评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

摘要

彗星试验是一种检测DNA损伤（包括单链和双链DNA断裂）的有效方法。我们描述了碱性和中性彗星试验，用于检测癌细胞中的DNA损伤，以评估化疗的治疗效果。

摘要

DNA损伤是细胞在其生命周期中常见的现象，定义为基因组DNA化学结构的改变。放射治疗和化学治疗等癌症疗法会引入大量额外的DNA损伤，从而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡，以限制癌症的进展。在实验性癌症治疗过程中对DNA损伤进行定量评估，是验证基因毒性试剂有效性的关键步骤。本研究聚焦于单细胞凝胶电泳实验（也称为彗星实验），该方法可用于体外定量单链和双链DNA断裂。in vitro。彗星实验是一种高效且易于操作的DNA损伤定量方法，具有时间与预算需求低、重复性高的优点。本文通过评估奥拉帕利与替莫唑胺联合治疗对中国台湾U251胶质瘤细胞的基因毒性效应，重点阐述彗星实验在临床前研究中的应用价值。

引言

彗星试验最初由Ostling和Johanson于1984年在中性条件下通过证明DNA片段从细胞核中迁移而建立¹该技术随后由 Singh 进一步发展 等，表明碱性条件显著提高了该检测方法的特异性和可重复性²自那时起，中性彗星实验主要用于检测双链DNA断裂，而碱性彗星实验对较小程度的DNA损伤更为敏感，可检测单链和双链DNA断裂、碱不稳定位点、DNA-DNA或DNA-蛋白交联，以及与不完全切除修复位点相关的DNA单链断裂。^3,4两种检测方法均可实现对断裂DNA的可视化，为定量评估DNA损伤提供了简便的方法。彗星试验被认为是检测DNA损伤的敏感方法。 体外 和 体内 遗传毒理学研究，适用于多个研究领域，如早期药物候选物筛选、环境监测、人类生物监测以及DNA损伤与修复的基础研究⁵.

该检测方法的原理是在电场作用下，断裂的DNA会从核样体（也称为“彗头”）迁移出来，并在琼脂糖凝胶中形成DNA染色区域（也称为“彗尾”）。通过核苷酸染色，可通过对单细胞电泳形成的“彗星”图像进行分析，定量评估DNA损伤程度。计算尾矩可进一步帮助比较不同实验组之间的DNA损伤水平。与传统的DNA损....

方案

1. 准备试剂

1. 1× PBS
   1. 将 100 mL 10x PBS 用 900 mL dH₂O 稀释₂O，并使用 pH 计将 pH 调至 7.4。室温保存。
2. 裂解液（LS）
   1. 配制 2.5 M NaCl、100 mM 二钠 EDTA、10 mM Tris 碱和 200 mM NaOH 于 900 mL 去离子水中₂O；通常需要约 20 分钟使混合物完全溶解。使用 pH 计将 pH 调至 10。加入 1% 十二烷基肌氨酸钠和 1% Triton X-100，定容至 1,000 mL。冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 min。
3. 碱性电泳液（AES），pH >13
   1. 配制 200 mM NaOH 和 1 mM EDTA 二钠盐于 800 mL 去离子水中₂O. 调节pH值，并确保其为pH >13. 将最终体积调至 1,000 mL。使用前新鲜配制并冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 分钟。
4. 中性电泳溶液（NES）
   1. 通过将 100 mM Tris 碱和 300 mM 醋酸钠溶于 ....

结果

本方案详细描述了彗星实验操作与数据分析的逐步流程（图1）。碱性与中性彗星实验结果表明，经多柔比星处理的U251细胞（1 µM，20 h）其彗星尾更长且DNA强度更高，提示化疗导致断裂DNA大量累积（图2）。

碱性或中性彗星实验的定量分析均显示，经阿霉素处理后，彗星尾部的形成显著增加（图 3A）表明DNA损伤。结果以均值±标准误表示， t-检验用于统计比较。两种实验中尾矩的定量分析均证实平均尾矩增加：对于碱性彗星实验，0.134 ± 0.0448（n = 52）对比 13.84 ± 1.325（n = 51）， p <0.01；中性彗星实验中，0.596 ± 0.06668（n = 78）与 9.979 ± 0.658（n = 51）相.......

讨论

彗星试验是一种在细胞水平上检测单链和双链DNA断裂的有效工具。该试验已被广泛应用于遗传毒性研究和生物监测领域，被视为“金标准”。¹³，范围涵盖碱基损伤、DNA交联、药物开发以及对碱敏感位点。在本研究中，我们分别展示了碱性彗星实验和中性彗星实验的两种不同、逐步详述的操作方案。结合单细胞电泳、荧光显微镜观察及图像分析，碱性与中性彗星实验均可定量评估DNA损伤的程度 体外.

彗星实验的成功实施需要几个关键步骤。例如，在试剂配制过程中应格外注意。每种溶液都应新鲜配制，并在使用前于适当温度下放置至少30分钟，以防止样品制备过程中发生内源性DNA损伤或修复。另一个关键步骤是制备具有活性的单细胞悬液。使用前应将琼脂糖保持在37 °C，以最大限度地提高彗星载玻片制备过程中的细胞存活率。细胞/琼脂糖悬液应在实验开始前立即配制。使用移液器吸头的侧面来铺展细胞/琼脂糖悬液，有助于在载玻片上形成一层薄的琼脂糖，从而使大多数细胞在显微镜观察时处于同一焦平面上。可选地，可使用金刚石笔尖在载玻片边缘划痕，以增强琼脂糖的附着。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
10x PBS（含Ca++，不含Mg++）	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
月桂酰肌氨酸钠	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
乙酸钠	Sigma	32318
冰乙酸	Sigma	695092
乙酸铵	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520
琼脂糖	Invitrogen	16500
95% 乙醇	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
胰蛋白酶	GIBICO	25300-054
名称	公司	货号	备注
耗材
玻璃组织切片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes 擦镜纸	KIMberly-Clark
1.5 mL 微量离心管	DENVILLE
移液器吸头	SHARP
名称	公司	货号	备注
设备
微波炉	Avanti
水浴锅	PRECISION
水平电泳槽	TREVIGEN	Cometassay ES II
电源	Bio-Rad
培养箱	Quincy Lab	Model 12-140E
荧光显微镜	Zeiss	LSM700
微量移液器	Eppendorf