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生物素标记的细胞穿透肽用于研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用

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DOI：

10.3791/56457

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2017年12月20日

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 2Centre for Cancer Research & Cell Biology (CCRCB), School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University Belfast

本文内容

摘要

本实验方案基于生物素-亲和素沉淀系统，并结合细胞穿透序列，用于研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用。其主要优势在于目标序列与活细胞共同孵育，而非细胞裂解物，因此相互作用可在细胞生理环境下发生。

摘要

本文介绍一种基于广泛应用的生物素-亲和素沉淀系统的细胞内蛋白质-蛋白质相互作用研究方案。本方案的改进之处在于将该技术与细胞穿膜序列相结合。我们建议设计可穿透细胞的诱饵分子，使其直接与活细胞共孵育，而非使用细胞裂解物，从而确保所发现的相互作用真实反映细胞内环境中的情况。连接蛋白43（Cx43）是一种可形成间隙连接通道和半通道的蛋白质，在高级别胶质瘤中其表达下调。Cx43中包含第266至283位氨基酸的区域可抑制胶质瘤细胞中癌基因c-Src的活性。在此，我们以TAT作为细胞穿膜序列，生物素作为沉淀标签，以Cx43中第266至283位氨基酸区域为靶标，在难转染的人胶质瘤干细胞中寻找细胞内相互作用。该方法的一个局限性在于，作为诱饵的分子可能无法正确折叠，因此所发现的相互作用可能与实际生物学效应无关。然而，该方法对于研究信号转导通路中的相互作用尤为有价值，因为这类相互作用通常由内在无序区域介导，无需形成有序的折叠结构。此外，该方法的一个优势在于可方便地研究每个氨基酸残基在相互作用中的作用。该系统具有模块化特点，因此可替换使用其他细胞穿膜序列、其他标签或其他细胞内靶标。最后，本方案的应用范围远不止于蛋白质-蛋白质相互作用研究，该系统还可应用于其他可被细胞穿膜序列转导并融合沉淀标签的生物活性分子，如RNA序列、纳米颗粒、病毒或其他分子，以研究其细胞内作用机制。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用对于多种细胞过程至关重要。为了充分理解这些过程，需要采用能够在复杂的细胞内环境中鉴定蛋白质相互作用的方法。目前最常用的方法之一是将目标蛋白质或其部分区域的模拟肽段作为“诱饵”，在亲和沉淀实验中捕获与其相互作用的蛋白质，随后检测结合的蛋白质。其中，亲和素-生物素系统因其亲和素与生物素之间具有高亲和力、高特异性和稳定的结合能力而被广泛使用1,2。通常，生物素通过共价键连接到诱饵（蛋白质或肽段）上，然后与细胞裂解液孵育一段时间，以允许相互作用的形成。之后，利用与固相微珠偶联的亲和素或其衍生物将生物素标记的诱饵及其细胞内相互作用伙伴沉淀下来。经过洗涤、洗脱，并通过变性电泳分离后，再经蛋白质印迹（Western blot）分析检测诱饵蛋白的相互作用。该技术的一个问题是，目标蛋白与其细胞内相互作用伙伴之间的结合发生在细胞环境之外。这一点对于信号转导通路中的相互作用尤为重要，因为这些相互作用通常发生在特定的亚细胞区域，具有瞬时性，且由丰度较低的蛋白质介导。因此，在细胞裂解液中，这些相互作用可能被其他高丰度蛋白掩盖，或受到通常不处于空间邻近位置的蛋白的干扰。

细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs）是一类短肽（≤40个氨基酸），主要由带正电荷的氨基酸组成，能够将多种分子高效地转运至几乎所有类型的细胞中3。已有研究表明，蛋白质、质粒DNA、siRNA、病毒、成像剂以及多种纳米颗粒等货物分子均可与CPPs偶联，并被有效内化4,5。由于具有这种转运能力，CPPs也被称为蛋白转导结构域（protein transduction domains, PTDs）、膜转位序列（membrane translocating sequences, MTSs）或特洛伊肽（Trojan peptides）。在众多CPPs中，来源于HIV转录激活蛋白TAT的TAT肽是研究最为广泛的一种6，7,8,9。TAT是一种九肽，包含6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此具有很强的阳离子特性。取代实验表明，TAT所带的净正电荷对于其与真核细胞质膜之间的静电相互作用及其后续的内化过程至关重要10。与其他CPPs类似，带正电荷的TAT可通过静电作用强烈结合细胞膜外表面存在的多种带负电荷的成分，包括脂质头部基团、糖蛋白和蛋白聚糖3,10。TAT所携带的生物活性货物在进入细胞后可迅速在细胞质中释放，从而与其细胞内靶标分子结合并发挥作用。

本文介绍一种将TAT CPP与生物素结合以研究细胞内相互作用的方法。该方法旨在通过将目标生物分子与TAT和生物素融合，设计出可穿透细胞的诱饵分子。此策略的主要优势在于，诱饵分子与其相互作用伙伴之间的结合可在其天然细胞环境中发生。为验证该方法的有效性，我们选用连接蛋白Cx43的一段小片段作为诱饵，该片段已被报道可在细胞内与原癌基因c-Src发生相互作用11,12,13。Cx43是一种跨膜蛋白，在星形胶质细胞中广泛表达14，而在高级别胶质瘤（中枢神经系统最常见的恶性肿瘤）中表达下调15,16,17,18。已有研究表明，将人Cx43中与c-Src相互作用的区域（氨基酸266-283；Pubmed: P17302）与TAT融合（TAT-Cx43266-283），可抑制胶质瘤细胞及胶质瘤干细胞（GSCs）中c-Src的致癌活性19,20,21。为构建细胞内诱饵分子，我们将Cx43266-283在其N端与TAT融合（TAT-Cx43266-283），C端与生物素连接（TAT-Cx43266-283-B）。该策略已在大鼠胶质瘤C6细胞系中成功应用，鉴定了c-Src、C端Src激酶（CSK）以及磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）为Cx43该区域的细胞内相互作用蛋白20。本文中，我们描述了该方法在人源GSCs中的应用，以验证其有效性。GSCs在胶质瘤治疗中具有重要意义，但相较于非干细胞型胶质瘤细胞，其转染难度显著更高。

方案

所有实验操作均在萨拉曼卡大学完成。

1. 细胞

  1. 在开始实验前两天，将细胞以所需密度接种，使其在实验当天达到汇合状态。可将细胞接种于培养瓶或培养板中，但从培养板中提取蛋白更为方便。为确保结果的可靠性，建议每个实验条件至少准备4个78 cm2的培养板或2个150 cm2的培养瓶。
  2. 本研究中，将人源G166 GSCs细胞接种于4个150 cm2的培养瓶中，使用RHB-A干细胞培养基培养，培养基中添加2% B27、1% N2、20 ng/mL EGF和b-FGF，具体方法参照Pollard等22的描述。当细胞达到汇合状态时进行处理。例如，将5 × 106个G166细胞接种至150 cm2培养瓶后，于接种后第2天进行处理。

2. 生物素标记的CPPs

  1. 将含有冻干的生物素化细胞穿透肽（BCPPs）的小管在8200 × g 条件下离心30秒，以避免部分粉末残留在管盖上。应设置对照用BCPP，以确保所检测到的相互作用是针对目标序列的特异性结合。在本研究中，对照BCPP为TAT-生物素（TAT-B），处理用BCPP为TAT-Cx43266-283-B。也可使用其他对照，例如TAT与随机序列或突变片段连接生物素的融合肽。
  2. 将BCPPs溶解于制造商指定的相应培养基中，配制成储备液；例如，为获得浓度为2 mg/mL的BCPP储备液用于处理GSCs，需向含有1 mg BCPP的小管中加入0.5 mL GSC培养基。涡旋混匀，并确保肽充分溶解。

3. 试管

注意：在第 7 节中，每种条件至少准备十二个 1.5 mL 离心管。

  1. 为每种条件标记前3个试管。这些试管将装有步骤6.4中获得的细胞裂解液的总体积。
  2. 为每种条件标记3个标有“A”的试管。这些试管将装有裂解细胞裂解液并离心后获得的第一次上清液（步骤7.2）。
  3. 为每种条件标记3个标有“B”的试管。这些试管将装有第一次上清液的一小部分等分试样。这些裂解液将作为步骤7.3中的Western印迹样品。
  4. 为每种条件标记3个标有“C”的试管。这些试管将装有使用NeutrAvidin进行下拉反应后获得的上清液（步骤7.7）。
    注意：如果Western印迹未检测到目标蛋白信号，表明蛋白未被成功下拉或在实验过程中丢失，则此步骤非常重要。若出现此情况，应重复蛋白下拉过程。

4. 使用 BCPPs 进行细胞处理

  1. 吸去培养基。
  2. 根据孵育时间，用最小体积的新鲜培养基替换相应体积，以孵育BCPPs。必须确保培养基完全覆盖培养皿/瓶的整个表面，防止细胞干燥，例如，30分钟孵育时每150 cm2使用6 mL培养基。
  3. 向细胞培养物中加入BCPP储备液的相应体积，使其达到已证实有效的浓度。本研究中已证实50 µM TAT-Cx43266-283-B可抑制GSC增殖。
    1. 因此，每毫升培养基中加入92.8 µL浓度为2 mg/mL的TAT-Cx43266-283-B（分子量=3723.34 g/mol），以获得50 µM的终浓度TAT-Cx43266-283-B。若对照肽类所需添加体积不同，则用培养基补足至相同终体积。例如，每毫升培养基中加入49.1 µL TAT-B（分子量=1914.31 g/mol）和43.7 µL GSC培养基，以获得50 µM的终浓度TAT-B。
  4. 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟，以确保BCPP与其细胞内相互作用分子之间的结合发生。若相互作用所需时间更长，则应延长孵育时间；若实验设计为时间进程实验，则相应调整孵育时间。此外，可通过激活或抑制不同的细胞内信号通路来促进或阻止目标相互作用的发生。

5. 缓冲液与溶液。

  1. 配制 PBS（pH 7.4）：136 mM NaCl；2.7 mM KCl；7.8 mM Na2HPO4·2H2O；1.7 mM KH2PO4。
  2. 配制蛋白裂解缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 8.0），137 mM NaCl，1% IGEPAL。使用前加入以下成分：蛋白酶抑制剂混合物（v/v）1/100、1 mM 氟化钠、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 0.1 mM 原钒酸钠。
  3. 配制 Laemmli 缓冲液（4×）：0.18 M Tris-HCl（pH 6.8）；5 M 甘油；3.7% SDS（p/v）；0.6 M β-巯基乙醇或 9 mM DTT；0.04%（v/v）溴酚蓝（BB）。

6. 蛋白质提取

注意：蛋白质提取按照先前所述方法进行20,23。本操作步骤的整个部分需在 4 °C 下进行。

  1. 完全吸除培养基。
  2. 每 150 cm2 用 3 × 10 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）小心清洗，避免细胞脱落。
  3. 为获得细胞裂解液，每 150 cm2 加入 3 mL 裂解缓冲液，用细胞刮刀彻底刮取培养表面。将培养皿或培养瓶倾斜约 45 度，有助于将细胞裂解液收集至相应的离心管中。
  4. 将 1 mL 细胞裂解液分装至三个 1.5 mL 离心管中。这些离心管应按照步骤 3.1 的要求标记实验条件和重复编号。

7. 下拉实验

  1. 在 4 °C 条件下，以 11,000 x g 离心 1.5 mL 离心管 10 分钟。
  2. 将上清液转移至新的离心管中（A）。
  3. 按不同实验条件，取此上清液等分试样至不同的离心管（B），例如每管 50 µL。加入 4x Laemmli 缓冲液（每 50 µL 裂解液加 16.6 µL），并在 -20 °C 冻存。这些裂解液将作为常规 Western 印迹样品使用。
  4. 通过轻轻振荡充分混匀 NeutrAvidin 琼脂糖。剪去移液器吸头的尖端以增大其直径，从而改善珠粒的移液操作。每毫升细胞裂解液向（A）管中加入 50 µL NeutrAvidin 琼脂糖。
  5. 在 4 °C 条件下轻轻振荡孵育过夜，使 NeutrAvidin 与结合在其细胞内伴侣蛋白上的 BCPPs 相互作用。
  6. 在 4 °C 条件下以 3,000 x g 离心 1 分钟，以收集 NeutrAvidin 与蛋白质形成的复合物。
  7. 小心移除上清液并转移至洁净的离心管（C）。保留这些上清液，以便在 pull-down 实验失败时使用。
  8. 洗涤步骤：向沉淀物（A 管）中加入新鲜裂解缓冲液，通过倒置混匀，并重复步骤 7.6）和 7.7）共额外 5 次。所有这些上清液均可弃去。
  9. 移除上清液，并加入 2x Laemmli 缓冲液至所需终体积（对于来自 150 cm2 培养瓶融合细胞的沉淀物，每 1.5 mL 离心管加 40 µL）。
  10. 在 100 °C 条件下洗脱 5 分钟，以解离蛋白质之间的相互作用，然后在 8,200 x g 条件下离心 30 秒，使 NeutrAvidin 珠粒沉淀。
  11. 用毛细管吸头吸取含有解离蛋白质的上清液至新的离心管（D）。若需重复洗脱步骤，可保留珠粒。
    注意：上清液（D 管）现已准备好用于 Western 印迹上样，或可在 -20 °C 冻存。

8. 蛋白质印迹

注意：Western blotting 的操作步骤如前所述24。

  1. 在Midi-Cell电泳系统中，将每个样品等体积上样至Bis-Tris（4-12%）中型凝胶的各泳道。
  2. 使用干转系统将蛋白质转印至硝酸纤维素常规叠层膜上。
  3. 用10% Ponceau染色液对膜染色10分钟。
  4. 用5 mL TTBS缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。
  5. 用含7%脱脂奶粉的TTBS缓冲液在试管或小盒中室温轻摇封闭膜1小时。确保所用体积足以覆盖膜且膜不干燥，i.e. 每张完整的中型膜使用40 mL。
  6. 用5 mL TTBS缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。
  7. 在4 °C条件下，加入针对目标蛋白的一抗，轻摇孵育过夜。
  8. 用5 mL TTBS缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。
  9. 室温下，在TTBS缓冲液中加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，轻摇孵育1小时。
  10. 用5 mL TTBS缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。
  11. 使用化学发光底物在化学发光检测系统中显影。

9. 问题解决

  1. 如果在显影 Western 印迹后，任何样品的蛋白均无信号，请检查 Ponceau 染色结果。
    注意：Ponceau 染色的膜上应在加样泳道中显示出大量且界限不清的条带。如果条带不明显，可能是上样蛋白量不足或转膜过程出现问题。建议重新进行 Western 印迹实验。
  2. 如果 Ponceau 染色的膜上所有泳道均无任何染色信号，请从 (C) 管的步骤 7.4 开始重新进行整个实验流程。
  3. 如果在显影 Western 印迹后蛋白信号非常弱，但 Ponceau 染色显示蛋白存在，可将膜与一抗再次孵育更长时间。如果信号仍然较弱，可改为在室温下再次孵育。

10. 本文使用的其他技术

  1. BCPPs的免疫细胞化学
    1. 用 4% 多聚甲醛固定细胞（每平方厘米 0.2 mL）220 分钟
    2. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟（每平方厘米 0.2 mL）2).
    3. 加入相应的抗体（每平方厘米至少0.15 mL）2在4°C下，用抗体溶液按照制造商推荐的浓度稀释，针对目标蛋白孵育过夜。
    4. 孵育荧光染料标记的二抗（每平方厘米0.15 mL）2室温下孵育 2 小时。
    5. 重复步骤 10.1.2–10.1.4，使用针对目标蛋白的其他一抗。注意不要对不同的初级抗体使用同一物种来源的抗体，或对次级抗体使用相同波长的荧光染料。
    6. 使用抗荧光淬灭剂封片（每平方厘米0.005 mL）2).
    7. 使用连接数字相机的荧光显微镜进行观察分析。
  2. MTT 比色法
    1. 在37 °C下，将细胞接种于24孔板中进行培养。
    2. 在避光条件下，每平方厘米加入0.15 mL培养基，孵育细胞75分钟2 含 0.5 mg/mL MTT。
    3. 吸弃培养基，加入二甲基亚砜（每平方厘米0.25 mL），避光孵育10分钟。2轻柔振荡。
    4. 使用酶标仪在570 nm波长下测定吸光度。

结果

在使用BCPPs研究细胞内相互作用之前，至关重要的是比较BCPP与CPP的作用，以验证使用BCPP所获得的结果。因此，为了研究生物素的引入是否会影响目标序列的活性，我们首先分析了TAT-Cx43266-283-B与TAT-Cx43266-283对G166 GSCs形态的影响。为此，我们在处理24小时后对两种细胞骨架蛋白F-actin和α-tubulin进行了免疫荧光分析。图1显示，在50 µM TAT-Cx43266-283或TAT-Cx43266-283-B存在下，G166 GSCs呈现出更圆润的形态，而对照组（TAT或TAT-B处理）则表现出细长且扩展的细胞突起。事实上，图1b显示，当细胞经TAT-Cx43266-283或TAT-Cx43266-283-B处理时，肌动蛋白丝主要组装为肌动蛋白网络，而在对照细胞（经TAT或TAT-B处理）中则形成更多的肌动蛋白束25。相比之下，α-tubulin的分布在这不同条件下没有明显变化。这些结果表明，生物素的存在并未改变目标序列对G166 GSCs形态的影响。在先前的研究20,21中，我们已证明TAT-Cx43266-283可减少G166 GSCs的增殖。在本研究中，我们进一步探究TAT-Cx43266-283-B是否与TAT-Cx43266-283在生长抑制方面具有相同的效果。为此，我们通过MTT法分析了处理72小时后的G166 GSCs增殖情况。MTT法是一种用于评估细胞代谢活性的比色法。MTT可被线粒体中的NAD(P)H氧化还原酶代谢，其产物量反映存活细胞的数量。图2显示，当细胞经50 µM TAT-Cx43266-283或50 µM TAT-Cx43266-283-B处理时，G166 GSCs细胞活力的降低程度无显著差异。事实上，与对照组TAT或TAT-B相比，两种处理均显著抑制了G166 GSCs的增殖。

在确认目标序列在G166 GSCs中的效应（TAT-Cx43266-283）不会因在C末端添加生物素（TAT-Cx43266-283-B）而改变后，我们依据本研究中所述方案检测了该序列的细胞内相互作用蛋白（图3）。由于小窝（caveolae）已被证实参与TAT的内吞机制26，我们分析了pull-down产物中caveolin-1（Cav-1）的存在情况。Western blot分析（图4）显示，TAT-B和TAT-Cx43266-283-B均能与Cav-1相互作用。然而，TAT-Cx43266-283-B招募c-Src、PTEN和CSK的能力强于TAT-B。黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）是c-Src的底物，但尚未发现其与Cx43存在相互作用。事实上，FAK与TAT-B或TAT-Cx43266-283-B均未表现出显著的相互作用。

为了验证 TAT-Cx43266-283-B 与 c-Src 之间的相互作用，将 G166 GSC 细胞用 50 µM TAT-Cx43266-283-B 孵育 30 分钟，并通过共聚焦显微镜使用荧光标记的链霉亲和素追踪其定位（图 5）。我们的结果表明，TAT-Cx43266-283-B 的细胞内分布靠近质膜（由磷脂酰丝氨酸染色显示），且与 c-Src 的分布一致。事实上，共定位分析显示，在合并图像中，TAT-Cx43266-283-B 与 c-Src 之间存在一些共定位点（白色）。因此，共聚焦显微镜研究证实了本研究中所述 BCPP 拉下实验所获得的结果。

显示F-肌动蛋白、α-微管蛋白染色及细胞内蛋白质定位的荧光显微镜示意图
图1：BCPP与CPP对GSC形态的影响。
将G166 GSC以低密度（2 × 104 个细胞 / cm2）接种，24小时后分别用50 µM对照CPP（TAT）、对照BCPP（TAT-B）、处理用CPP（TAT-Cx43266-283）或处理用BCPP（TAT-Cx43266-283-B）孵育。a) 同一视野中F-肌动蛋白（红色）、α-微管蛋白（绿色）的免疫荧光染色及与DAPI的合并图像，显示G166 GSC的形态。标尺 = 50 µm。b) F-肌动蛋白免疫荧光染色显示，经50 µM对照CPP（TAT）或对照BCPP（TAT-B）孵育24小时后，G166 GSC中F-肌动蛋白分布与经50 µM处理用CPP（TAT-Cx43266-283）或BCPP（TAT-Cx43266-283-B）处理后的差异。标尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

MTT 检测柱状图；比较细胞活力，处理组：对照组、TAT 变体；吸光度数据。
图 2：BCPP 和 CPP 对 GSC 细胞活力的影响。
将 G166 GSCs 以 5500 个细胞/cm2 的密度接种于 24 孔板中，并与 50 µM 对照肽、CPP（TAT）或 BCPP（TAT-B），或 50 µM 处理肽 CPP（TAT-Cx43266-283）或 BCPP（TAT-Cx43266-283-B）共同孵育。72 小时后采用 MTT 法检测细胞活力。结果以 MTT 吸光度值表示，数据为至少 3 次独立实验的均值 ± 标准误（++ p˂0.01，与对照组比较；** p˂0.01，*** p˂0.001，与 TAT 或 TAT-B 比较；采用 Tukey 多重比较检验的一维方差分析）。请注意，CPP 与 BCPP 在效应之间无显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞裂解实验示意图；通过离心、移液和电泳装置进行DNA提取。
图3：实验流程图。
逐步图解“实验步骤”部分所述的操作流程，从BCPPs的孵育开始，直至获得洗脱的BCPPs及其相互作用蛋白。1) 用所需浓度的BCPPs在规定时间内孵育培养细胞。2) 孵育期间，BCPPs被细胞内化，并与其胞内伴侣分子相互作用。3) 用预冷的PBS在冰上洗涤细胞三次。4) 裂解细胞以提取蛋白质。5) 将细胞裂解液转移至离心管中。6) 在4 °C下以11000 × g 离心10分钟。7) 将上清液转移至新的离心管（A），并保留少量裂解液用于常规Western印迹分析（管B）。8) 重悬NeutrAvidin琼脂糖珠，使用剪口移液枪头向每根A管中加入50 µL。9) 在4 °C下轻轻振荡孵育12小时，使NeutrAvidin琼脂糖珠与BCPPs及其相互作用蛋白结合。10) 以3000 × g 离心1分钟，使结合了生物素化诱饵及其相互作用蛋白的珠子沉淀。11) 将上清液转移至新管（C），保留以备重复pull-down实验时使用。12) 用新鲜裂解缓冲液洗涤沉淀五次，通过倒置重悬，每次以3000 × g 离心1分钟，并弃去上清液。13) 小心彻底去除所有上清液。14) 加入所需体积的4× Laemmli缓冲液，在100 °C下孵育5分钟以洗脱结合蛋白。15) 以8200 × g 离心30秒，使珠子沉淀。16) 使用毛细移液枪头将上清液中的洗脱蛋白转移至新管（D）。17) 上样进行凝胶电泳，用于Western印迹分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质表达分析、Western blot结果、FAK、c-Src、Csk、PTEN、Cav-1、分子量条带
图4：通过Pull-down联合Western blot分析TAT-Cx43266-283-B在G166 GSCs细胞内的相互作用。
将G166 GSCs细胞与50 µM TAT-B或TAT-Cx43266-283-B共孵育。30分钟后裂解细胞，并使用NeutrAvidin磁珠沉淀与TAT-B或TAT-Cx43266-283-B结合的细胞内相互作用蛋白。洗脱后的蛋白经SDS-PAGE分离并进行Western blot分析，检测FAK、c-Src、CSK、PTEN和Cav-1的表达水平。注意，Cav-1可与TAT-B和TAT-Cx43266-283-B均发生相互作用，c-Src、PTEN和CSK主要与TAT-Cx43266-283-B结合，而FAK未显示出与TAT-B或TAT-Cx43266-283-B的任何相互作用。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质相互作用的免疫荧光图像；显示 TAT-Cx43、c-Src 和磷脂酰丝氨酸。
图 5：通过共聚焦显微镜确认 TAT-Cx43266-283-B 在 G166 GSC 细胞内的相互作用。
将 G166 GSC 细胞与 50 µM TAT-Cx43266-283-B 共同孵育。30 分钟后，固定细胞，并使用 Cy2-链霉亲和素（绿色）定位 TAT-Cx43266-283-B，通过免疫荧光法标记 c-Src（红色），并用 Annexin V 标记磷脂酰丝氨酸（蓝色）。在合并图像中可见，TAT-Cx43266-283-B 与 c-Src 在细胞膜附近存在部分共定位（白色）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法有多种。本研究中介绍的方法基于广泛使用的生物素-亲和素沉淀系统，其中将生物素标记的诱饵蛋白与细胞裂解液共同孵育，以促进相互作用的形成。本研究的改进之处在于将该技术与细胞穿透序列相结合。我们建议设计具有细胞穿透能力的诱饵蛋白，使其能够直接与活细胞共同孵育，而非使用细胞裂解液，从而所检测到的相互作用更能真实反映细胞内环境中的天然相互作用状态。

本研究中，我们采用TAT作为穿膜肽序列，生物素作为下拉标签，并以Cx43蛋白中第266-283位氨基酸之间的区域为靶标，用于在人源GSCs中寻找细胞内相互作用。Cx43与c-Src之间相互作用的结构基础已被广泛认知11,12。这一相互作用具有重要意义，因为它可抑制c-Src在胶质瘤细胞中的致癌活性24,13。事实上，含有该区域的穿膜肽（TAT-Cx43266-283）可模拟Cx43在胶质瘤细胞中的抗肿瘤作用19,20,21。在大鼠胶质瘤C6细胞中，TAT-Cx43266-283抑制c-Src的机制包括招募c-Src及其内源性抑制因子CSK和PTEN20。需要指出的是，GSCs作为胶质瘤治疗的重要靶点极具研究价值，因为它们构成了一类对常规治疗具有耐药性的亚群，因而导致此类恶性脑肿瘤的复发27。此外，GSCs属于难以转染的细胞，使得细胞内相互作用的研究更加困难。穿膜肽可在GSCs中快速且高效地被内化19，因而有利于其用于细胞内相互作用的研究。本研究通过使用与生物素融合的穿膜肽，证实了在人源GSCs中，Cx43266-283序列与c-Src及其内源性抑制因子CSK和PTEN之间存在相互作用。

该方法在研究生物活性化合物的细胞内作用机制方面非常有效。然而，至关重要的是要确认生物素化穿膜探针的生物学效应与非生物素化探针所产生的效应无显著差异。此步骤是将所发现的相互作用与生物活性化合物的作用相关联的必要前提。此外，在设计实验之前，应仔细检测并充分考虑该化合物的稳定性、是否可能被蛋白酶降解以及潜在的毒性。在本文所展示的示例中，TAT-Cx43266-283对G166人源胶质瘤干细胞（GSCs）的抗增殖作用已有文献报道20。在本研究中，我们进一步证实，TAT-Cx43266-283-B与TAT-Cx43266-283的抗增殖效应非常相似。此外，细胞形态学分析显示，在经TAT-Cx43266-283-B或TAT-Cx43266-283处理的G166 GSCs中，α-微管蛋白和F-肌动蛋白的分布模式高度一致。综合这些结果表明，在TAT-Cx43266-283的C末端引入生物素并未改变该化合物对人源GSCs的作用效应。然而，若生物素确实改变了生物活性分子的作用，则可尝试其他用于蛋白纯化的标签，例如FLAG八肽（DYKDDDDK）28、来源于人流感血凝素的HA标签（YPYDVPDYA）或谷胱甘肽S-转移酶（GST）29。同样地，若TAT序列无法有效靶向目标细胞群体，则可选用其他穿膜肽序列，如penetratin、MPG（综述见30），或细胞特异性穿膜序列31。

除了研究特异性与靶序列相互作用的蛋白质外，理想情况下还应考察与对照序列和靶序列均发生相互作用的蛋白质，以及不与二者结合的蛋白质，作为阳性和阴性对照。在此方面，我们在对照组和处理组中均检测到Cav-1的存在，提示小窝可能参与了内化机制，这与先前的研究结果一致。26此外，FAK 虽可与 c-Src 相互作用，但据认为不与 Cx43 羧基末端相互作用，在对照和处理条件下均未检测到。这些结果进一步支持了 TAT-Cx43 与 c-Src 之间相互作用的特异性266-283- B, c-Src、CSK 和 PTEN。为验证本实验方案获得的结果，可采用共聚焦显微镜观察相互作用蛋白的分布情况，并研究其共定位。因此，我们发现 TAT-Cx43266-283-B 和 c-Src 表现出相似的细胞内分布，存在部分共定位位点，这验证了pull-down实验的结果。事实上，TAT-Cx43266-283-B 分布在质膜附近，表明本研究中的货物蛋白 Cx43266-283，指导该分子与其细胞内伴侣分子相互作用。

该方法的一个局限性在于，用作诱饵的分子可能无法正确折叠，从而导致无法观察到预期的作用效果。在这种情况下，所发现的相互作用无法与特定效应相关联。然而，该方法对于信号转导通路中涉及的相互作用可能尤为有意义，因为这类相互作用通常由内在无序区域介导32，因而不需要有序的折叠结构。此外，该方法的一个优势在于可以追踪相互作用的时间进程，这对于瞬时性相互作用尤其重要。同时，可方便地研究各个氨基酸残基在相互作用中的作用。事实上，可以研究翻译后修饰对蛋白质-蛋白质相互作用的影响，例如通过谷氨酸替代丝氨酸或苏氨酸以模拟磷酸化效应。类似地，将丝氨酸或苏氨酸替换为丙氨酸，或将酪氨酸替换为苯丙氨酸，可用于检测非磷酸化丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的影响。 为了模拟磷酸化酪氨酸，最准确的方法是将 Tyr 替换为 p-Tyr33。

最后，该实验方案的应用范围远不止于蛋白质-蛋白质相互作用，因为该系统还可应用于其他具有生物活性的货物分子，例如RNA序列、纳米颗粒、病毒或其他可与生物素融合并借助细胞穿膜肽（CPP）转导的分子，以研究它们在细胞内的作用机制。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 M. Morales 和 J. Bravo 在 CPP 设计方面提供的帮助，以及 J.C. Arévalo 在 pull-down 实验方案方面的协助。我们对 T. del Rey 提供的技术支持表示衷心感谢。本研究得到了西班牙经济与竞争力部、欧洲区域发展基金（FEDER BFU2015-70040-R）、西班牙卡斯蒂利亚-莱昂自治区政府、欧洲区域发展基金（FEDER SA026U16）以及拉蒙·阿雷塞斯基金会的资助。M. Jaraíz-Rodríguez 和 A. González-Sánchez 获得了卡斯蒂利亚-莱昂自治区政府与欧洲社会基金联合提供的奖学金。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
G166 GSC 细胞系BioRep
RHB-A 干细胞培养基TakaraY40001
小鼠层粘连蛋白Invitrogen，Life Technologies，ThermoFisher Scientific23017-01510 µg/ml
B-27 无血清添加剂（50X）Invitrogen、Life Technologies、ThermoFisher Scientific17504-0442%
N-2 补充剂（100 倍浓缩）Invitrogen，Life Technologies，ThermoFisher Scientific17502-0481%
重组人表皮生长因子PeprotechAF-100-1520 ng/ml
重组人b-FGFPeprotechAF-100-18B20 ng/ml
PBS pH 7.4：在去离子水中，136 mM NaCl；2.7 mM KCl；7.8 mM Na2HPO4·2H2O；1.7 mM KH2PO4
AccutaseSigmaA6964
Cryostor CS10 冻存培养基StemCell Technologies7930
TATGenScript-定制
TAT-BGenScript-定制
TAT-Cx43266-283GenScript-定制
TAT-Cx43266-283- BGenScript-定制
Alexa Fluor 594 PhalloidinMolecular Probes，Life Technologies，ThermoFisher ScientificA12757371/20
单克隆 α-tubulin 小鼠抗体Sigma-AldrichT90261/500
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Molecular Probes，Life Technologies，ThermoFisher Scientific1.25 mg/ml
皮尔斯™ NeutrAvidin™ 琼脂糖赛默飞世尔科技29200
蛋白裂解缓冲液：5 mM Tris-HCl（pH 6.8），2%（w/v）SDS，2 mM EDTA，2 mM EGTA
蛋白酶抑制剂混合物套装 III，不含 EDTACalbiochem，Bionova5391341/100（v/v）
氟化钠PanReac AppliChem1416751 mM
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-AldrichP76261 mM
原钒酸钠Sigma-AldrichS65080.1 mM
Laemmli缓冲液：（4x：0.18 M Tris-HCl pH 6.8；5 M 甘油；3.7%（w/v）SDS；0.6 M β-巯基乙醇或 9 mM DTT；0.04% (v/v) 溴酚蓝（BB）。1X
Xcell 4 SureLock Midi-Cell 电泳系统Life Technologies，ThermoFisher ScientificWR0100
NuPAGE Novex Bis-Tris Midi 胶 4-12%Life Technologies，ThermoFisher ScientificWG1402box
NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液（20X）Life Technologies，ThermoFisher ScientificNP00011X
NuPAGE 转膜缓冲液 20xLife Technologies，ThermoFisher ScientificNP00061X
Precision Plus Protein 双色标准蛋白Bio-Rad161-0374
iBlot 2 NC 常规堆叠（硝酸纤维素膜）Life Technologies，ThermoFisher ScientificIB23001
iBlot 2 干式转膜系统 - 凝胶转移装置Life Technologies，ThermoFisher ScientificIB21001
10% 丽春红S溶液（0.1% 丽春红S（w/v）溶于5% 乙酸（v/v）水溶液中）SigmaP7170
FAK 多克隆兔抗体Life Technologies，ThermoFisher ScientificAHO05021/500
Src 多克隆兔抗体细胞信号传导（WERFEN）2108S1/500
Csk 多克隆兔抗体细胞信号转导（WERFEN）49801/500
PTEN 多克隆小鼠抗体细胞信号转导（WERFEN）95521/500
Caveolin-1 兔多克隆抗体Abcamab29101/1000
山羊抗小鼠 IgG-HRP 抗体Quimigen，Santa Cruz BiotechnologySc-20051/5000
山羊抗兔IgG-HRP抗体Quimigen，Santa Cruz BiotechnologySC-20301/5000
化学发光 Western Blot 试剂Santa Cruz BiotechnologySC-2048
Src 多克隆兔抗体细胞信号传导（WERFEN）2108S1/500
抗体溶液：PBS、10% FBS、0.1 M 赖氨酸、0.02% 叠氮化钠
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgGInvitrogen，Life Technologies，ThermoFisher ScientificA110291/1000
Cy2标记的链霉亲和素Jackson ImmunoResearch016-220-0891/500
MicroChemi 化学发光系统DNA生物成像系统
Annexin V Alexa Fluor 凋亡检测试剂盒（用于死细胞检测）® 488 &碘化丙啶（PI）Molecular Probes，Life Technologies，ThermoFisher ScientificV132411/500
SlowFade Gold 抗荧光淬灭试剂Life Technologies，ThermoFisher ScientificS36936
噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT）Sigma-AldrichM2128
用于紫外光谱分析的二甲基亚砜， >≥99.8%（气相色谱）霍尼韦尔41641-1L
Appliskan 2001赛默飞世尔科技公司，赛默飞世尔

参考文献

  1. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem J. 89, 599-609 (1963).
  2. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).
  3. Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules. J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).
  4. Ramsey, J. D., Flynn, N. H. Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells. Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).
  5. Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications. Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).
  6. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).
  7. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
  8. Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).
  9. Cuesto, G., et al. Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons. J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).
  10. Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. Arginine-rich cell-penetrating peptides. FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).
  11. Sorgen, P. L., et al. Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1. J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).
  12. Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication. J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).
  13. Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle. Neuroscience. 323, 183-194 (2016).
  14. Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions. Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).
  15. Shinoura, N., et al. Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).
  16. Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas. Glia. 33, 107-117 (2001).
  17. Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors. Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).
  18. Crespin, S., et al. Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights. Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).
  19. Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype. Cell Death & Disease. 5, (2014).
  20. Gonzalez-Sanchez, A., et al. Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes. Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).
  21. Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).
  22. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
  23. Yu, T., et al. In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA. J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).
  24. Herrero-Gonzalez, S., et al. Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells. Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).
  25. Cooper, G. M. The Cell: A Molecular Approach. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).
  26. Fittipaldi, A., et al. Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).
  27. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).
  28. Hopp, T. P., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  29. Benard, V., Bokoch, G. M. Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).
  30. Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics. Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).
  31. Hu, Q., et al. Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel. Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).
  32. Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. Intrinsically disordered proteins: regulation and disease. Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).
  33. Anthis, N. J., et al. Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation. J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).

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生物素-亲和素沉淀细胞穿透序列连接蛋白43 266-283胶质瘤干细胞中性亲和素琼脂糖蛋白质印迹分析共聚焦显微镜TAT 连接蛋白43
生物素标记的细胞穿透肽用于研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用
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