研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法 秀丽隐杆线虫

摘要

本文所介绍方法的目的是研究模式生物 C. elegans 在正常衰老过程中蛋白质的聚集现象。该实验方案是一种强大的工具，可用于研究随年龄增长而形成的高不溶性大分子聚集体，并确定蛋白质稳态的变化如何影响蛋白质聚集。

摘要

近几十年来，神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD））的发病率不断上升。这些与年龄相关的疾病特征是患者大脑中出现具有纤维结构的蛋白质聚集体。目前尚不完全清楚为何原本可溶性的蛋白质会经历聚集过程。近年来发现，蛋白质聚集不仅限于疾病状态，而是正常衰老过程的一部分，这使得研究人员能够在不使用异位表达的人类疾病相关蛋白的情况下，研究调控蛋白质聚集的分子与细胞机制。本文中，我们描述了通过互补方法在Caenorhabditis elegans中检测固有蛋白质聚集的技术。首先，我们介绍如何培养大量年龄同步化的C. elegans以获得老年个体，并提供用于分离高度不溶性大聚集体的生化实验流程。结合特异性基因敲低技术，可通过定量质谱进行系统性分析，或通过抗体进行候选蛋白分析，从而解析特定基因在促进或抑制年龄依赖性蛋白质聚集中的作用。随后，利用表达荧光标记的易聚集蛋白的转基因动物进行in vivo分析，以验证上述发现。这些方法将有助于阐明为何某些蛋白质在衰老过程中易于聚集，并最终揭示如何维持这些蛋白质的完全功能状态。

引言

蛋白质错误折叠和聚集被认为是多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）以及其他许多疾病）的标志性特征。例如，在帕金森病患者中，α-突触核蛋白会组装成淀粉样纤维，并在黑质区域积聚形成路易小体；而在肌萎缩侧索硬化症患者中，TDP-43 或 FUS 蛋白发生错误折叠，进而在变性的运动神经元胞质中形成聚集体。在这些神经退行性疾病中，维持蛋白质稳态（即蛋白质内稳态）的机制均无法阻止错误折叠蛋白的积累，从而导致疾病的发生。

蛋白质稳态对于维持细胞功能至关重要，在正常条件下，这些调控机制可严格控制蛋白质的合成、折叠和降解速率。多项研究表明，随着衰老，许多细胞和器官维持蛋白质稳态的能力逐渐受损，而蛋白质稳态网络在生理上的老化性衰退是神经退行性疾病的重要加剧因素（详见参考文献^1,2,3）。蛋白质质量控制能力以及细胞对未折叠蛋白应激的响应能力随年龄增长而下降，这一事实提示蛋白质错误折叠和聚集可能是衰老的普遍后果。事实上，我们及其他研究团队已证明，蛋白质聚集不仅限于疾病状态，而是部分蛋白质组在衰老动物体内会变得高度去垢剂不溶^4,5,

方案

注意：为了更好地理解该操作流程，附上了一个工作流程示意图（图1）。

1. 针对目标基因进行RNAi处理的大量年轻与衰老期C. elegans的培养

注意：使用 秀丽隐杆线虫 温度诱导的不育 gon-2(q388) 突变体（CF2253）以获得大量年龄同步的老龄群体。所有操作步骤中，均需在半无菌条件下进行，并使用明火，同时检查是否存在污染（例如真菌或细菌污染）。若未特别说明温度，则所有步骤（包括离心）均在室温下进行。

1. 制备 C. elegans gon-2(-) 突变体以获得无性腺动物
   注意：为获得缺乏性腺的不育动物，必须在亲代动物的最后幼虫阶段（L4）将其转移至25 °C，以避免母源效应的影响。
   1. 首次扩增 gon-2(-) 动物以收集用于温度转移的亲代
      1. 将 Escherichia coli OP50 菌株划线接种于Lysogeny Broth（LB）平板上，并在37 °C过夜培养。
      2. 次日，取一个OP50克隆接种至200 mL LB培养基中，并在37 °C过夜培养。
      3. 次日....

结果

我们采用此处所述方法，评估了胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路（IIS）减弱的长寿动物如何调控年龄依赖性蛋白质聚集。通过蛋白质印迹法（见步骤2.2，用于蛋白质印迹分析的快速不溶性蛋白质提取），我们分析了对照RNAi以及靶向胰岛素/类胰岛素生长因子-1受体daf-2的RNAi条件下，年轻（成虫第3天）和年老（成虫第18天）线虫的总蛋白含量及不溶性蛋白含量。我们未观察到总蛋白水平在衰老过程中或对照组与daf-2 RNAi组之间发生显著变化（图2A）。如预期，我们在对照组动物中检测到高度不溶性蛋白水平随年龄显著升高（图2B）。相比之下，在daf-2 RNAi的长寿动物中，蛋白质聚集倾向显著降低。对不溶性组分进行全蛋白染色显示，与同龄对照组相比，daf-2 RNAi组第18天线虫的提取物中蛋白条带模式复杂性较低。定量质谱分析表.......

讨论

本文报道了一种从经历RNA干扰并用于质谱和蛋白质印迹分析的老年C. elegans中分离高度不溶性蛋白质聚集体的方法。我们发现，通过降低胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路（IIS）来改善蛋白质稳态，可显著防止与年龄相关的蛋白质聚集。通过在C. elegans中选择性地过表达特定的易聚集蛋白质，可进一步解析调控固有蛋白质聚集的分子机制。

固有的年龄依赖性蛋白质聚集与疾病相关蛋白质聚集的对比
本研究基于先前的研究发现，即蛋白质聚集并不局限于特定蛋白质在疾病背景下的聚集。通过关注内源性易聚集蛋白质，而非异位表达的疾病相关蛋白质，有望为蛋白质聚集过程的生理调控提供新的见解。由于年龄依赖性蛋白质聚集物存在于不同的细胞区域⁵，对其研究也应有助于揭示特定区室的质量控制机制。总体而言，调控固有蛋白质聚集的机制也可能在预防疾病相关蛋白质聚集中发挥重要作用。值得注意的是，尽管年龄依赖性蛋白质聚集在多个方面与疾病相关蛋白质聚集相似，但目前仍不清楚这些聚集物是否含有淀粉样纤维，而.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fernbach培养瓶	康宁	4425-2XL	Pyrex，容量 2,800 ml，带 3 个挡板凹槽
膜片螺口盖	Schott	1088655	GL45
往复式混合器	VWR	444-0148
分液漏斗	Nalgene	4300-1000	容量 1,000 ml
1 ml 注射器	BD Plastipak	300013
灰色针头，27 G × ½ "，0.4 mm × 13 mm	BD Microlance 3	300635
膜过滤器 0.025 µM	Millipore	VSWP04700
pH 试纸	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	4693132001	Complete Mini 无EDTA片剂
辛苯聚醇-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-吗啉乙磺酸（MES）	Sigma-Aldrich	M1317
壬基酚聚氧乙烯醚	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	罗氏	04716728001	重组，无RN酶
RNaseA	Promega	A7973	溶液
总蛋白印迹染色	赛默飞世尔科技	S11791	Sypro Ruby 蛋白印迹染色剂
总蛋白凝胶染色	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby 蛋白凝胶染色剂
TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）	塞尔瓦	36970
碘乙酰胺	塞尔瓦	26710
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	09830
测序级修饰胰蛋白酶	Promega	V5111
相对与绝对定量的同重元素标签	Sciex	4352135	iTRAQ 试剂多重试剂盒
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckman Coulter	393126
Optima Max-XP 超速离心机	Beckman Coulter	393315
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5404000413
离心机 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	赛默飞世尔科技	75004518
Concentrator Plus	Eppendorf	5305000304	离心蒸发仪
荧光体视显微镜 M165 FC	Leica		使用 Planapo 2.0x 物镜
解剖显微镜	Leica		Leica S6E
高倍显微镜 Zeiss Axio Observer Z1	蔡司		使用 PlanAPOCHROMAT 20x 物镜和 Zeiss Axio Cam MRm
软件
图像分析软件	ImageJ
质谱数据分析	蛋白质探查者		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
大肠杆菌菌株
OP50	CGC
RNAi 细菌
L4440	Julie Ahringer RNAi文库
秀丽隐杆线虫 突变体
CF2253	CGC，菌株名称：EJ1158		基因型： gon-2(q388)
秀丽隐杆线虫 转基因技术
DCD214	Della David 在德国神经退行性疾病中心（DZNE）的实验室übingen		基因型： N2；uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David 实验室，德国神经退行性疾病中心（DZNE）Tübingen		基因型： daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]