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方法文章

评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

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DOI：

10.3791/56450

⸱

2017年10月11日

 ,  , 
1Neuro-Oncology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Basic Medical Science Department, Zunyi Medical College-Zhuhai Campus

本文内容

摘要

彗星试验是一种检测DNA损伤（包括单链和双链DNA断裂）的有效方法。我们描述了碱性和中性彗星试验，用于检测癌细胞中的DNA损伤，以评估化疗的治疗效果。

摘要

DNA损伤是细胞在其生命周期中常见的现象，定义为基因组DNA化学结构的改变。放射治疗和化学治疗等癌症疗法会引入大量额外的DNA损伤，从而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡，以限制癌症的进展。在实验性癌症治疗过程中对DNA损伤进行定量评估，是验证基因毒性试剂有效性的关键步骤。本研究聚焦于单细胞凝胶电泳实验（也称为彗星实验），该方法可用于体外定量单链和双链DNA断裂。in vitro。彗星实验是一种高效且易于操作的DNA损伤定量方法，具有时间与预算需求低、重复性高的优点。本文通过评估奥拉帕利与替莫唑胺联合治疗对中国台湾U251胶质瘤细胞的基因毒性效应，重点阐述彗星实验在临床前研究中的应用价值。

引言

彗星试验最初由Ostling和Johanson于1984年在中性条件下通过证明DNA片段从细胞核中迁移而建立1该技术随后由 Singh 进一步发展 等，表明碱性条件显著提高了该检测方法的特异性和可重复性2自那时起，中性彗星实验主要用于检测双链DNA断裂，而碱性彗星实验对较小程度的DNA损伤更为敏感，可检测单链和双链DNA断裂、碱不稳定位点、DNA-DNA或DNA-蛋白交联，以及与不完全切除修复位点相关的DNA单链断裂。3,4两种检测方法均可实现对断裂DNA的可视化，为定量评估DNA损伤提供了简便的方法。彗星试验被认为是检测DNA损伤的敏感方法。 体外 和 体内 遗传毒理学研究，适用于多个研究领域，如早期药物候选物筛选、环境监测、人类生物监测以及DNA损伤与修复的基础研究5.

该检测方法的原理是在电场作用下，断裂的DNA会从核样体（也称为“彗头”）迁移出来，并在琼脂糖凝胶中形成DNA染色区域（也称为“彗尾”）。通过核苷酸染色，可通过对单细胞电泳形成的“彗星”图像进行分析，定量评估DNA损伤程度。计算尾矩可进一步帮助比较不同实验组之间的DNA损伤水平。与传统的DNA损伤检测方法相比，彗星试验具有直接、灵敏、成本低且相对简便的优点。

放射治疗和化学治疗是通过在染色体上产生单链和双链DNA断裂来治疗癌症的常用策略6。近年来，DNA修复抑制剂的发展使得联合化疗能够产生更有效的基因毒性效应，从而可能减少贫血、感染和骨髓抑制等全身性副作用7,8。在本研究中，我们探讨了一种聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂奥拉帕利（Ola）9。PARP是一种丰富的核蛋白，通过形成聚（ADP-核糖）聚合物参与DNA碱基切除修复过程10。替莫唑胺（TMZ）是一种口服有效的烷化剂，已广泛用于胶质瘤患者的治疗。通过使用彗星实验定量DNA损伤，我们证明奥拉帕利与替莫唑胺联合使用可显著增强胶质瘤细胞中的DNA损伤，表明与单独使用替莫唑胺相比，奥拉帕利/替莫唑胺联合治疗是治疗胶质瘤的一种有效策略11。

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方案

1. 准备试剂

  1. 1× PBS
    1. 将 100 mL 10x PBS 用 900 mL dH₂O 稀释2O，并使用 pH 计将 pH 调至 7.4。室温保存。
  2. 裂解液（LS）
    1. 配制 2.5 M NaCl、100 mM 二钠 EDTA、10 mM Tris 碱和 200 mM NaOH 于 900 mL 去离子水中2O；通常需要约 20 分钟使混合物完全溶解。使用 pH 计将 pH 调至 10。加入 1% 十二烷基肌氨酸钠和 1% Triton X-100，定容至 1,000 mL。冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 min。
  3. 碱性电泳液（AES），pH >13
    1. 配制 200 mM NaOH 和 1 mM EDTA 二钠盐于 800 mL 去离子水中2O. 调节pH值，并确保其为pH >13. 将最终体积调至 1,000 mL。使用前新鲜配制并冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 分钟。
  4. 中性电泳溶液（NES）
    1. 通过将 100 mM Tris 碱和 300 mM 醋酸钠溶于 1,000 mL dH₂O 中，配制 1,000 mL 中性电泳缓冲液2O. 用冰醋酸将 pH 调至 9.0，冷却至 4 °C 使用前至少放置 30 min。
  5. DNA沉淀溶液（DPS）
    1. 10 mL 7.5 M 醋酸铵储备液的配制。取6.7 mL 7.5 M醋酸铵与43.3 mL 95%乙醇混合，制得50 mL DNA沉淀溶液。室温保存。
  6. 染色液
    1. 添加 1 µL 10,000倍绿色荧光核酸染料（例如，SYBR Green）溶于30 mL Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM disodium EDTA，pH 7.4）中，保存于 4 °C避光。
  7. 1% 低熔点琼脂糖
    1. 融化1%低熔点琼脂糖（1 g溶于100 mL dH₂O中）2O）中用微波炉加热。每15-20秒摇动一次琼脂糖，确保琼脂糖完全熔化。将琼脂糖置于 37 °C 使用前在水浴中孵育至少 20 分钟。
  8. 预热移液器吸头
    1. 将 P200 移液器吸头的细端切去 3 mm，并在 37 °C 在移取琼脂糖之前。

2. 准备彗星凝胶电泳载玻片

  1. 载玻片包被
    1. 融化1%琼脂糖（1 g溶于100 mL dH₂O中）2在微波炉中加热 2 - 3 分钟，或直至琼脂糖完全融化。将玻璃载玻片浸入琼脂糖中，并用无绒擦拭纸擦拭载玻片的一面。
    2. 将载玻片平放在平坦的表面上晾干或加热处理 50 °C 以加快干燥；干燥后应形成透明的琼脂糖膜。将包被好的载玻片放入 37 °C 使用前
  2. 单细胞悬液的制备
    1. 胶质瘤细胞的培养与处理
      1. 在添加了10% FBS、100 U/mL 青霉素和 10 µg/mL 链霉素在 37 °C 含5% CO₂2.
      2. 使用1 mL胰蛋白酶消化细胞3分钟，用含FBS的DMEM-Ham F-12培养基中和胰蛋白酶。将细胞收集至15 mL离心管中，300 × g离心4分钟，吸除上清液，用培养基重悬细胞至浓度为2 × 10⁶个/mL5 细胞/mL，溶于1×PBS中。
        注意：细胞样本应在开始实验前立即制备，所有样本均需在避光或弱光环境中操作，以防止光照引起的DNA损伤。
      3. 将细胞悬液与1%熔融的低熔点琼脂糖（置于 37 °C) 按1:10 (v/v) 比例混合，轻轻吹打混匀，立即移液 30 µL 将混合物移至载玻片上。用移液器吸头的侧面涂抹琼脂糖/细胞混合物，以确保形成一层薄层。
      4. 将载玻片平放于 4 °C 在黑暗中静置10分钟。将凝胶时间延长至30分钟可提高样品在高湿度环境中的附着性。
      5. 将载玻片浸入 4 °C 在黑暗中静置1小时至过夜。

3. 单细胞电泳

  1. 进行碱性（步骤 3.2）或中性（步骤 3.3）彗星实验
  2. 对于碱性彗星实验
    1. 小心将载玻片从 LS 中取出，沥干多余缓冲液，然后轻轻浸入 AES 中，在 4 °C 下孵育 1 小时以使 DNA 解链。将载玻片避光保存。
    2. 向电泳载玻片槽中加入预冷的 AES，液面高度不得超过载玻片上方 0.5 cm（取决于电泳装置的尺寸），将载玻片放入槽内并盖上盖子。将电源电压设为 1 V/cm（电极之间的距离），在 4 °C 下电泳 30 分钟。
    3. 沥干载玻片上多余的电泳液。在室温下将载玻片轻轻浸入 dH2O 中两次，每次 5 分钟。
    4. 在室温下将载玻片轻轻浸入 70% 乙醇中 5 分钟。进入步骤 4。
  3. 对于中性彗星实验
    1. 小心将载玻片从 LS 中取出，沥干多余缓冲液，然后在 4 °C 下轻轻浸入 NES 中 30 分钟。将载玻片避光保存。
    2. 向电泳载玻片槽中加入预冷的中性电泳缓冲液，液面高度不得超过载玻片上方 0.5 cm（取决于电泳装置的尺寸），将载玻片放入槽内并盖上盖子。将电源电压设为 1 V/cm（电极之间的距离），在 4 °C 下电泳 45 分钟。
    3. 沥干载玻片上多余的缓冲液。在室温下将载玻片轻轻浸入 DPS 中 30 分钟。
    4. 在室温下将载玻片轻轻浸入 70% 乙醇中 30 分钟。进入步骤 4。

4. 染色彗星载玻片

  1. 将载玻片在37 °C下避光干燥10 - 15分钟。
  2. 在每个干燥的琼脂糖凝胶上加入50 - 100 µL绿色荧光核酸染色液，室温避光染色15分钟。
  3. 用dH2O短暂漂洗载玻片，并在37 °C下避光彻底干燥。随后进行图像采集与分析。

5. 图像采集与分析

注意：DNA断裂的可视化与定量基于落射荧光显微镜和彗星图分析软件（见材料表）12。

  1. 将载玻片置于显微镜载物台上，确保琼脂糖凝胶面向物镜。使用配备10倍物镜的荧光显微镜，随机采集染色后彗星实验载玻片的图像。避免采集边缘区域及气泡周围的区域。
  2. 确保每条彗星尾巴呈水平分布，彗星头部应位于左侧，尾部位于右侧。
  3. 将每张图片以二进制TIF格式保存，使DNA染色明亮、背景黑暗。点击工具栏左侧的“选择要分析的文件”按钮，将图像加载到软件中。此时应出现一个图像查看窗口（图1).
  4. 在屏幕上绘制一个测量框，并根据细胞彗星的大小调整其尺寸。点击“Adjust”按钮，根据图像设置头部、彗星和尾部的阈值，然后点击“Start measurements”按钮（图1).
  5. 使用框架选择一个细胞，然后点击“检测彗星”按钮启动测量；选定测量参数的强度图像将显示在“轮廓”窗口。点击“存储结果”按钮可保存结果。图1).
    注意：该软件会计算包括彗星尾部长度、带尾DNA百分比、尾矩（TM）和Olive尾矩（OTM）在内的各项参数。尾矩的计算公式如下：
    TM 计算公式；DNA 损伤分析；方程
    用于DNA损伤评估的OTM方程；公式表示为（Tail.mean减去Head.mean）除以100。
  6. 每种处理至少分析50个细胞。

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结果

本方案详细描述了彗星实验操作与数据分析的逐步流程（图1）。碱性与中性彗星实验结果表明，经多柔比星处理的U251细胞（1 µM，20 h）其彗星尾更长且DNA强度更高，提示化疗导致断裂DNA大量累积（图2）。

碱性或中性彗星实验的定量分析均显示，经阿霉素处理后，彗星尾部的形成显著增加（图 3A）表明DNA损伤。结果以均值±标准误表示， t-检验用于统计比较。两种实验中尾矩的定量分析均证实平均尾矩增加：对于碱性彗星实验，0.134 ± 0.0448（n = 52）对比 13.84 ± 1.325（n = 51）， p <0.01；中性彗星实验中，0.596 ± 0.06668（n = 78）与 9.979 ± 0.658（n = 51）相...

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讨论

彗星试验是一种在细胞水平上检测单链和双链DNA断裂的有效工具。该试验已被广泛应用于遗传毒性研究和生物监测领域，被视为“金标准”。13，范围涵盖碱基损伤、DNA交联、药物开发以及对碱敏感位点。在本研究中，我们分别展示了碱性彗星实验和中性彗星实验的两种不同、逐步详述的操作方案。结合单细胞电泳、荧光显微镜观察及图像分析，碱性与中性彗星实验均可定量评估DNA损伤的程度 体外.

彗星实验的成功实施需要几个关键步骤。例如，在试剂配制过程中应格外注意。每种溶液都应新鲜配制，并在使用前于适当温度下放置至少30分钟，以防止样品制备过程中发生内源性DNA损伤或修复。另一个关键步骤是制备具有活性的单细胞悬液。使用前应将琼脂糖保持在37 °C，以最大限度地提高彗星载玻片制备过程中的细胞存活率。细胞/琼脂糖悬液应在实验开始前立即配制。使用移液器吸头的侧面来铺展细胞/琼脂糖悬液，有助于在载玻片上形成一层薄的琼脂糖，从而使大多数细胞在显微镜观察时处于同一焦平面上。可选地，可使用金刚石笔尖在载玻片边缘划痕，以增强琼脂糖的附着。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所（NCI）和癌症研究中心（CCR）的院内研究计划资助。所有作者均获得了美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所（NCI）和癌症研究中心（CCR）的院内研究基金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
10x PBS（含Ca++，不含Mg++）TEKnovaP0196
NaClSigmaS5886
EDTATEKnovaE0308
Trizma baseSigmaT1503
NaOHSigma72068
月桂酰肌氨酸钠SigmaL7414
Triton X-100Sigma93443
乙酸钠Sigma32318
冰乙酸Sigma695092
乙酸铵SigmaA1542
SYBR GreenInvitrogenS33102
低熔点琼脂糖Invitrogen16520
琼脂糖Invitrogen16500
95% 乙醇WARNER-GRAHAM#64-17-5
胰蛋白酶GIBICO25300-054
名称公司货号备注
耗材
玻璃组织切片ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES63422-11
Kimwipes 擦镜纸KIMberly-Clark
1.5 mL 微量离心管DENVILLE
移液器吸头SHARP
名称公司货号备注
设备
微波炉Avanti
水浴锅PRECISION
水平电泳槽TREVIGENCometassay ES II
电源Bio-Rad
培养箱Quincy LabModel 12-140E
荧光显微镜ZeissLSM700
微量移液器Eppendorf

参考文献

  1. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  2. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  3. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  4. Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).
  5. Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
  6. Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
  7. Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment? Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
  8. Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157(2015).
  9. Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).
  10. Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).
  11. Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).
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  13. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).
  14. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  15. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200(2014).

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