评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

摘要

彗星试验是一种检测DNA损伤（包括单链和双链DNA断裂）的有效方法。我们描述了碱性和中性彗星试验，用于检测癌细胞中的DNA损伤，以评估化疗的治疗效果。

摘要

DNA损伤是细胞在其生命周期中常见的现象，定义为基因组DNA化学结构的改变。放射治疗和化学治疗等癌症疗法会引入大量额外的DNA损伤，从而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡，以限制癌症的进展。在实验性癌症治疗过程中对DNA损伤进行定量评估，是验证基因毒性试剂有效性的关键步骤。本研究聚焦于单细胞凝胶电泳实验（也称为彗星实验），该方法可用于体外定量单链和双链DNA断裂。in vitro。彗星实验是一种高效且易于操作的DNA损伤定量方法，具有时间与预算需求低、重复性高的优点。本文通过评估奥拉帕利与替莫唑胺联合治疗对中国台湾U251胶质瘤细胞的基因毒性效应，重点阐述彗星实验在临床前研究中的应用价值。

引言

彗星试验最初由Ostling和Johanson于1984年在中性条件下通过证明DNA片段从细胞核中迁移而建立¹该技术随后由 Singh 进一步发展 等，表明碱性条件显著提高了该检测方法的特异性和可重复性²自那时起，中性彗星实验主要用于检测双链DNA断裂，而碱性彗星实验对较小程度的DNA损伤更为敏感，可检测单链和双链DNA断裂、碱不稳定位点、DNA-DNA或DNA-蛋白交联，以及与不完全切除修复位点相关的DNA单链断裂。^3,4两种检测方法均可实现对断裂DNA的可视化，为定量评估DNA损伤提供了简便的方法。彗星试验被认为是检测DNA损伤的敏感方法。 体外 和 体内 遗传毒理学研究，适用于多个研究领域，如早期药物候选物筛选、环境监测、人类生物监测以及DNA损伤与修复的基础研究⁵.

该检测方法的原理是在电场作用下，断裂的DNA会从核样体（也称为“彗头”）迁移出来，并在琼脂糖凝胶中形成DNA染色区域（也称为“彗尾”）。通过核苷酸染色，可通过对单细胞电泳形成的“彗星”图像进行分析，定量评估DNA损伤程度。计算尾矩可进一步帮助比较不同实验组之间的DNA损伤水平。与传统的DNA损伤检测方法相比，彗星试验具有直接、灵敏、成本低且相对简便的优点。

放射治疗和化学治疗是通过在染色体上产生单链和双链DNA断裂来治疗癌症的常用策略⁶。近年来，DNA修复抑制剂的发展使得联合化疗能够产生更有效的基因毒性效应，从而可能减少贫血、感染和骨髓抑制等全身性副作用^7,8。在本研究中，我们探讨了一种聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂奥拉帕利（Ola）⁹。PARP是一种丰富的核蛋白，通过形成聚（ADP-核糖）聚合物参与DNA碱基切除修复过程¹⁰。替莫唑胺（TMZ）是一种口服有效的烷化剂，已广泛用于胶质瘤患者的治疗。通过使用彗星实验定量DNA损伤，我们证明奥拉帕利与替莫唑胺联合使用可显著增强胶质瘤细胞中的DNA损伤，表明与单独使用替莫唑胺相比，奥拉帕利/替莫唑胺联合治疗是治疗胶质瘤的一种有效策略¹¹。

方案

1. 准备试剂

1. 1× PBS
   1. 将 100 mL 10x PBS 用 900 mL dH₂O 稀释₂O，并使用 pH 计将 pH 调至 7.4。室温保存。
2. 裂解液（LS）
   1. 配制 2.5 M NaCl、100 mM 二钠 EDTA、10 mM Tris 碱和 200 mM NaOH 于 900 mL 去离子水中₂O；通常需要约20分钟使混合物完全溶解。使用pH计将pH值调节至10。加入1%十二烷基肌氨酸钠和1% Triton X-100，并定容至1,000 mL。使用前于4 °C冷却至少30分钟。
3. 碱性电泳溶液（AES），pH >13
   1. 配制 200 mM NaOH 和 1 mM EDTA 二钠盐于 800 mL 去离子水中₂O. 调节pH，确保其达到指定pH值 >13. 将终体积调至 1,000 mL。使用前新鲜配制，并于 4 °C 冷却至少 30 分钟。
4. 中性电泳溶液（NES）
   1. 通过将100 mM Tris碱和300 mM醋酸钠溶于1,000 mL dH₂O中，配制1,000 mL中性电泳缓冲液₂O. 用冰醋酸调节 pH 至 9.0。使用前于 4 °C 冷却至少 30 分钟。
5. DNA沉淀溶液（DPS）
   1. 10 mL 7.5 M 醋酸铵储备液的配制。取6.7 mL 7.5 M醋酸铵与43.3 mL 95%乙醇混合，制得50 mL DNA沉淀溶液。室温保存。
6. 染色液
   1. 加入1 µL 10,000倍稀释的绿色荧光核酸染料（例如，SYBR Green）溶于30 mL Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM disodium EDTA，pH 7.4）中，4 °C保存。避光。
7. 1% 低熔点琼脂糖
   1. 融化1%低熔点琼脂糖（1 g溶于100 mL dH₂O）₂在微波炉中加热至完全溶解。每15-20秒摇动一次琼脂糖溶液，确保琼脂糖完全熔化。使用前将琼脂糖置于37 °C水浴中至少20分钟。
8. 预热移液器吸头
   1. 将P200移液器吸头两端狭窄部分各切去3 mm，并在吸取琼脂糖前于37 °C预热。

2. 准备彗星电泳载玻片

1. 载玻片包被
   1. 融化1%琼脂糖（1 g溶于100 mL dH₂O中）₂在微波炉中加热 2 - 3 分钟，或直至琼脂糖完全熔化。将玻璃载玻片浸入琼脂糖中，然后用无绒擦拭纸擦去载玻片一侧的琼脂糖。
   2. 将载玻片平放在平坦表面自然晾干，或在50 °C下加热以加快干燥；干燥后应形成透明的琼脂糖薄膜。使用前将包被的载玻片置于37 °C环境中。
2. 单细胞悬液的制备
   1. 胶质瘤细胞的培养与处理
      1. 在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和10 µg/mL链霉素的DMEM-Ham F-12培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养U251 MG细胞。₂.
      2. 使用1 mL胰蛋白酶消化细胞3分钟，用含FBS的DMEM-Ham F-12培养基中和胰蛋白酶。将细胞收集至15 mL离心管中，300 × g离心4分钟，吸除上清液，用培养基重悬细胞至浓度为2 × 10⁶ cells/mL⁵ 细胞/mL，溶于1×PBS中。
         注意：细胞样品应在开始实验前立即制备，所有样品均需在避光或弱光环境中操作，以防止光照导致DNA损伤。
      3. 将细胞悬液与1%熔化的低熔点琼脂糖（37 °C）按1:10（v/v）的比例混合，轻轻吹打混匀，立即吸取30 µL滴加至载玻片上。用移液枪头侧面将琼脂糖/细胞混合物铺开，确保形成一层薄层。
      4. 将载玻片平放于4 °C避光环境中10分钟。将凝胶时间延长至30分钟可提高样品在高湿度环境中的附着性。
      5. 将载玻片浸入4 °C的LS中，避光孵育1小时至过夜。

3. 单细胞电泳

1. 进行碱性（步骤 3.2）或中性（步骤 3.3）彗星实验
2. 对于碱性彗星实验
   1. 轻柔地将载玻片从 LS 中取出，沥去多余的缓冲液，然后将其轻柔浸入 AES 中，在 4 °C 下孵育 1 小时，以使 DNA 解链。将载玻片避光保存。
   2. 向电泳载玻片槽中加入预冷的 AES，液面高度不得超过载玻片上方 0.5 cm（具体取决于电泳装置的尺寸），将载玻片放入槽中并盖上盖子。将电源电压设定为 1 V/cm（电极之间的距离），在 4 °C 下电泳 30 分钟。
   3. 沥去载玻片上多余的电泳液。将载玻片在 dH₂O 中轻柔浸洗两次，每次 5 分钟，室温操作。
   4. 将载玻片在 70% 乙醇中轻柔浸渍 5 分钟，室温操作。进入步骤 4。
3. 对于中性彗星实验
   1. 轻柔地将载玻片从 LS 中取出，沥去多余的缓冲液，然后将其轻柔浸入 NES 中，在 4 °C 下孵育 30 分钟。将载玻片避光保存。
   2. 向电泳载玻片槽中加入预冷的中性电泳缓冲液，液面高度不得超过载玻片上方 0.5 cm（具体取决于电泳装置的尺寸），将载玻片放入槽中并盖上盖子。将电源电压设定为 1 V/cm（电极之间的距离），在 4 °C 下电泳 45 分钟。
   3. 沥去载玻片上多余的缓冲液。将载玻片在 DPS 中轻柔浸渍 30 分钟，室温操作。
   4. 将载玻片在 70% 乙醇中轻柔浸渍 30 分钟，室温操作。进入步骤 4。

4. 染色彗星载玻片

1. 将载玻片在 37 °C 下避光干燥 10 - 15 分钟。
2. 在每张干燥的琼脂糖凝胶上加入 50 - 100 µL 绿色荧光核酸染色液，室温避光染色 15 分钟。
3. 用 dH₂O 快速冲洗载玻片，并在 37 °C 下避光完全干燥。随后进行图像采集与分析。

5. 图像采集与分析

注意：DNA断裂的可视化与定量基于落射荧光显微镜和彗星分析软件（见材料表）¹²。

1. 将载玻片放置在显微镜上，并用玻片夹固定。确保琼脂糖凝胶面向物镜。使用配备10倍物镜的荧光显微镜，随机拍摄染色后的彗星电泳载玻片图像。避免拍摄边缘区域以及气泡周围的区域。
2. 确保每条彗星尾水平分布，彗星头部应位于左侧，尾部朝向右侧。
3. 将每张图像以二值化TIF格式保存，DNA染色部分明亮，背景为暗色。点击工具栏左侧的“Select files to analyze”按钮加载图像，此时应出现图像查看窗口（图1）。
4. 在屏幕上绘制测量框，并根据细胞彗星的大小调整框的尺寸。点击“Adjust”按钮，依据图像设定头部、彗星整体及尾部的阈值，然后点击“Start measurements”按钮（图1）。
5. 使用测量框选择一个细胞，然后点击鼠标激活“Assay the comet”按钮进行测量；在“profiles”窗口中将显示带有选定测量参数的强度图像。结果可通过点击“store result”按钮保存（图1）。
   注意：软件会自动计算包括彗星尾长度、尾部DNA百分比、尾矩（TM）和Olive尾矩（OTM）在内的各项参数。尾矩的计算公式如下：
   
   
6. 每种处理条件至少分析50个细胞。

结果

本实验方案详细描述了彗星实验的操作步骤及数据分析流程（图1）。碱性与中性彗星实验结果均显示，经多柔比星处理的U251细胞（1 µM，20 h）其彗星尾更长且DNA荧光强度更高，提示化疗导致细胞内断裂的DNA大量累积（图2）。

碱性或中性彗星实验的定量分析均显示，经阿霉素处理后，彗星尾部的形成显著增加（图3A）表示DNA损伤。结果以均值±标准误（SEM）表示， t采用检验进行统计比较。两种实验中尾矩的定量分析均证实了平均尾矩的增加：对于碱性彗星实验，0.134 ± 0.0448（n = 52）vs. 13.84 ± 1.325（n = 51）， p <0.01；中性彗星实验结果为 0.596 ± 0.06668（n = 78）与 9.9...

讨论

彗星试验是一种在细胞水平上检测单链和双链DNA断裂的有效工具。该试验已被广泛应用于遗传毒性研究和生物监测领域，被视为“金标准”。¹³，范围涵盖碱基损伤、DNA交联、药物开发以及对碱敏感位点。在本研究中，我们分别展示了碱性彗星实验和中性彗星实验的两种不同、逐步详述的操作方案。结合单细胞电泳、荧光显微镜观察及图像分析，碱性与中性彗星实验均可定量评估DNA损伤的程度 体外.

彗星实验的成功实施需要几个关键步骤。例如，在试剂配制过程中应格外注意。每种溶液都应新鲜配制，并在使用前于适当温度下放置至少30分钟，以防止样品制备过程中发生内源性DNA损伤或修复。另一个关键步骤是制备具有活性的单细胞悬液。使用前应将琼脂糖保持在37 °C，以最大限度地提高彗星载玻片制备过程中的细胞存活率。细胞/琼脂糖悬液应在实验开始前立即配制。使用移液器吸头的侧面来铺展细胞/琼脂糖悬液，有助于在载玻片上形成一层薄的琼脂糖，从而使大多数细胞在显微镜观察时处于同一焦平面上。可选地，可使用金刚石笔尖在载玻片边缘划痕，以增强琼脂糖的附着。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
10x PBS（含Ca++，不含Mg++）	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
月桂酰肌氨酸钠	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
乙酸钠	Sigma	32318
冰乙酸	Sigma	695092
乙酸铵	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520
琼脂糖	Invitrogen	16500
95% 乙醇	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
胰蛋白酶	GIBICO	25300-054
名称	公司	货号	备注
耗材
玻璃组织切片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes 擦镜纸	KIMberly-Clark
1.5 mL 微量离心管	DENVILLE
移液器吸头	SHARP
名称	公司	货号	备注
设备
微波炉	Avanti
水浴锅	PRECISION
水平电泳槽	TREVIGEN	Cometassay ES II
电源	Bio-Rad
培养箱	Quincy Lab	Model 12-140E
荧光显微镜	Zeiss	LSM700
微量移液器	Eppendorf