卡诺氏固定液。
Alexander染色液			95%乙醇10 ml，孔雀石绿（1%溶于95%乙醇）1 ml，酸性品红（1%溶于ddH2O）5 ml，橙黄G（1%溶于ddH2O）0.5 ml，苯酚5 g，水合氯醛5 g，冰乙酸2 ml，甘油25 ml。该透明/染色液可单独使用或与Herr's 4½溶液联合使用，用于评估成熟花中三细胞花粉粒的花粉败育情况。适用于新鲜采集的未固定材料。
染色液
卡氏荧光增白剂溶液			卡氏荧光增白剂0.007%水溶液（g:ml）。最初用作光学增白剂。可用于染色细胞壁中的纤维素、羧化多糖和胼胝质。常用于花粉粒内壁的染色。三种固定液均可与此溶液配合使用。
金胺O溶液			金胺O 0.01%水溶液（g:ml）。该亲脂性荧光染料可用于角质层、角质和外壁等结构的染色。三种固定液均可与此溶液配合使用
卡氏荧光增白剂-金胺O混合液			金胺O溶液 : 卡氏荧光增白剂溶液，3:1。可用于两种染料的联合染色。其他比例也可尝试，但卡氏荧光增白剂的比例应小于金胺O。
DAPI溶液			DAPI 0.4 μg/ml，0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7），0.1%吐温X-100，1 mM EDTA。该溶液可用于雄性和雌性减数分裂过程中的染色体铺展以及任何组织的细胞核染色。常用于花粉粒发育的研究。卡诺氏固定液和甲醇/乙酸固定液是此溶液的最佳固定液。基于甲醛的固定液（如FPA50）可能干扰染色。紫外激发，最大发射波长约461 nm。
磷酸钠缓冲液（0.1 M）			质子受体：0.2 M Na2HPO4，质子供体：0.2 M NaH2PO4，质子供体/质子受体比例：1.364（pH 7）
苯胺蓝溶液			0.1%（w/v）苯胺蓝，108 mM K3PO4（pH 11），2%甘油。该溶液可用于多个发育阶段的胼胝质和纤维素染色（例如雄性和雌性四分体中的胼胝质沉积、花粉管中的胼胝质栓）。紫外激发，最大发射波长约455 nm。也可在514 nm激发，产生红色发射，用于细胞内容物染色。