我们提出了一种便捷的固相萃取联合高效液相色谱（HPLC）电化学检测（ECD）方法，用于同时测定婴儿尿液中三种单胺类神经递质及其两种代谢物。我们还鉴定出代谢物MHPG可作为婴儿脑损伤早期诊断的潜在生物标志物。
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摘要
摘要
儿茶酚胺类神经递质在生物体液中的提取与分析对于评估神经系统功能及相关疾病具有重要意义，但其精确定量仍具挑战性。已有多种检测神经递质的实验方案被报道，所用仪器包括高效液相色谱（HPLC）等。然而，现有方法仍存在操作复杂或难以同时检测多个目标物等不足之处。目前，由于具有高灵敏度和良好选择性，高效液相色谱结合电化学或荧光检测仍是主流分析技术。本文详细描述了一种采用电纺复合纳米纤维（以聚合冠醚与聚苯乙烯作为吸附材料）作为吸附剂，通过填充纤维固相萃取（PFSPE）方法，结合高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）对婴儿实际尿液样本中儿茶酚胺进行前处理与检测的实验方案。我们展示了如何利用纳米纤维填充的固相萃取柱对尿液样本进行简便的预净化处理，以及如何在电化学检测系统上快速实现样本中分析物的富集、解吸和检测。PFSPE显著简化了生物样本的前处理流程，有效缩短了操作时间，降低了成本，并减少了目标物的损失。
总体而言，本研究展示了一种简便、便捷的固相萃取联合高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）系统的方法，用于同时测定婴儿尿液中三种单胺类神经递质（去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、多巴胺（DA））及其两种代谢物（3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇（MHPG）和3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC））。该建立的方法被应用于评估围产期脑损伤高危婴儿与健康对照组之间尿液儿茶酚胺及其代谢物的差异。比较分析显示，两组婴儿尿液中MHPG水平存在显著差异，提示儿茶酚胺代谢物可能是早期识别婴儿脑损伤高危病例的重要候选标志物。
引言
体液中儿茶酚胺类神经递质及其代谢物的含量可在很大程度上影响神经功能以及机体对刺激反应状态的平衡1。其异常可能引发多种疾病，如嗜铬细胞瘤、节细胞神经瘤、神经母细胞瘤以及神经系统疾病1,2。因此，对体液中儿茶酚胺的提取与测定在相关疾病的诊断中具有重要意义。然而，生物样本中的儿茶酚胺浓度较低，且易被氧化；此外，由于基质中存在大量干扰物质，其洗脱也极为困难3。因此，实现生物体液中儿茶酚胺的同步检测仍是一项挑战。
已有综述表明，尿液儿茶酚胺可作为应激反应的衡量指标，其水平是响应新生儿触觉刺激处理的重要生物学标志物5。研究表明，所有经历过早产事件的婴儿均存在脑损伤风险4,5,6，而脑损伤可能导致儿茶酚胺及其相关物质在体液中异常释放。目前确实存在先进的磁共振技术，可在早期阶段检测出脑损伤7,8。然而，在出生后最初48小时内，异常的神....
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方案
已获得所有受试者家长的知情同意，并获得了机构审查委员会对本研究的批准。本研究遵循世界医学协会《涉及人类受试者的医学研究伦理准则》（《赫尔辛基宣言》）的规定进行。所有参与者的监护人均签署了书面同意书，同意其参与本研究。同时，也获得了东南大学附属中大医院伦理委员会的批准。
1. 儿茶酚胺提取与测定所需柱材及溶液的制备
- 准备PFSPE小柱。将1-2 mg的PCE-PS纳米纤维分成5-6份，使用直径为0.5 mm的细钢棒将每份依次压入200 µL移液枪头的末端。
- 配制人工尿液：称取2.427 g尿素、0.034 g尿酸、0.09 g肌酐、0.297 g枸橼酸三钠、0.634 g氯化钠、0.45 g氯化钾、0.161 g氯化铵、0.089 g二水氯化钙、0.1 g七水硫酸镁、0.034 g碳酸氢钠、0.003 g草酸钠、0.258 g硫酸钠、0.1 g磷酸二氢钠和0.011 g磷酸氢二钠，溶于200 mL去离子水中。
- 通过将2 mg二苯基硼酸（DPBA）溶解于1 mL蒸馏水中，配制成2 mg/mL的储备溶液。将该溶液避光保存于4 °C。
- 分析物标准品
注意：儿茶酚胺类化合物的化学结构和性质不稳定，易分解。标准品的配制过程必须迅速，并避免暴露于直射阳光下。- 分别称取1.0 mg去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、多巴胺（DA）、3-....
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结果
本方案是一种简单、便捷的PFSPE方法，用于预处理尿液样品并富集五种儿茶酚胺，随后通过高效液相色谱-电化学检测器（HPLC-ECD）系统进行检测；该流程示意图见图1。该方案主要包括四个步骤——活化、上样、淋洗和洗脱，结合少量PCE-PS纳米纤维及简易固相萃取装置完成。采用表面与孔隙分析仪对PCE-PS纳米纤维的形貌进行表征（见材料表）。其结构特性参数——BET（Brunauer, Emmett和Teller）比表面积、孔体积和孔径分别为2.8297 m2 g-1、0.009 cm3 g-1和12.76 nm。这些数据表明，本方案所用材料表面具有纳米级孔隙，可能有助于提高吸附效率并降低结合过程中的pH要求。
本方案采用优化的体积、样品成分、浸提液和洗脱液 等等。
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讨论
本文提出的PFSPE方法在快速性、简便性和便捷性方面可能具有重要意义。该方法所用吸附剂为电纺纳米纤维，具有较高的比表面积，能够高效吸附待测物。该过程仅需数毫克纳米纤维和少量洗脱溶剂，且无需蒸发浓缩步骤。本文详细介绍了基于高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）的实验方案，可帮助新用户建立有效的方法，用于检测和定量三种儿茶酚胺及其两种代谢物（NE、E、DA、MHPG、DOPAC）。
该方案的优越性主要源于实验过程中的四个关键步骤，如图1所示：使用PCE-PS纳米纤维捕获目标化合物，将吸附剂用量减少至几毫克，从而实现快速吸附/解吸，并仅需少量洗脱液（1）；向尿液中加入DPBA，使其与分析物形成络合物以增强其疏水性（2）；用含DPBA的溶液冲洗纳米纤维，以保留分析物并去除杂质（3）；优化萃取和分析条件，以获得对分析物的良好灵敏度和选择性（4）。
对于步骤（1），PCE-PS 吸附能力表现出优异性能的机制可能归因于多种因素。掺杂在纳米纤维中的冠醚聚合物可通过氢键与含有氨基.......
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披露
作者声明，本文讨论的内容与任何金融机构不存在利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（No.81172720，No.81673230）、江苏省科技厅社会发展研究计划（No. BE2016741）及科学技术 &中国国家质量监督检验检疫总局科技项目（2015QK055），东南大学教育部儿童发展与学习科学重点实验室开放课题项目（CDLS-2016-04）。我们诚挚感谢袁松（Yuan Song）和刘萍（Ping Liu）在样本采集过程中给予的协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 200 µL 移液器吸头 | 用于装载纳米纤维的柱 | ||
| PCE-PS 纳米纤维 | PFSPE 萃取材料 | ||
| 钢棒（直径约 0.5 mm） | 将纳米纤维填充入柱中 | ||
| 气密塑料注射器（5 ml） | 将溶液压入吸头末端 | ||
| 甲醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 67-56-1 | |
| 二苯基硼酸-2-氨基乙酯（DPBA） | Sigma-Aldrich.Inc | A-106408 | 络合试剂 |
| 去甲肾上腺素（NE） | Sigma-Aldrich.Inc | A-9512 | 分析物 |
| 3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇（MHPG） | Sigma-Aldrich.Inc | H1377 | 分析物 |
| 肾上腺素（E） | Sigma-Aldrich.Inc | 100154-200503 | 分析物 |
| 3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC） | Sigma-Aldrich.Inc | D-9128 | 分析物 |
| 多巴胺（DA） | Sigma-Aldrich.Inc | H-8502 | 分析物 |
| 3,4-二羟基苄胺氢溴酸盐（DHBA） | Sigma-Aldrich.Inc | 858781 | 内标物 |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich.Inc | 75-05-8 | 洗脱剂和流动相 |
| 磷酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 7664-38-2 | 洗脱剂 |
| 尿酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 69-93-2 | 人工尿液 |
| 肌酐 | 国药集团化学试剂有限公司 | 60-27-5 | 人工尿液 |
| 柠檬酸三钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 6132-04-3 | 人工尿液 |
| KCl | 国药集团化学试剂有限公司 | 7447-40-7 | 人工尿液 |
| NH4Cl | 国药集团化学试剂有限公司 | 12125-02-9 | 人工尿液 |
| NaHCO3 | 国药集团化学试剂有限公司 | SWC0140326 | 人工尿液 |
| C2Na2O4 | 国药集团化学试剂有限公司 | 62-76-0 | 人工尿液 |
| NaSO4 | 国药集团化学试剂有限公司 | 7757-82-6 | 人工尿液 |
| 磷酸氢二钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10039-32-4 | 人工尿液 |
| 尿素 | 国药集团化学试剂有限公司 | 57-13-6 | 人工尿液 |
| NaCl | 国药集团化学试剂有限公司 | 7647-14-5 | 人工尿液 |
| MgSO4·7H2O | 国药集团化学试剂有限公司 | 10034-99-8 | 人工尿液 |
| CaCl2 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10035-04-8 | 人工尿液 |
| HCl | 国药集团化学试剂有限公司 | 7647-01-0 | 人工尿液 |
| 柠檬酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 77-92-9 | 人工尿液和流动相 |
| EDTA 二钠盐 | 国药集团化学试剂有限公司 | 34124-14-6 | 流动相 |
| 磷酸二氢钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 7558-80-7 | 人工尿液和流动相 |
| 庚烷磺酸钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 22767-50-6 | 流动相 |
| 氢氧化钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 1310-73-2 | 流动相 |
| 苯基硼酸柱（PBA 柱） | Aglilent | 12102018 | PBA 萃取 |
| Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm 柱 | Dikma | 5020-06731 | 用于分离的高效液相色谱柱 |
| SHIMADZU SIL-20AC prominence 自动进样器 | 岛津公司，日本 | SIL-20AC | 洗脱剂自动进样 |
| SHIMADZU LC-20AD 高效液相色谱仪 | 岛津公司，日本 | LC-20AD | 高效液相色谱泵 |
| SHIMADZU L-ECD-60A 电化学检测器 | 岛津公司，日本 | L-ECD-60A | 分析物检测器 |
| ASAP 2020 加速比表面积与孔隙率分析系统 | Micromeritics，美国 | 表面与孔隙分析仪 |
参考文献
- Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
- Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376(2010).
- Varley, H., Gowenlock, A. H.
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重印与许可
