我们介绍一种基于显微CT和荧光分子断层成像的非侵入性多模态成像方法，用于对通过两次气管内滴注博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行纵向评估。
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本文内容
摘要
摘要
特发性肺纤维化（IPF）是一种致命性肺部疾病，其特征是肺组织结构进行性且不可逆地破坏，导致肺功能显著恶化，并最终因呼吸衰竭而死亡。
在实验动物模型中，特发性肺纤维化（IPF）的发病机制可通过博来霉素给药诱导产生。本研究探讨通过两次气管内滴注博来霉素建立类似IPF的小鼠模型。目前用于研究肺纤维化的标准组织学评估方法属于侵入性终末实验操作。本研究的目标是通过非侵入性成像技术，如荧光分子断层成像（FMT）和微型计算机断层扫描（Micro-CT），对肺纤维化进行监测。若这两种技术的检测结果能与组织学发现相互验证，则有望成为实时、无创评估IPF疾病严重程度与进展的革命性功能学方法。多种技术的融合应用为进一步理解IPF疾病提供了新途径：FMT可用于观察病理状态下发生的分子事件，而后续的解剖结构变化则可通过Micro-CT进行追踪监测。
引言
特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性肺部疾病，其肺功能呈进行性下降，不幸的是，多数患者在确诊后四年内死亡1。IPF的主要特征是细胞外基质沉积和成纤维细胞增殖，但其发病机制尚未完全阐明。目前最受支持的假说是，反复发生的肺损伤导致肺泡上皮细胞破坏，进而引起间充质细胞周期增殖异常、成纤维细胞和肌成纤维细胞过度积聚以及基质生成增加。参与这些过程的介质，如基质金属蛋白酶（MMPs），已在人类IPF患者或博来霉素诱导的动物模型的纤维化发展中被发现存在表达失调。不受控制的MMP产生会导致肺间质和肺泡腔内胶原沉积失衡，模拟异常的伤口修复过程1,2。
药物发现与开发的主要障碍之一是缺乏能够模拟人类发病机制和疾病表型的可及性小鼠模型。已有多种方法用于在动物模型中诱导肺纤维化，包括辐射损伤、石棉和二氧化硅暴露、促纤维化细胞因子以及博来霉素的给药3,4；然而，博来霉素在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔5以及大型动物（非人灵长类、马、犬和反刍动物）6,7中应用最为广泛....
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方案
本文所述所有动物实验均经Chiesi Farmaceutici和ERASMUS MC机构内动物福利委员会批准，批准编号：EMC 3349（138-14-07），符合欧盟指令2010/63/UE、意大利D.Lgs 26/2014及修订版 "实验动物护理和使用的指南"23.
注意：使用前，将雌性近交系 C57Bl/6（7-8 周龄）小鼠在本单位动物饲养室条件下适应至少 7 天（室温：20-24 °C；相对湿度：40-70%；12 小时光照-黑暗循环），可自由摄取标准啮齿类饲料和软化自来水。
1. 博来霉素气管内治疗小鼠
- 准备气管内滴注所需的设备12,13,14.
- 将小鼠放入与异氟烷挥发器相连的麻醉舱内，异氟烷浓度设定为2.5%，以氧气作为混合气体。通过夹捏脚趾无反应判断麻醉深度。麻醉作用在3–5分钟后起效。
- 将麻醉后的小鼠置于插管平台上，使其门齿钩住金属丝，呈悬吊状态。
- 打开喉镜，取一把钝头镊子，用镊子或喉镜的尖端轻轻张开口腔。
- 拉出舌头并用镊子将其固定于一侧。将喉镜片移至口....
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结果
单次博来霉素给药后三周观察到肺纤维化病灶的自发性缓解及中度结构改变，凸显了该模型的局限性。由于治疗时间窗狭窄，仅能进行预防性治疗，无法模拟临床实践。17.
在此，我们证明了采用两次气管内滴注博来霉素的实验方案可在小鼠中诱导出持久的肺纤维化18。实验设计见图119,20,21。本研究旨在利用无创成像技术观察小鼠肺纤维化的进展过程。博来霉素通过气管内给药两次（分别在第0天和第4天；每次50 µL溶液中含1 mg/kg博来霉素）。对照组每组12只小鼠，在与博来霉素组相同的时间点，仅气管内给予相同体积的溶剂。为评估纤维化程.......
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讨论
尽管许多研究团队致力于开发治疗特发性肺纤维化（IPF）的新药物，但目前仅有两种药物可供患者使用。由于只有肺移植能够延长4-5年的生存期26，因此迫切需要寻找更有效的治疗方法7。转化医学和新药研发的基本前提是拥有能够模拟IPF特征、且干预研究结果可预测临床疗效的动物模型。然而，现有肺纤维化动物模型的有效性仍存在争议27。我们开发了一种新的肺纤维化小鼠模型，该模型需要按照图118所述进行两次博来霉素滴注。成像技术是可视化疾病进展和药物治疗反应的有力工具。该动物模型能更好地再现人类IPF的特征，且无创技术可在临床前研究与临床实践之间建立桥梁27。
然而，为了获得可靠且可重复的数据，某些步骤至关重要。气管内灌注必须在小鼠完全麻醉的状态下，采用标准化操作程序进行。微计算机断层扫描（Micro-CT.......
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
作者谨此感谢 Daniela Pompilio 博士和 Roberta Ciccimarra 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FMT 2500 荧光断层成像系统 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | 避光保存，探针储存于 4 °C |
| TrueQuant 软件 | Perkin Elmer Inc. | ||
| 雌性近交系 C57BL/6 小鼠 | San Pietro NatisoneHorst, 荷兰（UD）, | 使用前，动物需在本单位实验动物房条件下适应至少 5 天 | |
| 异氟烷 | ESTEVE spa | 571329.8 | 避免吸入 |
| 自动细胞计数仪 | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| 生理盐水，0.9% 氯化钠（NaCl） | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX 显微 CT 扫描仪 | Perkin Elmer Inc. | ||
| 链球菌素青霉素 V 来源的博来霉素硫酸盐 | Sigma | B2434 | |
| 全自动组织处理仪 | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| 包埋系统 | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| 旋转式切片机 | Slee Cut 6062 | ||
| 数字切片扫描仪 | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR 图像分析软件 | Nikon | ||
| Masson’s 三色染色试剂 | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century DP-4M 型干粉喷雾器 | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 微型医用导管 | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| 5 mL 无针头注射器 | Terumo | SS*05SE1 | 用剪刀剪去活塞的端部 |
| Hamilton 0.10 mL（型号 1710） | Gastight | 81022 | |
| Discofix 三通阀 | Braun | 4095111 | |
| 1 mL 带针头注射器 | Pic solution | 3,071,260,300,320 | 使用时去除针头 |
| 塑料喂养管 18 号 × 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | 将管尖斜向剪切 |
参考文献
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B.
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重印与许可
