利用高分辨质谱联用二次纳米电喷雾电离进行实时呼吸分析

摘要

本文演示了一种利用二级纳米电喷雾电离结合高分辨质谱技术，实时表征呼出气体化学成分的实验方案。

摘要

呼出的挥发性有机化合物（VOCs）已引起广泛关注，因其可作为疾病诊断和环境暴露的无创生物标志物。本研究介绍了一种利用二次纳米电喷雾电离联用高分辨质谱法（Sec-nanoESI-HRMS）实时表征呼出VOCs的实验方案。自制的二次纳米电喷雾电离源基于商用纳米电喷雾电离源快速搭建而成。在扣除背景后的呼出气体质谱中检测到数百个峰，正离子和负离子检测模式下的质量精度分别为-4.0–13.5 ppm和-20.3–1.3 ppm。根据精确质量数和同位素分布，对这些峰指认了准确的元素组成。单次呼气测量耗时不到30秒，完成六次重复测量约需7分钟。

引言

随着现代分析技术的快速发展，已在人类呼出气体中鉴定出数百种挥发性有机化合物（VOCs）¹。这些VOCs主要来源于肺泡气（健康成年人约为350 mL）和解剖学死腔气（约150 mL）²，分别受机体代谢^3,4,5,6,7,8和环境污染⁹的影响。因此，若能对这些VOCs进行有效识别，它们有望作为无创性生物标志物，用于疾病诊断和环境暴露评估。

尽管气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）是呼出挥发性有机物（VOCs）定性和定量分析应用最广泛的技术²，但近年来发展的直接质谱（MS）技术因其具有高时间分辨率和样品前处理简单等优势，已被用于实时呼吸分析。诸如质子转移反应质谱（PTR-MS）¹⁰、选择离子流动管质谱（SIFT-MS）¹¹、二次电喷雾电离质谱（SESI-MS）^12,13（也称为萃取电喷雾电离质谱，EESI-MS^14,15）、痕量大气气体分析仪（TAGA）¹⁶以及等离子体电离质谱（PI-MS）¹⁷等直接质谱技术近年来均已被广泛研究。

在所有直接质谱技术中，SESI 以其作为通用软电离技术而著称^19,20,21并且该源易于定制，可与不同类型的质谱仪联用， 例如飞行时间质谱仪^8,15离子阱质谱仪¹⁴ 和Orbitrap质谱仪^12,18截至目前，SESI-MS 已成功用于呼吸系统疾病的诊断²², 测定昼夜节律^3,6,23药代动力学^7,8，并揭示代谢途径⁴, 等等最近，一种商用的SESI源已面世。

本研究建立了一种简便紧凑的二级纳米电喷雾电离源（Sec-nanoESI），并将其与高分辨质谱仪联用，实现了对呼出气体中挥发性有机物（VOCs）的实时检测。

方案

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。请佩戴适当的个人防护装备，例如，实验服、手套、护目镜、长裤和封闭式鞋头的鞋子。

1. 设置 Sec-nanoESI 源

1. 根据SESI流程设置Sec-nanoESI源， 即，将呼出气体引入并与电喷雾羽流相交，由带电液滴进行离子化（图1）。各实验室自行构建的来源取决于所用质谱仪的接口^24,25. 此处，基于商用纳米电喷雾电离源（nanoESI源）搭建Sec-nanoESI源图2）并应用于台式四极杆轨道阱质谱仪。
   注意：主体部分为一个立方体不锈钢腔室（长25 mm，内径13 mm）（图2b）带有一个入口（内径 4 mm），用于将纳米电喷雾毛细管引入腔室。因此，该腔室并非完全密封（图2b).
2. 在腔室两侧各安装两根不锈钢管（长度 8 mm，外径 5 mm，内径 3 mm），用于气体输送。
3. 在腔室的顶部和底部安装两片石英窗（内径 14 mm），用于通过肉眼或数码显微镜观察纳米电喷雾电离（nanoESI）毛细管尖端位置及纳米电喷雾状态。
4. 将腔室焊接到质谱仪的扫掠锥上。
   注意：设计可能会因各实验室所用质谱仪的大气压接口的具体几何结构不同而有所变化。

2. 仪器优化

1. 根据制造商说明，对质谱仪的正离子和负离子检测模式进行校准。通过校准，优化质谱仪参数（如透镜电位和检测条件），以在指定分辨率下获得良好的灵敏度和峰形。本实验采用的质谱分辨率为70000。
   1. 使用商业ESI源执行Q Exactive的完整校准；然而，质量校准可使用任何兼容的离子源（包括定制离子源）完成。
2. 设置质谱仪离子传输管（ITT）的温度 > 100 °C。尽管最高温度可设置为350 °C，但这可能导致某些化合物分解。因此，本实验采用150 °C。
   注意：对于采用采样孔而非ITT的质谱仪，应设置采样孔的温度 > 100 °C
3. 根据溶剂的性质选择合适的ESI溶剂和流速例如，极性和挥发性）以及目标化合物（例如，质子亲和力）。水和甲醇以不同比例组成的混合液常被用作ESI溶剂²⁵在本实验中，使用含有0.1%（v/v）甲酸的水溶液，因为已有文献报道该溶剂具有较高的离子化效率。^13,19,23将电喷雾电离（ESI）溶剂的流速设定在0-1.5 μL/min范围内，并设为200 nL/min。
   注意：使用前将 ESI 溶剂脱气 30 分钟。
4. 优化 Sec-nanoESI 源参数，主要调节 nanoESI 电压和 nanoESI 毛细管尖端位置。电压通常在 2.0 至 4.5 kV 范围内，此处使用 2.5 kV。
   注意：随着流速增加，施加更高的电喷雾电离电压。喷针尖端与质谱仪进样口之间的距离可在1至5 mm范围内调整。优化后，在质谱图中观察到的归一化强度水平（NL）应为 > 1×10⁶ 总离子流色谱图（TIC）的变化应 < 正离子和负离子检测模式下的灵敏度均为10%。在以下质量范围内获取质谱图和总离子流图（TIC）： m/z 50-750.
5. 向源端通入纯净气体。此步骤为可选，旨在减少室内空气中挥发性有机化合物（VOCs）的干扰。使用高纯度氮气（N₂）₂，99.99%）或纯净空气均可使用。当存在纯气体时，质谱中观察到的NL应为 > 1×10⁵ TIC 的变化应为 < 正离子和负离子检测模式下的纯度均达到10%。高纯度N₂ 以 0.8 L/min 的流速输送。
   注意：纯气体与呼吸气体的总流速应高于质谱仪狭缝处的流速。

3. 呼出气体的测量

1. 吸入室内空气，并以恒定流速进行正常呼气，将肺内所有气体完全呼出。通过受试者可见的压差计或流量计监测呼气流速。使用聚四氟乙烯（PTFE）管路输送呼出气体²³。
   1. 为防止管路内水蒸气冷凝，可将管路加热至80–100 ^oC^7,23,27，或使用Nafion干燥管^28,29。本实验中，受试者呼气流速由流量计控制为0.4 L/min。
   2. 将流量计的进气口连接至Nafion管（长度60 cm），以去除呼出气体中的水蒸气，并将流量计的出气口连接至PTFE管（长度13 cm，内径4 mm）。单次呼气测量耗时< < 30 s。
   3. 进行4–6次重复测量^28,29。
   4. 为尽量减少干扰因素，要求受试者在测量前至少30分钟内禁食、禁饮及禁止刷牙²³。
      注：为降低室内空气中挥发性有机物（VOCs）的影响，已有研究建议吸入纯净气体而非室内空气²⁶。当使用Nafion管时，部分极性化合物可能损失。
   5. 测量过程中，持续检查离子强度是否超过仪器的线性检测范围。信号饱和可能导致出现并非实际来源于样品中化合物的伪峰。通过鼻腔吸气时，部分环境中的挥发性有机物和颗粒物会被去除；但需注意，鼻腔通道内的化合物也可能被检测到。

4. 获取呼出气体指纹图谱及化合物的时间轨迹

1. 获取色谱图和质谱图。使用软件（例如 Xcalibur）记录色谱图和质谱图。由于这是直接质谱分析，未进行色谱分离，总离子色谱图（TIC）实际上表示质谱中检测到的所有信号的时间轨迹，而提取离子色谱图（EIC）则显示指定化合物的时间轨迹。
   注意：对于其他商用质谱仪，可通过相应的数据采集软件获取色谱图和质谱图。
2. 通过在测量呼出气体时选择总离子色谱图中的若干扫描次数，获得呼出气体的指纹图谱。使用软件获取代表这些扫描次数平均值的质谱图。
   1. 为消除呼出气体指纹图谱中的背景峰，请使用软件中的“减去背景”工具。具体操作请参考仪器制造商提供的用户手册。简要步骤为：在未引入呼出气体样品时选择相同数量的扫描次数，将所得背景质谱图从呼出气体指纹图谱中扣除。
      注意：本方法中，用于识别呼出气体指纹图谱特征的阈值定义为背景信号标准偏差的三倍。对于其他商用质谱仪，可使用相应的数据采集软件进行背景扣除。
3. 获取指定化合物的时间轨迹。在呼出气体指纹图谱中选择目标化合物的峰，随后由软件获取该化合物的时间轨迹。

结果

图3展示了在正离子和负离子检测模式下记录的质荷比（m/z）50–750范围内的呼出气体指纹图谱。在扣除背景后的呼出气体指纹图谱中，分别检测到291个峰（峰强度 > 5.0×10⁴）和173个峰（峰强度 > 3.0×10⁴），分别对应正离子和负离子检测模式。有关质谱中峰的鉴定，请参阅先前发表的研究以获取详细信息^12,18,24,29。简而言之，已检测到内源性挥发性代谢物以及来自室内空气的挥发性有机化合物（VOCs）。例如，质荷比 m/z 74.0606处的峰（图3a）根据人类代谢组数据库（HMDB）可归因于呼出的...

讨论

基于商用纳米电喷雾电离（nanoESI）源构建的Sec-nanoESI源，其电离效率高于使用常规电喷雾电离（ESI）源的情况³⁰。此外，在密闭腔室中，电离效率进一步提高，因为密闭环境可将电离过程与周围环境空气隔离，同时促进气体样品与喷雾羽流之间的混合。使用Sec-nanoESI时，相较于ESI源需要优化的参数更少，因而更易于安装、应用和维护。

若在使用二级纳米电喷雾电离质谱法（Sec-nanoESI-MS）进行呼气分析时未观察到信号或灵敏度显著下降，应检查喷雾毛细管尖端的位置以及毛细管尖端液滴的形成情况。将毛细管尖端与质谱仪的进样口对齐。若喷雾毛细管堵塞或尖端被污染，应更换为新的喷雾毛细管。否则，检查仪器的离子传输管（ITT）是否堵塞或污染。必要时更换或清洗离子传输管。在检查喷雾毛细管前，应关闭电喷雾（ESI）电压。将离子传输管的温度设为室温，并等待温度降至室温后再进行操作。

SESI-HRMS 已被证明是一种用于实时呼气分析的高灵敏度和高选择性技术

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超纯水	Merck Millipore, USA	MPGP04001	电阻率 >18.2 MΩ·cm
甲酸	Sigma-Aldrich, USA	F0507	对呼吸道具有腐蚀性。
氮气	广州世源气体有限公司，中国	N.A.a	纯度 >99.99%
Q Exactive 混合四极杆-轨道阱质谱仪	Thermo Scientific, USA	02634L(S/N)	注意高压和高温
NanoESI 电离源	Thermo Scientific, USA	ES002373(S/N); ES071(P/N)	注意高压和高温
纳升液相泵	Thermo Scientific, USA	5041.0010A(P/N)	/
Xcalibur 软件（版本 3.0）	Thermo Scientific, USA	BRE0008596	/
Dino-Lite 数字显微镜	特视达（苏州）科技有限公司，中国	CQ401833R(S/N)	/
Nafion 管	Perma Pure LLC, USA	ME60	/
PTFE 管（内径 4 mm）	东莞宏富绝缘材料有限公司，中国	N.A.	注意极性化合物可能损失
质量流量控制器	Line-Tech, 韩国	M15122007 (S/N)	/
流量计	余姚市工业自动化仪表厂，中国	40784	/
aN.A.：不可用。