小鼠胚胎心脏前体细胞群体的定量整体免疫荧光分析

摘要

本文介绍了一种对小鼠早期胚胎进行整体免疫荧光染色及基于图像的定量体积分析的实验方案。我们提出，该技术可作为一种强大手段，用于在发育过程中对心脏结构进行定性与定量评估，并认为该方法可广泛适用于其他器官系统。

摘要

不断进步的成像技术极大地促进了我们对胚胎发育过程的理解。由于能够直接从植入前胚胎或离体器官的成像中获得高质量数据，植入前发育和器官发生这两个研究领域尤其受益于这些技术进步。尽管植入前胚胎能够提供空间分辨率极高的数据，但发育后期阶段则较难进行三维重建。将已知胚胎结构的高质量三维或容积数据与命运图谱或遗传谱系示踪相结合，将有助于更全面地分析胚胎发生过程中发生的形态发生事件。

本方案描述了一种整体免疫荧光技术，可用于标记、观察和定量心脏发育过程中形成的关键结构——心脏新月体内的前体细胞群体。该方法的设计使得能够同时获取细胞水平和组织水平的信息。通过共聚焦显微镜和图像处理，本方案可实现心脏新月体的三维空间重建，从而分析在此心脏发育关键阶段特定前体细胞群体的定位与组织结构。重要的是，利用参考抗体可对心脏新月体进行连续掩膜处理，进而对新月体内特定区域进行定量测量。本方案不仅有助于深入研究早期心脏发育过程，经过适当调整后，还可适用于原肠胚至早期体节阶段小鼠胚胎中大多数器官系统的分析。

引言

器官发生的研究长期以来依赖于对发育中胚胎形态发生事件的观察。这些研究通常结合使用荧光染料或谱系示踪报告分子，并对标记的特定参考细胞群进行分析。¹ 通过比较这些标记物的相对位置，可以获得有关目标细胞群起源、迁移路径或最终贡献的信息。移植实验和命运图谱实验利用形态学标志或向非迁移性谱系中注射染料，以确定目标细胞的起始位置，随后检测这些细胞对发育后胚胎的贡献情况。^2,3,4,5 遗传谱系示踪实验则采用相同原理，利用明确定义的报告等位基因标记细胞群体，无需额外实验操作即可实现标记。这些方法的关键在于能够以高空间分辨率确定实验标记与参考标记的位置。这些技术已在着床前发育及器官外植体发生研究中取得显著进展。^6,7,8,9

近年来，心脏形态发生背后的发育事件已被越来越清晰地描述。¹⁰ 该研究领域的一项重要发现是鉴定出多个可通过特异性标志物表达加以区分的前体细胞群体。¹¹ 这些细胞群体包括第一和第二心脏区（FHF 和 SHF），它们存在于小鼠胚胎发育第 8.25 天（E8.25）胚胎前端的心脏新月区。¹² 对这些细胞群体的研究通常结合使用宽场显微镜（可提供组织水平的信息）以及免疫荧光染色的连续切片技术（可实现高细胞分辨率，但仅能提供二维空间信息）。¹³ 因此，尽管这些研究极大地推动了我们对心脏发育的理解，但现有方法在这些发育阶段对形态发生的深度定量分析方面仍存在局限性，亟需发展能够在全 organism 水平上研究这些细胞群体空间组织的新方法。

共聚焦显微镜和三维图像分析技术的最新进展，使得细胞和结构的高分辨率、高通量算法重建成为可能 原位 以相对简便的方式，从而为复杂细胞结构的详细研究铺平了道路。¹⁴ 随着计算能力的提升以及大数据管理算法的发展，如今已能够完全自动化地分析成像数据集，而这两种技术对于应对成像数据集规模的指数级增长至关重要。¹⁵ 成像数据集的自动化分析具有无偏性的优势，但其可靠性取决于输入数据集的质量；因此，在数据采集和图像预处理过程中必须采用最佳实践，以确保获得最高质量且无偏的分析结果。¹⁶ 实验方案可完全自动化并共享以实现可重复性，专有软件所使用的算法可通过程序库便捷获取，供熟悉现代专有或开源开发工具的科研人员使用。¹⁷

以下方案详细说明了在器官发生的一个明确定义的模型——心脏新月体形成（心脏发育过程中的一个阶段）中进行此类分析所需的步骤。具体而言，本方案描述了如何（1）获取并解剖处于心脏新月体阶段的胚胎，（2）对参考标记（Nkx2-5）和实验标记（Foxa2Cre:YFP^18,19）进行整体免疫荧光染色，（3）利用共聚焦显微镜制备并成像胚胎，最后（4）采用先进的三维分析方法对所得图像进行分析与定量。尽管本文以心脏新月体作为示例，但经过适当修改后，该方案也可用于分析原肠胚至早期体节阶段胚胎中的多个细胞谱系。

方案

本文所述所有方法均已获得西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 心形期胚胎的收获与处理

1. 将一只可育的雌性小鼠与一只可育的雄性种鼠交配。
2. 使用钝头探针或镊子检查阴道交配栓的存在。检测到交配栓当天的中午定为胚胎发育第0.5天（E 0.5）（参见 图1A 完整时间线）。
   注意：应于早晨检查栓塞情况，因为栓塞会随着时间推移在当天逐渐脱落。
3. 第8天早上^th 在第8.25天（E8.25），通过CO处死怀孕母鼠₂ 吸入，或根据当地和机构的规定。
   注意：确切时间可能因菌株而异，应根据形态学特征通过实验确定。
4. 用70%乙醇喷洒小鼠腹部以清洁区域并减少污染。通过皮肤和体壁进行腹部切口，暴露内脏。
5. 找到子宫，小心地将整个子宫角从动物体内取出。首先在一条输卵管上方开始剪切，沿子宫向宫颈端逐步剥离周围脂肪组织。剪断宫颈后，继续向另一侧输卵管的上端分离，剪切以完整取出整个子宫。
6. 将子宫置于含磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）的10 cm培养皿中，以洗去多余血液。通过切开每个含有胚胎的蜕膜之间的子宫系膜，对子宫进行次级解剖。将胚胎转移至含新鲜PBS的6 cm培养皿中。
7. 在解剖显微镜下，使用精细镊子（#5）将子宫组织从蜕膜组织上分离。
8. 用镊子小心地切开蜕膜的胚侧尖端以暴露胚胎。轻捏蜕膜，使胚胎挤出，再小心地将胚胎取出。
9. 尽可能剥离胚外组织，同时不破坏胚胎的形态（图1B).
10. 使用移液管将胚胎转移至含有新鲜PBS的1.5 mL离心管中，并置于冰上。在继续下一步操作前，对剩余胚胎重复步骤1.7–1.9。
11. 吸去 PBS，用 PBS 冲洗一次，吸去 PBS。
    注意：尽量移除 PBS，但避免损伤或干燥胚胎。所有步骤均建议手动移除溶液，以防止胚胎丢失。
12. 在室温下用4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定胚胎1小时。
    注意：胚胎可在 4 °C 下固定过夜（O/N）。
13. 用 PBS 冲洗三次。将胚胎置于 4 °C 保存，直至进行免疫荧光实验。
    注意：可暂停步骤。胚胎可在 4 °C 的 PBS 中安全保存数周。

2. 免疫荧光染色

注意：以下孵育条件可根据不同的实验安排进行调整。所有长时间孵育步骤建议采用温和振荡或摇动。

1. 移除 PBS，加入 1 mL 封闭缓冲液（含 0.5% 皂苷和 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液）。
2. 在室温下孵育至少 4 小时，也可在 4 °C 下过夜孵育。
3. 移除封闭缓冲液，加入用封闭缓冲液稀释的一抗混合液，在 4 °C 下过夜孵育。
   注意：有关所用抗体的描述及推荐稀释比例，请参见材料部分。抗体稀释比例应通过实验确定。建议使用 Nkx2-5 作为心脏新月区的参考染色标志，这对后续的图像分割与分析步骤至关重要。
4. 通过抽吸移除一抗。
5. 用含 0.1% Triton 的 PBS 溶液洗涤 3 次，每次 1 小时。
6. 移除洗涤液，加入用封闭缓冲液稀释的二抗混合液，在室温下孵育 3 小时，也可在 4 °C 下过夜孵育。
7. 用含 0.1% Triton 的 PBS 溶液洗涤 3 次，每次 1 小时，也可在 4 °C 下过夜孵育。
8. 用 PBS 中的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染 10 分钟。
   注意：此复染步骤可与二抗孵育同时进行。
9. 用含 0.1% Triton 的 PBS 溶液洗涤 2 次，每次 5 分钟。
10. 将胚胎缓慢悬浮于抗荧光淬灭封片介质中（含 2% w/v 没食子酸丙酯（nPG）、90% 甘油和 1× PBS；更多细节请参见材料部分）。封片前至少平衡 1 小时。定期轻弹管壁，帮助胚胎沉入抗荧光淬灭溶液中。
    注意：可暂停步骤。胚胎可在抗荧光淬灭溶液中保存数天，待准备封片和成像时再进行后续操作。

3. 胚胎显微镜观察的制片

1. 使用双面胶带或硅胶垫片准备用于封片的显微镜载玻片。若使用双面胶带，将5-6层胶带制成两个平行堆叠，间距约为15-20 mm，以留出足够空间放置胚胎并固定盖玻片（图1C）。
2. 在载玻片上双面胶带之间的区域滴加15 µL抗荧光淬灭剂，然后小心地将一个胚胎转移至液滴中。
   注意：可在同一载玻片上放置多个胚胎，但多个胚胎会增加后续定向操作的难度，且长时间成像可能导致光漂白。
3. 在解剖显微镜下，用精细镊子调整胚胎位置，使胚胎的腹侧朝远离载玻片方向，且其体轴与载玻片的长轴对齐。封片装置的示意图参见图1C。
4. 将盖玻片小心覆盖在样品上：先将一侧置于其中一堆双面胶带上，再用镊子轻轻放下另一侧，直至盖玻片接触另一侧胶带。
   注意：步骤3.3和3.4对于确保胚胎成像时的正确朝向至关重要。沿胚胎后端至前端方向缓慢放下盖玻片，可防止胚胎滚动，使心脏新月区保持朝向远离载玻片的方向，这在倒置显微镜下成像最为理想。
5. 使用移液器在载玻片与盖玻片之间加入额外的抗荧光淬灭剂，以防止样品在储存或成像过程中干燥死亡。

4. 共聚焦成像

1. 使用能够在一个视野内完整捕获心脏新月区的最高倍率物镜进行成像。采用奈奎斯特采样率确定 x-y-z 体素尺寸。大多数显微镜制造商均提供"优化"按钮，以确保满足奈奎斯特采样标准。
   注意：此处对 Nkx2-5 进行染色是有益的，因其可清晰界定整个心脏新月区域。更小的 Z 轴步长（过采样）将获得更优的三维建模结果，但可能导致成像时间延长和/或部分样本发生光漂白。
2. 依据标准的最佳成像实践设置成像参数。具体而言，对每种荧光染料均应使用尽可能低的激光强度，以获得良好的信噪比，并选择增益与偏移水平，使信号具有宽动态范围且不发生饱和。
   注意：对于需直接比较的样本，成像参数应保持一致。这一点在后续的三维分析与定量中尤为重要。

5. 图像分析与定量三维建模

注意：本实验方案中，图像使用 Imaris 软件包进行分析。使用其他软件包也可能实现类似的分析。以下描述涵盖参考通道的分析流程（即 Nkx2-5）和一个实验通道（即 YFP）。通过重复上述步骤，可分析其他通道。已提供一个示例数据集，可用于复现下述分析结果。

1. 将原始图像数据集载入 Imaris Arena 视图，并在 Surpass 视图中打开目标胚胎的文件。数据应以 MIP（最大值）模式在 3D 视图中加载。打开显示调节窗口，并仅选择参考通道。
2. 根据需要调整图像的阈值以获得更好的可视化效果。对于此分析，如果信噪比过低导致难以分割，可调整伽马值。
   注意：如果进行伽马校正（一种非线性调整），则校正后的图像不能用于强度测量或比较。在此阶段，如果信噪比不理想，可对图像进行进一步的预处理（例如照明校正、高斯模糊或其他滤波）。若选择进行预处理，必须对数据集中的所有图像执行相同的预处理步骤。
3. 使用表面算法对话框为参考通道创建新表面。
   1. 选择 "仅分割感兴趣区域" 复选框
   2. 调整边界框区域，使其包含感兴趣区域（ROI， 即 参考染色所界定的心脏新月区）
   3. 从“源通道”下拉菜单中选择参考通道。平滑参数的默认设置（等于z轴体素大小）通常已足够，但可能需要根据实验进行优化。在本分析中，请将平滑值设置为z轴体素大小的一半。
   4. 通过绝对强度进行阈值分割。为确保表面不超出通道信号范围，使用滑块调整下限。
      注意：对于某些细胞边界清晰易辨的图像，您可以包含这些 "分割相互接触的物体" 算法，以进一步将信号与背景分离。
   5. 根据体素数量或体积筛选对象，并剔除算法可能生成的背景对象（体积过小或位于 Nkx2-5 区域以外的区域）。完成算法。
4. 使用新创建的表面，为实验通道创建一个遮罩通道。
   1. 选择表面后，选择 "从“编辑”窗口中选择“Mask Sel...͟”功能。
   2. 选择感兴趣的实验通道（即 YFP）。确保 "应用遮罩前复制通道" 复选框已选中。
5. 在显示调整窗口中，仅选择被遮罩的通道。按照步骤 5.3–5.3.5 为该遮罩通道创建一个新的表面。
   注意：此时可调整每个掩膜的外观，以方便三维模型的可视化：选择每个表面，然后选择颜色选项卡。根据需要调整基础颜色和透明度。表面颜色在重叠时不会混合。
6. 为获取体积数据，选择每个表面后，点击统计信息选项卡。在 "详细" 子标签页，选择 "平均值" 从下拉菜单中选择。生成表格的“总和”列中可找到表面的总体积。
   注意：如果生成的表面包含错误的片段（即 那些在分割过程中未被排除的背景信号片段或与主表面不连续的区域），可能需要手动计算总体积，或按体积或体素数量对表面进行筛选，确保仅将信号片段纳入计算。通过选择表面各部分可获得其对应的体积 "所有数值" 从下拉菜单中选择每个数值，相应的区域将显示为黄色，有助于确定需要排除的数值。

结果

最终数据与分析的质量在很大程度上取决于：（1）分离胚胎的完整性和形态，（2）高特异性抗体的使用，以及（3）成像参数的正确设置。受损的胚胎会干扰表面生成过程，并妨碍定量分析。正确分离并确定发育阶段的胚胎示例见图2B。可通过去除卵黄囊进一步解剖胚胎，因为抗体常会非特异性地结合到卵黄囊上。然而，去除卵黄囊会使胚胎变得更脆弱，因此在后续操作中应格外小心。

高质量抗体与合适的成像设置相结合，对于获得高信噪比图像至关重要。图2A 展示了一幅使用抗 Nkx2-5 抗体作为参考标记物标记心形带，以及使用 GFP 标记谱系示踪的目标细胞群体（Foxa2Cre:YFP 心室心血管前体细胞）的示例图像（原始图像和数据文件见补充数据）。¹⁹ 该策略可实现将特定细胞群体与整个心形带区域进行比较。在某些实验中，可能需要观察心形带中的前心场（...

讨论

上述方案描述了一种从植入后小鼠胚胎的高质量整体免疫荧光图像中获取定量数据的策略。若操作正确，通过这些步骤生成的三维体积数据可用于胚胎内多个区域的比较分析和交叉分析。当将新发现的细胞群体与已确立的参考结构进行比较研究时，所述的表面信号掩蔽方法尤为有用。

我们认为，这种方法相较于现有方法具有明显优势。全组织免疫荧光结合宽场成像可提供组织水平的信息，但缺乏细胞分辨率。相反，连续切片的免疫荧光成像虽能实现详细的细胞水平分辨率，但这些数据缺乏全组织成像所具备的三维优势。尽管三维共聚焦成像能够弥补上述不足，但很少有研究者充分利用该数据的定量潜力。我们希望本实验方案能够帮助更多研究人员充分挖掘其所收集数据的价值。

本文以标志物 Nkx2-5 为例，用于界定心脏新月区，并检测 Foxa2Cre:YFP 谱系示踪细胞在该区域内的存在情况。然而，由于该方法能够同时对至少三个谱系进行成像，并生成高分辨率的三维数据，因此本方案可能对多个研究领域的科研人员均有帮助。我们建议，通过根据特定研究体系的需求对本方案进行微调，该方法可适用于多种胚胎发育阶段、器...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钝头探针	Roboz	RS-9580
镊子	Roboz	RS-8100
精细镊子	Roboz	RS-5015
解剖剪刀	Roboz	RS-5912
皂苷	Sigma Aldrich	84510
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A8022
吐温-100（Triton）	RPI	A4490
山羊抗Nkx2-5抗体	Santa Cruz Biotech	sc-8697	使用稀释比例为1:100–1:500
鸡抗GFP抗体	abcam	ab13970	使用稀释比例为1:500
兔抗Islet1抗体	abcam	ab109517	使用稀释比例为1:100
兔抗Hcn4抗体	Millipore	AB5808	使用稀释比例为1:100
488标记抗鸡IgG	Jackson Immunoresearch	703-546-155	用蒸馏水重悬，以含50%甘油的终浓度储存于-20 °C。使用稀释比例为1:500。
555标记抗山羊IgG	Thermo Fisher Scientific	A21432	使用稀释比例为1:500
647标记抗兔IgG	Jackson Immunoresearch	711-606-152	用蒸馏水重悬，以含50%甘油的终浓度储存于-20 °C。使用稀释比例为1:500。
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
正丙基没食子酸酯（n-Propyl gallate）	Sigma Aldrich	2370	储备液为20% w/v的DMSO溶液。工作液配制方法：将1份10×PBS与9份100%甘油混合，缓慢加入0.1份储备液。
Superfrost Plus显微镜载玻片	VWR Scientific	48311-703
22×22 mm 盖玻片	VWR Scientific	48366-227
Imaris 8.4.1	Bitplane