高通量并行测序检测适应性 问号钩端螺旋体 转座子插入突变体在金黄叙利亚仓鼠感染过程中的研究

摘要

我们在此介绍一种将转座子诱变与高通量测序相结合的技术，用于在仓鼠攻毒后鉴定并定量组织中的转座子钩端螺旋体突变株。该方案可用于筛选突变株在动物体内的存活与播散能力，也可应用于 体外 研究。

摘要

在本文中，我们描述了一种转座子测序（Tn-Seq）技术，用于鉴定和定量 问号钩端螺旋体 在感染金黄叙利亚仓鼠期间适合度发生变化的突变株。Tn-Seq 技术结合了随机转座子诱变与高通量测序技术的优势。将转座子突变株混合物（输入池）接种至动物体内，数天后采集血液和组织样本，以鉴定并定量各器官中突变株的数量（输出池）。通过将输出池与输入池进行比较，评估突变株的适合度变化 体内 每个突变株的适应性。该方法能够在有限数量的动物中筛选大量突变株库。经过少量修改后，本方案可适用于任何钩端螺旋体病动物模型，包括储存宿主模型（如大鼠）和急性感染模型（如仓鼠），以及 体外 研究。Tn-Seq 提供了一种强大的工具，用于筛选具有特定表型的突变体 体内 和 体外 适合度缺陷

引言

对于某些细菌（如钩端螺旋体属 Leptospira spp.）而言，由于可用的遗传工具有限，致病基因的鉴定较为困难。一种常用的方法是通过随机转座子诱变构建突变体文库，随后确定每个突变体中转座子的插入位点，并在动物模型中对各个转座子突变体进行致病性检测。该方法耗时长、成本高，且需要使用大量实验动物。

当随机诱变技术首次被开发用于病原体时 问号钩端螺旋体通过在动物模型中测试单个突变株，鉴定了与毒力相关的基因¹根据突变体在信号传导或运动性中的潜在作用，或其定位于外膜或细胞表面的预测结果进行筛选。由于大多数钩端螺旋体 基因编码功能未知的假定蛋白质²根据这些标准筛选突变体，会限制发现新的钩端螺旋体毒力基因的能力。

最近，研究人员利用仓鼠和小鼠模型对L. interrogans转座子突变株文库进行了感染性筛选³。每只动物接种一个包含多达10种突变株的混合文库。若通过血液和肾脏培养物的PCR检测到某突变株，则判定其具有感染性。由于需要对文库中的每种突变株分别进行PCR反应，该方法耗时费力。此外，由于未对培养物中各突变株的频率进行定量，该策略倾向于识别出高度减毒的突变株。

方案

警告：致病性钩端螺旋体（Leptospira spp.）菌株必须在生物安全二级（BSL-2）防护条件下操作。必须穿戴适当个人防护装备（PPE）。所有对致病性钩端螺旋体（Leptospira spp.）的操作均须在II级生物安全柜中进行。

1. 转座子突变文库的构建¹⁵

1. 转座子的转移 钩端螺旋体 spp. 通过接合作用（图1)
   1. 接种一定体积的处于对数生长期的病原菌培养物 钩端螺旋体 spp. 对应于 10⁷ 将细胞接种于10 mL Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris培养基（EMJH）中^18,19. 37°C 培养 30 °C 以150 rpm振荡至密度达到2 - 8 x 10⁸ cells/mL
      注意：致病性钩端螺旋体的倍增时间为 12 至 24 h，具体取决于菌株。
   2. 接种 50 µL 供体的 Esche....

结果

通过接合方式构建L. interrogans转座子突变体文库需要使用过滤装置，如图1所示。每次接合反应可获得100至200个接合子。

通过半随机PCR扩增转座子末端及其邻近宿主序列，对每个突变体中产生的PCR产物进行测序，以确定转座子插入位点¹⁵ (图2A）。半随机PCR结果的一个示例如下所示 图2B在大多数情况下，使用 Deg1 和 Tnk1 引物进行第一轮 PCR，以及使用 Tag 和 TnkN1 引物进行第二轮 PCR 时，会观察到一条主导扩增条带。然而，由于五聚体序列的特异性较低（…N₁₀在Deg1引物的3'端包含简并序列（GATAT-3'），该引物将在钩端螺旋体基因组.......

讨论

尽管我们已展示了通过腹腔接种42株L. interrogans突变株的仓鼠初步实验结果¹⁷，但我们预计可通过Tn-Seq技术筛选更大规模的突变株库。由于接合子的频率较低（每次接合产生100–200个接合子），需要进行多次接合反应才能获得足够数量的突变株用于大规模Tn-Seq实验。在液体培养基中维持大量突变株会带来操作上的挑战，需加以解决。可使用深孔96孔板进行培养。培养物的密度可通过分光光度计在420 nm波长下测定光密度进行监测。所需动物数量的确定部分取决于输入菌株库的规模，必须通过功效分析来确定。对于大规模实验，我们建议在生物统计学家的指导下进行功效分析。

瓶颈效应可能影响从输出池中回收随机突变体的效率。尽管在我们的初步研究中未观察到严重的瓶颈效应¹⁷（图7），但大规模实验仍可能受到突变体随机丢失的影响。通过增加输入池中每个突变体的细胞数量以提高挑战剂量，可最大限度地降低出现瓶颈效应的可能性

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
来自Streptomyces kanamyceticus的硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	K4000
2,6-二氨基庚二酸	Sigma-Aldrich	D1377
盐酸二水 Spectinomycin 五水合物	Sigma-Aldrich	S4014
配备暗场聚光镜的 Axio Lab A1 显微镜	Zeiss	490950-001-000
DNeasy 血液与组织试剂盒	Qiagen	69504/69506
MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004/28006
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104/28106
Model 505 超声破碎仪	Fisher Scientific	FB-505
2.5" 杯状探头	Fisher Scientific	FB-4625
Bead Ruptor 24	Omni International	19-010	第 3.1.2.4 步
末端脱氧核苷酸转移酶	Promega	M828C
Phusion 主混合液	Thermo Scientific	F531	基因组文库制备，第 3.4 步
DreamTaq 主混合液	Thermo Scientific	K9011/K9012	转座子插入位点鉴定，第 1.2 步
dCTP	Thermo Scientific	R0151
ddCTP	Affymetrix/USB Products	77112
T100 梯度 PCR 仪	BioRad	1861096
Qubit 2.0 荧光计	Invitrogen	Q32866	第 3.6 步
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen	Q32851/Q32854	第 3.6 步
Qubit 检测管	Life Technologies	Q32856	第 3.6 步
PBS pH 7.2 (1X)	Gibco	20012-027 20012-050
一次性手术刀 No10	Feather	2975#10
塑料 K2 EDTA 2 ml 采血管	BD vacutainer	367841
带 26G x ½” 针头的 U-100 注射器	BD vacutainer	329652	腹腔注射攻毒，第 2.2.1 步
3 mL 带鲁尔锁扣针头的注射器	BD vacutainer	309657	心脏穿刺，第 2.4.2 步
25G X 5/8” 针头	BD vacutainer	305901	心脏穿刺，第 2.4.2 步
带塞子的 25 mm 烧结玻璃底座	EMD Millipore	XX1002502	过滤装置系统，第 1.1.7 步
25 mm 铝制弹簧夹	EMD Millipore	XX1002503	过滤装置系统，第 1.1.7 步
15 ml 硼硅酸盐玻璃漏斗	EMD Millipore	XX1002514	过滤装置系统，第 1.1.7 步
125 ml 带侧管的锥形瓶	EMD Millipore	XX1002505	过滤装置系统，第 1.1.7 步
醋酸纤维素滤膜 VVPP（孔径 0.1 mm；直径 25 mm）	EMD Millipore	VVLP02500