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诱导C57BL/6小鼠实验性自身免疫性神经炎以进行功能与神经病理学评估的简易方法

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DOI：

10.3791/56455

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2017年11月9日

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1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

本文内容

摘要

本报告概述了一种利用髓鞘蛋白零（P0）180-199 肽段联合完全弗氏佐剂和百日咳毒素成功诱导实验性自身免疫性神经炎（EAN）的简便方法。我们提出了一种精密的实验范式，可用于准确评估该EAN模型中出现的功能缺陷程度及神经病理学变化。

摘要

实验性自身免疫性神经炎（EAN）是一种被广泛认可的自身免疫性周围神经系统脱髓鞘疾病的实验模型。通过使用神经源性多肽免疫小鼠，可诱导机体对周围神经系统（PNS）组分产生炎症攻击，从而建立EAN疾病模型。近年来的技术进展使得在相对抗性的C57BL/6小鼠品系中也能成功诱导EAN，方法是将髓鞘蛋白零（P0）106-125 或 P0180-199 多肽与佐剂联合使用，并辅以百日咳毒素注射。在C57BL/6品系中成功诱导EAN，使得研究者能够利用该小鼠背景下的多种遗传学工具，从而可深入研究疾病发病机制，并结合转基因技术探究新型治疗手段的作用机理。在本研究中，我们展示了一种使用P0180-199 多肽在C57BL/6小鼠中成功诱导EAN的简便方法。同时，我们还概述了评估该模型中出现的功能缺陷的实验方案，并描述了伴随的一系列神经病理学特征。因此，该模型是研究人类周围神经系统脱髓鞘性神经病发病机制的有力工具，也可用于评估旨在促进髓鞘修复和防止自身免疫性神经炎中神经损伤的潜在疗法的有效性。

引言

周围神经病的病因可能是遗传性的，也可能是获得性的，其中获得性神经病可由代谢、缺血、炎症或毒性因素诱发。这些疾病根据病因还可有效地分为轴突性或脱髓鞘性两类。最常见的获得性脱髓鞘性周围神经病包括急性炎性脱髓鞘性多发性神经病（AIDP，又称吉兰-巴雷综合征，GBS）和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病（CIDP）1,2,3,4；这两种疾病在发病机制上均以针对髓鞘的自身免疫反应为特征，导致周围神经发生脱髓鞘。在这些疾病中，活化的T细胞穿过神经的血-神经屏障，在周围神经系统（PNS）内引发免疫反应。随后神经内的巨噬细胞被激活，通过吞噬攻击或分泌炎性介质间接作用，引起脱髓鞘，从而导致临床上的瘫痪和感觉功能障碍等残疾表现5。尽管脱髓鞘后的轴突仍具备再髓鞘化的潜力，但再髓鞘化过程常常延迟或不完全，使得裸露的轴突易于遭受不可逆损伤，这是造成永久性临床功能障碍的主要原因。目前最有效的治疗方法是免疫调节疗法，但尽管治疗有效，许多患者的恢复过程仍然缓慢，约25%的患者将遗留功能性缺陷，显著降低其生活质量6,7。

EAN 是一种广泛使用的脱髓鞘性周围神经病动物模型，为研究其发病机制以及评估新型治疗药物提供了重要依据4。该模型可在多种物种中诱导建立，如家兔、大鼠、小鼠和豚鼠，通常通过免疫神经源性抗原实现。然而，EAN 是否成功诱导最终取决于机体是否产生适当的免疫反应。鉴于不同物种（以及种内/品系间）在免疫功能上存在差异，研究人员已开发出多种抗原与佐剂的组合方案，以成功诱导 EAN。在小鼠遗传学工具的应用方面，C57BL/6 品系使用最为广泛；然而，传统上用于易感 SJL 小鼠品系的 P2 蛋白肽段 57-81（P257-81）8，在 C57BL/6 品系中无法引发导致功能障碍的病理过程。幸运的是，采用 P0106-125 或 P0180-199 肽段致敏，并联合佐剂及百日咳毒素注射的致敏方案可克服这一障碍，从而使得复杂的小鼠遗传学工具能够在 EAN 模型中得以应用。

本文介绍了一种在C57BL/6小鼠中诱导EAN的简单方法，并提供了一套全面且详细的评估该疾病相关功能障碍和神经病理学缺陷的方案。优先选用P0180-199肽段9，而非P057-81肽段10。据文献报道，与P057-81模型相比，P0180-199模型所引发的临床症状较轻10，因此更有可能耐受潜在有害的遗传干扰，能够从手术操作（如渗透泵植入）中恢复，并适用于跑台步态功能检测4。然而，本文所述的跑台步态功能检测及组织学实验流程亦可轻松应用于P057-81诱导型疾病模型的研究中。

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方案

本文所述所有实验程序均经弗洛里神经科学与心理健康研究所（墨尔本脑研究中心）动物伦理委员会批准，并遵循《澳大利亚科学研究中动物使用行为规范》。

1. EAN 诱导

注意：EAN 可在 6 至 8 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠中成功诱导。诱导程序总共需要 9 天。第 0 天指首次免疫当天。本方案中的注射操作均在麻醉下进行 （见下文步骤 1.1.2）。

  1. 在第 -1 天：
    1. 制备百日咳毒素（参见 材料表使用无菌的0.1 M小鼠等渗磷酸盐缓冲液（MT-PBS）配制1.6 µg/mL的溶液。
    2. 异氟烷麻醉：
      1. 将小鼠（C57BL/6，雄性，6–8周龄）放入麻醉室，并调节氧气流速至1 L/min。
      2. 打开异氟烷蒸发器，调节至2.5%用于麻醉，监测呼吸并等待2分钟，或直至主要反射（角膜和后肢反射）不再有反应 
    3. 将小鼠从麻醉室中取出，使用带有30号针头的0.5 mL注射器，通过腹腔（i.p.）注射250 µL上述百日咳毒素溶液。1/2 G针
    4. 制备用于免疫接种的可注射接种物：
      1. 准备 溶液A 使用 2 mg/mL 的 P0 溶液180-199 肽（含 > 98% 纯度，序列 S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S）溶于 0.9% 生理盐水中。
      2. 准备 溶液B 使用20 mg/mL的溶液 结核分枝杆菌 （参见 材料表) 在弗氏完全佐剂（FCA，成分：15% 单油酸甘露醇酯 + 85% 石蜡油，含 0.5 mg/mL 干燥灭活的 M Mycobacterium butyricum).
      3. 为制备最终接种液，将溶液A与溶液B等体积混合于振荡研磨仪中，在室温下以最大速度混合1分钟。
        注意：溶液A和B可作为储备液保存，在4 °C下最多可保存一个月，但混合后的最终接种液必须在小鼠注射当天新鲜配制。
  2. 在第0天，使用23 G针头通过皮下注射将50 µL接种物（步骤1.1.4中所述制备）注入小鼠体内。
    注意：注射部位可选择肩胛骨之间，或后肢与尾部之间的尾背部区域。
  3. 第1天，配制1.2 µg/mL（溶于MT-PBS）的百日咳毒素溶液，使用带30号针头的0.5 mL注射器，通过腹腔注射方式向小鼠注入250 µL。1/2 G针
  4. 第3天，重复上述步骤1.3。
    注意：储备液A和B可配制后于4 ˚C保存，最长保存时间为一个月。然而，将储备液A与B混合后所得的最终注射用接种物必须在注射当天配制。
  5. 第8天，通过皮下注射方式，将50 µL接种物（制备方法见步骤1.1.4）注入小鼠体内，注射部位与步骤1.2中所述相同（每只动物均如此操作）。

2. 临床评分

  1. 从第0天开始每天进行临床评分。
  2. 根据已发表的标准4，为每只小鼠分配0、1、2、3或4的评分。EAN临床评分见表1。
    注意：为了保持一致性，应尽量由同一名研究人员每天在同一时间对小鼠进行评分。

3. 运动功能评估

注意：对同一批动物，在进行临床评分的同时平行评估其运动功能。运动功能评估装置必须连接至安装有步态功能成像系统（参见材料表）的计算机。建议在诱导实验性自身免疫性神经炎（EAN）前，使所有待测小鼠先适应跑步任务。为此，应在疾病诱导前3天（第-3天）进行练习运行（每只小鼠进行2次测试运行）。

  1. 打开运动功能评估装置，并按下光源按钮。
  2. 牢固地抓起小鼠的颈背部皮肤，同时握住其尾巴，将其足部浸入装有红色印泥的容器中进行蘸墨。
    注意：此步骤适用于C57BL/6品系小鼠，若使用白色被毛品系的小鼠则可省略此步骤。
  3. 将小鼠放入行走舱内，并将跑步机速度设定为15 cm/s。
  4. 启动跑步机，并点击 "记录" 按钮，利用步态功能成像系统（见材料表）捕捉小鼠的奔跑运动。
  5. 使用计时器，每次记录运行过程持续36秒。36秒后，停止录制并关闭跑步机。
    注意：若小鼠无法在36秒内顺利完成跑步任务，则视为测试失败。
  6. 将视频文件保存至指定文件夹中。
  7. 对每只待评估的小鼠重复上述步骤。每3天使用相同的跑步任务对小鼠进行一次测试。
  8. 使用步态功能参数分析软件对编辑后的视频文件进行分析（见材料表）。
    注意：不同软件对各项运动参数的分析方法有所不同，因此在分析前请参考制造商提供的操作说明。若需通过免疫组织化学或电子显微镜获取轴突和髓鞘损伤的组织学证据，可在运动功能评估后的任意阶段根据具体研究目的采集动物组织样本。

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结果

在C57BL/6小鼠中，P0180-199 肽诱导的实验性自身免疫性神经炎（EAN）表现为单相病程，临床评分从首次免疫后第6天（dpi）开始出现症状，至第25天达到最高疾病严重程度，随后从第40天起临床评分有所改善（图1）4,9。在步态功能方面，小鼠最早在首次免疫后第6天即开始无法完成简单的跑步任务；到第35天时，小鼠几乎无法完成简单的跑步机跑步任务，且即使到第55天，其跑步能力也未见改善4（图1）。随着病程进展，EAN诱导的小鼠执行跑步任务的能力持续下降。80%的小鼠出现跑步任务失败，此外，在跑步机上跑步时后肢步态增宽是一个关键的功能缺陷，且在整个疾病过程中未能恢复4。

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讨论

本报告概述了一种在C57BL/6小鼠中使用P0180-199 肽诱导实验性自身免疫性神经炎（EAN）的简单方法，可用于量化EAN诱导小鼠的关键神经病理学和功能缺陷。本方法与以往EAN诱导方案的不同之处在于免疫注射过程中使用麻醉。使用异氟烷麻醉可显著提高操作的准确性，确保将全部接种体积精确地皮下注射至目标部位，同时将动物的误差和应激降至最低。

采用此EAN诱导方法，小鼠从感染后第6天（dpi）开始出现疾病的临床症状4。然而，既往研究报道，根据临床评分所测定的疾病 onset 可能从约感染后第10天（dpi）开始9,10。这种临床评分所确定的疾病 onset 时间差异，可能部分归因于不同的临床评分标准，但更可能的原因在于EAN诱导所用接种物中采用了不同的佐剂。本方案使用含有M. butyricum的完全弗氏佐剂，并额外添加M. tuberculosis进行补充。而其...

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披露

作者们对本研究无任何利益冲突。

致谢

DGG 是澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）Peter Doherty 和澳大利亚多发性硬化症研究协会（MSRA）的早期职业研究员。JLF 获得了澳大利亚多发性硬化症研究协会（MSRA）博士后奖学金的支持。本研究得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）项目资助 #APP1058647（资助对象：JX）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6，雄性，6-8周龄澳大利亚生物资源中心，西澳大利亚州，澳大利亚
百日咳毒素List Biological Laboratories, Inc.，加利福尼亚州，美国#181
0.1 M 小鼠等渗磷酸盐缓冲盐水（MT-PBS）各实验室应使用其自定的方案。
异氟烷Pharmachem，昆士兰州，澳大利亚各实验室应使用其自定的给药方案。
P0180–199肽无锡诺和生物科技有限公司，上海，中国P0180–199，序列 S–S–K–R–G–R–Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
热灭活结核分枝杆菌（H37RA菌株）Difco，密歇根州，美国#231141
完全弗氏佐剂（FCA）Difco，密歇根州，美国#263910
16% 多聚甲醛（PFA）电子显微镜服务公司#15710组织采集当天稀释至4% PFA。
25% 戊二醛ProSciTech Pty Ltd，昆士兰州，澳大利亚#11-30-8固定当天稀释至2.5% 戊二醛。
叠氮化钠Chem-Supply Pty Ltd，南澳大利亚州，澳大利亚SL189在0.1 M MT-PBS中配制10%（w/v）储备液，使用浓度为0.03%（v/v）。
蔗糖Chem-Supply Pty Ltd，南澳大利亚州，澳大利亚SA030使用浓度为30%（w/v）。
最佳切割温度（OCT）包埋介质Sakura Finetek，加利福尼亚州，美国#4583
正常驴血清Merck Millipore，马萨诸塞州，美国#S30-100用作抗体稀释液时浓度为10%（v/v），或根据实验室条件确定其他浓度。
Triton-X 100Sigma Aldrich，密歇根州，美国#90o2-31-1在抗体稀释液中使用浓度为0.3%（v/v），或根据实验室条件确定其他浓度。
兔抗淀粉样前体蛋白（APP）抗体Invitrogen（Life Technologies），加利福尼亚州，美国S12700使用稀释比例为1:400，或在实验室中进行滴定优化。
兔抗接触蛋白相关蛋白-1（Caspr）抗体由以色列魏茨曼科学研究所Elior Peles教授惠赠使用稀释比例为1:500，或在实验室中进行滴定优化。
相应的Alexa Fluor标记的二抗Molecular Probes（Life Technologies），俄勒冈州，美国多种使用稀释比例为1:200，或在实验室中进行滴定优化。一抗来源物种及所选Alexa Fluor染料由各实验室自行决定。
水性封片液Dako（Agilent），加利福尼亚州，美国#S3023各实验室可根据偏好选择。
名称公司目录编号备注
设备
0.5 mL 注射器配301/2 g 针头BD#326105
23 g 针头BD#305143
红色印台可使用任意红色印台或红色食用染料标记动物足部。
DigiGate 装置（含跑步机）eMouse Specifics Inc.，弗雷明汉，马萨诸塞州
DigiGate 成像系统eMouse Specifics Inc.，弗雷明汉，马萨诸塞州
秒表可使用任意计时器。
DigiGait 8 软件eMouse Specifics Inc.，弗雷明汉，马萨诸塞州
解剖显微镜Zeiss可使用任何合适的解剖显微镜。
带电载玻片Superfrost Plus，Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
冷冻切片机Leica可使用任何合适的冷冻切片机。
灌流设备及解剖器械各实验室应使用其自定的灌流方案。
不透光加湿室实验室可使用不透明塑料容器自制。
PAP笔GeneTex（美国）也可使用蜡笔或利用表面张力在组织切片周围形成液滴区域。
共聚焦显微镜Zeiss LSM780可使用任何具备适当激光线的共聚焦显微镜。
FIJI/ImageJ美国国立卫生研究院可从 www.fiji.sc 获取。

参考文献

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EAN P0 180 199

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