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方法文章

一种基于显微CT与荧光分子断层成像的多模态成像方法用于小鼠博来霉素诱导肺纤维化的纵向评估

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DOI：

10.3791/56443

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2018年4月13日

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1Corporate Preclinical R&D, Chiesi Farmaceutici S.p.A., 2Department of Veterinary Science, University of Parma, 3Department of Molecular Genetics, Erasmus MC, 4Department of Molecular Genetics, Vascular Surgery, Radiation Oncology, Erasmus MC, 5Fluidda NV

本文内容

摘要

我们介绍一种基于显微CT和荧光分子断层成像的非侵入性多模态成像方法，用于对通过两次气管内滴注博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行纵向评估。

摘要

特发性肺纤维化（IPF）是一种致命性肺部疾病，其特征是肺组织结构进行性且不可逆地破坏，导致肺功能显著恶化，并最终因呼吸衰竭而死亡。

在实验动物模型中，特发性肺纤维化（IPF）的发病机制可通过博来霉素给药诱导产生。本研究探讨通过两次气管内滴注博来霉素建立类似IPF的小鼠模型。目前用于研究肺纤维化的标准组织学评估方法属于侵入性终末实验操作。本研究的目标是通过非侵入性成像技术，如荧光分子断层成像（FMT）和微型计算机断层扫描（Micro-CT），对肺纤维化进行监测。若这两种技术的检测结果能与组织学发现相互验证，则有望成为实时、无创评估IPF疾病严重程度与进展的革命性功能学方法。多种技术的融合应用为进一步理解IPF疾病提供了新途径：FMT可用于观察病理状态下发生的分子事件，而后续的解剖结构变化则可通过Micro-CT进行追踪监测。

引言

特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性肺部疾病，其肺功能呈进行性下降，不幸的是，多数患者在确诊后四年内死亡1。IPF的主要特征是细胞外基质沉积和成纤维细胞增殖，但其发病机制尚未完全阐明。目前最受支持的假说是，反复发生的肺损伤导致肺泡上皮细胞破坏，进而引起间充质细胞周期增殖异常、成纤维细胞和肌成纤维细胞过度积聚以及基质生成增加。参与这些过程的介质，如基质金属蛋白酶（MMPs），已在人类IPF患者或博来霉素诱导的动物模型的纤维化发展中被发现存在表达失调。不受控制的MMP产生会导致肺间质和肺泡腔内胶原沉积失衡，模拟异常的伤口修复过程1,2。

药物发现与开发的主要障碍之一是缺乏能够模拟人类发病机制和疾病表型的可及性小鼠模型。已有多种方法用于在动物模型中诱导肺纤维化，包括辐射损伤、石棉和二氧化硅暴露、促纤维化细胞因子以及博来霉素的给药3,4；然而，博来霉素在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔5以及大型动物（非人灵长类、马、犬和反刍动物）6,7中应用最为广泛。博来霉素是由轮枝链霉菌（Streptomyces verticillus）产生的一种抗生素8，临床上用作抗肿瘤药物9。肺纤维化是该药物常见的副作用，因此被用于实验性动物模型中以诱导肺纤维化的发生。

在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，纤维化病变通常在给予博来霉素后14至21天出现。在本研究中，我们采用了一种新的方案，通过两次经气管滴注博来霉素在小鼠中诱导肺纤维化。博来霉素小鼠模型耗时较长，因为新药需要在已形成的纤维化病变上进行评估，并需验证其抗纤维化作用与抗炎作用的区别。

胶原蛋白含量的生化测定、形态计量学和组织学分析均基于死后分析，限制了在同一动物体内追踪疾病发病过程的可能性。尽管这些参数被视为纤维化评估的金标准，但它们无法提供纤维化病变的时间或空间分布信息，也无法用于研究疾病进展的过程。10

近年来，非侵入性成像技术已被用于监测小鼠模型中气道重塑、炎症及纤维化进展：磁共振成像（MRI）、微型计算机断层扫描（Micro-CT）、荧光分子断层成像（FMT）和生物发光成像（BLI）11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。我们提出一种非侵入性成像方法，通过在博来霉素刺激后不同时间点进行FMT和Micro-CT扫描，对肺纤维化进展进行纵向监测22。

许多信号通路参与了纤维化的建立与发展，但目前对此了解尚浅。只有更深入地理解这些过程，才可能转化为更多的药物靶点，并进一步应用于临床。未来，通过荧光分子断层成像技术对基质金属蛋白酶（MMP）活化进行纵向监测，同时结合显微CT检测肺实质结构变化，或可用于评估临床治疗反应。

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方案

本文所述所有动物实验均经Chiesi Farmaceutici和ERASMUS MC机构内动物福利委员会批准，批准编号：EMC 3349（138-14-07），符合欧盟指令2010/63/UE、意大利D.Lgs 26/2014及修订版 "实验动物护理和使用的指南"23.

注意：使用前，将雌性近交系 C57Bl/6（7-8 周龄）小鼠在本单位动物饲养室条件下适应至少 7 天（室温：20-24 °C；相对湿度：40-70%；12 小时光照-黑暗循环），可自由摄取标准啮齿类饲料和软化自来水。

1. 博来霉素气管内治疗小鼠

  1. 准备气管内滴注所需的设备12,13,14.
  2. 将小鼠放入与异氟烷挥发器相连的麻醉舱内，异氟烷浓度设定为2.5%，以氧气作为混合气体。通过夹捏脚趾无反应判断麻醉深度。麻醉作用在3–5分钟后起效。
  3. 将麻醉后的小鼠置于插管平台上，使其门齿钩住金属丝，呈悬吊状态。
  4. 打开喉镜，取一把钝头镊子，用镊子或喉镜的尖端轻轻张开口腔。
  5. 拉出舌头并用镊子将其固定于一侧。将喉镜片移至口腔后部，直至看到气管开口，并保持喉镜位置不动。
  6. 用另一只手将连接在聚乙烯导管末端的输送管插入气管，同时旋转三通阀。注入50 µL博来霉素（每只小鼠0.020 µg）。灌注后，迅速将导管从气管中拔出，以防窒息。将小鼠保持直立姿势数秒钟。
    1. 第0天和第4天经气管内给予博来霉素图1).
  7. 将小鼠从插管平台移开，并监测小鼠30分钟（此为完全从麻醉中恢复所需的时间）。
  8. 执行 体内 在第7、14和21天两次滴注博来霉素后，通过FMT和Micro-CT对小鼠肺部进行成像。

2. 体内 荧光分子断层成像

注意：提前在生理盐水（0.9% 氯化钠）中配制新鲜的 MMP 敏感性荧光底物 680 储备液（浓度为 6 nmol/mL），避光保存于 4 °C，使用前取出。该储备液在 4 °C 下可稳定保存长达 6 个月。在注射入动物体内前，需将 MMP 成像试剂平衡至室温。

  1. 探针注射
    1. 准备用于静脉注射MMP探针溶液的设备。预先将水加热至50 °C，用于加热小鼠尾巴。
    2. 牢固抓住小鼠颈背部皮肤，一手持尾并让其抓握笼盖。将小鼠固定于肩部位置，将尾巴浸入温水烧杯中，持续4至最多8秒，以造成热损伤但避免尾部皮肤过度烫伤。 观察尾静脉是否膨胀，以便更清晰地识别血管并进行穿刺。
    3. 在注射过程中，将小鼠放入塑料固定器中以保持稳定，并将尾巴从后方的专用孔中拉出。找到位于尾巴两侧的两条尾静脉；注意不要误穿位于尾腹侧的动脉。
    4. 将1 mL注射器上的针头（26G）插入静脉。若针头位置正确，推注应顺畅，探针溶液可顺利进入血管。
    5. 以10 mL/kg剂量注射MMP探针溶液。
    6. 丢弃针头。
      注意：MMP探针注射后24小时为最佳成像时间点，因为这是探针被激活所需的时间。若进行纵向研究，建议在7天后再次注射，以确保探针试剂已从小鼠体内完全清除。
  2. FMT成像
    注意：开始前，务必去除动物待成像区域及其周围的毛发（本实验中为胸部），以避免组织对光的散射和吸收。
    1. 将小鼠放入麻醉舱中，调节异氟烷旋钮至2.5%用于诱导麻醉，维持麻醉时调整为2%。
    2. 启动数据采集软件，并在数据库中为本次实验创建新的研究项目。
    3. 在开始FMT成像前，将小鼠转移至成像盒中。将麻醉后的小鼠置于成像盒中央，以充分利用FMT系统的视场范围。保持小鼠体位平直、固定稳妥，并轻柔地压紧在成像盒的两个窗口之间。通过调节成像盒上的旋钮调整高度，然后将其滑入对接站。
    4. 在扫描界面中点击受试者，然后点击预览以查看实时图像。
    5. 绘制足够大的扫描区域，确保覆盖预期荧光区域周围的组织。总共包含25个扫描点可保证肺部区域被完整扫描。
    6. 绘制完感兴趣区域（ROI）后，先点击添加到重建队列，然后点击扫描以对小鼠进行成像。确保选择正确的680 nm激光。
    7. 图像采集完成后，将小鼠放回笼中，并确保其完全从麻醉状态恢复。
    8. 在分析软件的分析窗口中，使用ROI工具量化皮摩尔级别的荧光信号，围绕来自肺部区域的信号将ROI缩小至约700–800 mm3。注意排除肝脏信号的干扰。将同一ROI复制到其他受试动物图像中，使其尺寸一致，并根据每只动物图像调整其位置。
    9. 将图像导出为jpg格式文件。

3. 体内 微型计算机断层扫描成像

警告：开始之前，务必移除成像区域附近的任何金属首饰或金属物品，以避免 X 射线散射。

注意：放射性肺纤维化是放射性肺损伤中的常见发现24。在接受生理盐水处理的对照组小鼠中，于第21天进行四次微型CT成像后，未观察到与肺纤维化相关的微型CT衍生指数或组织学改变，表明微型CT检查过程中对动物施加的X射线剂量不足以影响实验结果。

  1. 按下绿色的电源按钮启动 Micro-CT，并运行软件以预热 X 射线源。使用小孔径和动物床进行小鼠成像。
  2. 通过点击新建数据库创建新数据库，并根据实验中小鼠的数量建立浏览器；或点击连接到现有数据库，将数据保存至先前创建的数据库中。
  3. 开始扫描前，在软件控制窗口中选择采集参数：X 射线管电压 90 kV；CT X 射线管电流 160 µA；实时 X 射线管电流 80 µA；视场（FOV）36 mm；不使用门控技术；扫描模式选择高分辨率 4 分钟。
  4. 通过吸入 3% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并将其放置在插入孔径内的动物床上，鼻罩持续供给麻醉气体。用胶带将小鼠的四肢固定在床面上，以便暴露胸部。
  5. 滑动仪器门并按下采集按钮，开启实时模式以实时观察小鼠位置。使用 CT 仪器上的按钮移动动物床，使胸部与视场（FOV）对齐。以小鼠为中心进行扫描；若未对准，可使用 CT 仪器上的左右箭头调整位置。
  6. 通过选择90°并点击设置，确认最佳床位位置。确保待成像区域完全位于视场（FOV）内。
  7. 不采用任何门控技术，点击CT 扫描按钮开始扫描。当提示 X 射线源将被开启时，点击是。
    注意：X 射线开启后，仪器顶部的橙色指示灯将亮起，滑动门出于操作者安全考虑将无法打开。扫描完成后，2D Viewer 软件的新窗口将自动弹出，显示重建后的横断面、冠状面和矢状面切片图像。
  8. 检查图像质量，确保未因麻醉深度不足导致动物移动而产生模糊图像。如有必要，重新进行扫描。
  9. 将动物放回笼中，并确保其完全从麻醉中恢复。

4. 支气管肺泡灌洗

  1. 用3%异氟烷麻醉动物，并通过腹主动脉放血处死。
  2. 使用剪刀暴露胸腔和颈部，然后暴露气管并做一小切口，以便使用连接1 mL无针注射器的21号灌洗管进行支气管肺泡灌洗（BAL）操作。注意不要切断气管。
  3. 进行BAL时，将1 mL无针注射器吸取0.6 mL无菌溶液［10倍浓度的Hank's平衡盐溶液（HBSS）；100 mM乙二胺四乙酸（EDTA）；1 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）；蒸馏水］。
  4. 将灌洗管插入气管切口，缓慢推注并回抽溶液3次，在第三次回抽时暂停片刻，以充分收集支气管肺泡灌洗液（BALF）用于后续分析。

5. 组织学与组织形态计量学

  1. 暴露并取出肺组织，通过气管插入套管，缓慢注入0.6 mL 10%中性缓冲甲醛溶液进行肺灌注固定，随后将样本于室温下保存24小时。
  2. 使用自动组织处理机，将样本依次通过浓度递增的酒精溶液进行脱水处理（60%乙醇1小时，70%乙醇1小时，90%乙醇1小时，95%乙醇2小时，100%乙醇2小时）。
  3. 将组织样本置于二甲苯中处理2小时以使其透明；脱水结束后，在60 °C条件下用石蜡浸润3小时，并在自动组织处理机中完成包埋。
  4. 使用旋转式切片机获取厚度为5 µm的连续切片。
  5. 将切片经梯度乙醇脱蜡并水化，随后使用自动组织处理机进行Masson三色染色。
  6. 手动对肺组织切片进行聚焦，利用切片扫描仪在20倍放大倍数下进行扫描，并通过观察软件以451 nm/像素的分辨率采集整张肺组织切片的数字图像。
  7. 通过以下半定量与定量参数对肺纤维化损伤进行形态学评估：
    1. 确定Ashcroft评分。根据Ashcroft10提出并由Hübner et al.25改良的评分标准，对肺组织切片中的形态学改变进行半定量分级。采用0–8分评分系统，评估肺切片中全部肺实质的纤维化程度。
    2. 测定胶原含量。使用显微图像分析软件对纤维化程度10,25进行定量分析。每张切片在10倍放大倍数下随机选取三个感兴趣区域（ROI）。通过标准化颜色阈值设置，识别染成绿色的胶原区域。
    3. 测定肺泡气腔面积。将肺泡气腔面积作为纤维化的间接参数进行量化10,25。使用与纤维化区域分析相同的软件及ROI，通过设定白色阈值，检测ROI内的气腔区域。

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结果

单次博来霉素给药后三周观察到肺纤维化病灶的自发性缓解及中度结构改变，凸显了该模型的局限性。由于治疗时间窗狭窄，仅能进行预防性治疗，无法模拟临床实践。17.

在此，我们证明了采用两次气管内滴注博来霉素的实验方案可在小鼠中诱导出持久的肺纤维化18。实验设计见图119,20,21。本研究旨在利用无创成像技术观察小鼠肺纤维化的进展过程。博来霉素通过气管内给药两次（分别在第0天和第4天；每次50 µL溶液中含1 mg/kg博来霉素）。对照组每组12只小鼠，在与博来霉素组相同的时间点，仅气管内给予相同体积的溶剂。为评估纤维化程...

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讨论

尽管许多研究团队致力于开发治疗特发性肺纤维化（IPF）的新药物，但目前仅有两种药物可供患者使用。由于只有肺移植能够延长4-5年的生存期26，因此迫切需要寻找更有效的治疗方法7。转化医学和新药研发的基本前提是拥有能够模拟IPF特征、且干预研究结果可预测临床疗效的动物模型。然而，现有肺纤维化动物模型的有效性仍存在争议27。我们开发了一种新的肺纤维化小鼠模型，该模型需要按照图118所述进行两次博来霉素滴注。成像技术是可视化疾病进展和药物治疗反应的有力工具。该动物模型能更好地再现人类IPF的特征，且无创技术可在临床前研究与临床实践之间建立桥梁27。

然而，为了获得可靠且可重复的数据，某些步骤至关重要。气管内灌注必须在小鼠完全麻醉的状态下，采用标准化操作程序进行。微计算机断层扫描（Micro-CT...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

作者谨此感谢 Daniela Pompilio 博士和 Roberta Ciccimarra 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FMT 2500 荧光断层成像系统Perkin Elmer Inc.Experimental Builder
MMPsense 680Perkin Elmer Inc.NEV10126避光保存，探针储存于 4 °C
TrueQuant 软件Perkin Elmer Inc.
雌性近交系 C57BL/6 小鼠San Pietro NatisoneHorst, 荷兰（UD）, 使用前，动物需在本单位实验动物房条件下适应至少 5 天
异氟烷ESTEVE spa571329.8避免吸入
自动细胞计数仪Dasit XT 1800JExperimental Builder
生理盐水，0.9% 氯化钠（NaCl）Eurospital15A2807
Quantum FX 显微 CT 扫描仪 Perkin Elmer Inc.
链球菌素青霉素 V 来源的博来霉素硫酸盐 Sigma B2434 
全自动组织处理仪 ATP700 Histo-Line LaboratoriesATP700 
包埋系统 EG 1160 Leica BiosystemsEG 1160
旋转式切片机 Slee Cut 6062
数字切片扫描仪 NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR 图像分析软件 Nikon
Masson’s 三色染色试剂Histo-Line Laboratories
10% 中性缓冲福尔马林SigmaHT5012-1CS
Penn-century DP-4M 型干粉喷雾器Penn-centuryDPM-EXT
PE190 微型医用导管2biological instruments sncBB31695-PE/8
5 mL 无针头注射器TerumoSS*05SE1用剪刀剪去活塞的端部
Hamilton 0.10 mL（型号 1710）Gastight81022
Discofix 三通阀Braun4095111
1 mL 带针头注射器Pic solution3,071,260,300,320使用时去除针头
塑料喂养管 18 号 × 50 mm2biological instruments sncFTP-18-50将管尖斜向剪切 

参考文献

  1. Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
  2. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
  3. Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
  4. Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
  5. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
  6. Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
  7. Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81(2015).
  8. Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
  9. Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
  10. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
  11. Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251(2015).
  12. Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226(2016).
  13. Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716(2012).
  14. Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8(2014).
  15. Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
  16. Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009(2016).
  17. Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
  18. Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199(2017).
  19. Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340(2017).
  20. Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
  21. Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8(2017).
  22. Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336(2015).
  23. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , National Research Council. Washington DC. (2011).
  24. Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
  25. Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
  26. King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
  27. De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123(2012).

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