需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

基于RANKL的小鼠骨髓破骨细胞培养实验，用于研究mTORC1在破骨细胞形成中的作用

13.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56468

⸱

2018年3月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Dentistry, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research Center of Stomatology, 2State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, University of Chinese Academy of Sciences, 3Department of Oral and Maxillofacial-Head and Neck Oncology, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种分离和培养破骨细胞的实验方案 体外 从小鼠骨髓中分离破骨细胞前体，并研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）在破骨细胞形成中的作用。

摘要

破骨细胞是一类独特的骨吸收细胞，起源于骨髓的单核/巨噬细胞谱系。破骨细胞功能异常可能导致一系列骨代谢疾病，包括骨质疏松症。为了开发预防病理性骨量丢失的药物靶点，必须明确破骨细胞从其前体细胞分化的过程机制。能够分离并培养大量破骨细胞的能力 体外 对于确定特定基因在破骨细胞分化中的作用至关重要。在破骨细胞中失活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（TORC1）可减少破骨细胞数量并增加骨量；然而，其潜在机制仍需进一步研究。本研究描述了一种基于RANKL的方法，用于从小鼠骨髓中分离和培养破骨细胞，并研究mTORC1失活对破骨细胞形成的影响。该方案通常在一周内即可成功获得大量巨大的破骨细胞。mTORC1基因的删除 Raptor 破骨细胞形成受损且分泌性抗酒石酸酸性磷酸酶活性降低，表明mTORC1对破骨细胞的形成至关重要。

引言

骨是一种持续变化的器官，终生由成骨细胞和破骨细胞进行重塑。破骨细胞负责矿化基质的吸收，而成骨细胞则合成并分泌新的骨基质1。骨吸收与骨形成之间的平衡对于骨骼健康至关重要，包括维持骨量以及对刺激和损伤的响应。若此平衡被打破，则可能发生一系列骨代谢疾病，如骨质疏松症和牙周病。在这些疾病中，破骨细胞介导的骨吸收所导致的骨量丢失超过了成骨细胞的成骨能力2,3。因此，为了开发治疗骨质疏松等骨骼疾病的药物靶点，深入理解破骨细胞的生成及其生物学特性至关重要4。

破骨细胞是位于骨表面或其附近的独特巨大多核细胞，属于单核细胞/巨噬细胞家族1. Ibbotson K. J. 等 报道了一种生成破骨细胞样细胞的方法 体外 含1,25-二羟基维生素D3的培养基5巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）被确认为破骨细胞形成的关键因子，显著提高了破骨细胞生成的效率 体外1,6,7培养破骨细胞的能力 体外 增进了我们对破骨细胞生成与调控机制的理解。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）存在于两种结构和功能 distinct 的复合物中，即 mTORC1 和 mTORC28,9。这两个多蛋白复合物因其不同的组分和下游底物而彼此不同。mTORC1 包含 mTOR 的特异性调节相关蛋白（Raptor），而 mTORC2 包含雷帕霉素不敏感的 mTOR 伴侣蛋白（Rictor）9。mTORC1 能够整合并传递重要信号，以调控细胞生长、增殖和分化。近期，我们通过在破骨细胞中特异性敲除 Raptor 以失活 mTORC1，证明了 mTORC1 在骨吸收分解代谢网络中发挥关键作用10。然而，其潜在机制仍需进一步研究。本研究采用基于 RANKL 的破骨细胞诱导方法，从野生型（WT）和 RapCtsk 小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMMs）中生成破骨细胞，以探讨 mTORC1 失活对破骨细胞形成的影响。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有涉及动物的操作均根据斯坦福大学实验室动物护理和使用管理委员会（APLAC）批准的方案进行，并经中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所动物护理与使用委员会批准。

1. 准备

  1. 通过将 Raptorfl/fl 小鼠与 Ctsk-cre 小鼠杂交，获得成骨细胞特异性 Raptor 基因敲除小鼠（Raptorfl/fl; Ctsk-cre，以下简称 RapCtsk）。本研究中使用 Raptorfl/fl 小鼠作为野生型对照。
  2. 准备一个装有冰的容器，用于保存分离的骨骼。
  3. 准备培养基。
    1. 通过在最低必需培养基α（α-MEM）中添加1×谷氨酰胺、青霉素-链霉素和10%胎牛血清，制备α-MEM培养基。
    2. 制备骨髓巨噬细胞诱导培养基：在50 mL α-MEM培养基中加入M-CSF至终浓度为20 ng/mL。
    3. 制备成骨细胞诱导培养基：在50 mL α-MEM培养基中分别加入M-CSF和RANKL至终浓度均为20 ng/mL。
  4. 在进行TRAP染色前，准备以下缓冲液。
    1. 制备固定液：包含6.5 mL丙酮、2.5 mL柠檬酸溶液和0.8 mL 37%（体积比）甲醛溶液。
    2. 制备TRAP染色液。
      1. 将去离子水预热至37 °C。
      2. 取100 µL快红GBC碱性溶液和100 µL亚硝酸钠溶液加入1.5 mL微量离心管中，轻轻颠倒混匀30秒，静置2分钟。
      3. 将9 mL去离子水预热至37 °C，加入1.4.2.2步骤中制备的重氮化快红GBC碱性溶液200 µL、100 µL萘酚AS-BI磷酸盐溶液、400 µL乙酸盐溶液和200 µL酒石酸盐溶液。
      4. 将TRAP染色混合液置于37 °C水浴中保温。
  5. 在进行培养基中TRAP活性定量前，准备以下缓冲液。
    1. 制备酒石酸盐缓冲液（50 mL）：2 mL 0.33 M L-酒石酸和48 mL 0.33 M二水合酒石酸钠，调节pH至4.9。
    2. 制备对硝基苯基磷酸二钠（pNPP）缓冲液（200 mL）：1.502 g甘氨酸、41 mg MgCl2、27.2 mg ZnCl2和180 mL去离子水，用3 M NaOH调节pH至10.4，并用去离子水定容至200 mL。
    3. 制备含磷酸酶底物的pNPP缓冲液（适用于一块96孔板）：49.37 mg磷酸酶底物和175 µL步骤1.5.2中的pNPP缓冲液。
    4. 制备底物缓冲液（每块96孔板9 mL）：6.24 mL去离子水、360 μL乙酸盐溶液和2.4 mL酒石酸盐缓冲液，涡旋混匀后于使用前在37 °C预热。
    5. 将90 μL含磷酸酶底物的pNPP缓冲液（1.5.3）加入9 mL预热的底物缓冲液（1.5.4）中，混匀制成底物混合液，涡旋10秒。

2. 解剖（第 -1 天）

  1. 使用 CO2 分别对 3 只一个月大的雌性 WT 小鼠和 RapCtsk 小鼠实施安乐死。由经过培训的人员使用适当的设备进行 CO2 吸入操作。
  2. 将 6 只小鼠浸入含有 100 mL 75% 乙醇（体积/体积）的烧杯中 5 分钟，以防止细菌污染，然后将其仰卧置于解剖板上。在胫骨远端垂直做切口，并用眼科剪沿后肢解剖皮肤。
  3. 用剪刀剪断髋关节的关节韧带，将后肢与躯干分离。
  4. 剪断膝关节的关节韧带，小心地将胫骨和股骨从膝关节分离。用剪刀轻轻去除软组织。
  5. 将每只小鼠同一基因型的所有骨骼放入六孔板的每个孔中，每孔加入 2 mL α-MEM 并置于冰上。
    注意：为保持细胞活力，骨骼在此条件下保存时间应少于 1 小时。

3. 分离（第 -1 天）

  1. 在六孔板的一个孔中加入75%乙醇（3 mL），其余5个孔中各加入α-MEM培养基（3 mL）。
  2. 将同一基因型的所有骨骼放入乙醇中洗涤15秒，随后用α-MEM培养基洗涤5次，每次10秒。
  3. 用剪刀剪去骨骺，并将0.45 mm的注射针头插入骨髓腔，用α-MEM培养基冲洗骨髓，收集至50 mL离心管中。
  4. 从骨的另一端采用相同方法冲洗骨髓腔。重复至少两次，彻底清洗骨髓腔，直至骨骼呈苍白色。
  5. 将骨髓悬液在800 × g、4 °C条件下离心5分钟，获得细胞沉淀，吸除上清液。
  6. 向离心管中加入3 mL红细胞裂解缓冲液，轻轻吹打重悬骨髓细胞。将离心管置于冰上孵育8分钟，以裂解红细胞。
  7. 向离心管中加入6 mL α-MEM培养基以终止细胞裂解反应。在500 × g、4 °C条件下离心10分钟，吸除上清液。
  8. 用3 mL α-MEM培养基重悬细胞，将细胞接种至六孔板中（通常每孔接种一只小鼠的细胞）。
  9. 在37 °C、5% CO2培养箱中孵育过夜。

4. 铺板（第0天）

  1. 次日早晨，将上清液转移至15 mL离心管中，以收集未贴壁的细胞。
  2. 在4 °C条件下，以800 × g离心5分钟，并吸除上清液。
  3. 用4 mL α-MEM培养基重悬细胞沉淀。
  4. 取20 µL细胞悬液，与20 µL台盼蓝混合。取10 µL混合液加入计数室，测定每毫升溶液中的细胞数量。
  5. 加入适量α-MEM培养基，调整细胞浓度至500,000个细胞/mL。
  6. 分别向24孔板和96孔板的每个孔中加入500 µL和50 µL骨髓巨噬细胞诱导培养基。
  7. 分别向24孔板和96孔板的每个孔中加入500 µL和50 µL细胞悬液。
  8. 在37 °C、5% CO2培养箱中孵育3天。

5. 分化（第3-7天）

  1. 铺板后第三天，从96孔板的每个孔中收集50 µL培养基，并在-20 °C下冷冻，然后吸除残留培养基。
  2. 分别向24孔板和96孔板的每个孔中加入1 mL和100 µL破骨细胞诱导培养基。
  3. 在37 °C下孵育2天。
  4. 从每个孔中收集50 µL培养基，并吸除残留培养基。
  5. 向每个孔中加入破骨细胞诱导培养基。
  6. 在37 °C下孵育1天。
    注意：此时应在倒置显微镜下观察到较大、多核的破骨细胞（图2A）。
  7. 若未观察到破骨细胞，则更换破骨细胞诱导培养基，并每日观察，直至观察到破骨细胞为止。
  8. 在破骨细胞形成后，从96孔板的每个孔中收集50 µL培养基。

6. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

注意：培养6-7天后可能出现成熟的破骨细胞 体外 培养（步骤 4）。

  1. 吸去培养基，用1×PBS轻轻洗涤3次。
  2. 每孔加入100 µL固定液，在室温下固定30秒。
  3. 固定后，吸去固定液，用预热至37 °C的去离子水轻轻洗涤3次，然后吸去去离子水。
  4. 每孔加入100 µL TRAP染色液，将96孔板置于37 °C培养箱中避光孵育30分钟。
  5. 染色结束后，吸去TRAP染色液，用去离子水轻轻洗涤3次。
  6. 使用倒置显微镜在40倍放大倍数下观察破骨细胞。

7. 培养基中TRAP活性的定量分析

  1. 从步骤5.1、5.4和5.8的96孔板中每个孔收集30 µL培养上清液；使用30 µL未培养的破骨细胞诱导培养基作为阴性对照。将样品置于新的96孔板中。
  2. 向96孔板的每孔中加入90 μL底物混合液（1.5.5）。
  3. 将板置于37 °C培养箱中孵育1小时，并避光。
  4. 通过向96孔板每孔中加入50 µL 3 M NaOH终止反应。
  5. 在405 nm波长下测定吸光度。

8. 蛋白质印迹法

注意：6-7 天后 体外 在24孔板中培养时，应可见成熟的破骨细胞。

  1. 吸去培养基。
  2. 用预冷的1×PBS轻柔洗涤3次。
  3. 吸去PBS。
  4. 加入100 µL含蛋白酶抑制剂混合物的1×SDS裂解缓冲液。
  5. 将裂解物于105 °C加热10分钟，然后在12,000 × g、4 °C条件下离心10分钟。收集含有蛋白质的上清液。
  6. 将含有30 µg蛋白质的裂解物通过10% SDS-PAGE11分离，随后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。
  7. 用5%脱脂奶粉封闭膜，时间为30分钟。
  8. 将膜与抗-Raptor、抗-P-S6、抗-S6、抗-β-actin抗体在含5%脱脂奶粉的溶液中按1:1,000稀释比例，在4 °C下孵育过夜。
  9. 用含Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）在室温下洗涤膜10分钟。
  10. 重复步骤8.9两次。
  11. 将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或抗兔IgG抗体在含5%脱脂奶粉的溶液中按1:5,000稀释比例，在室温下孵育1小时。
  12. 用TBST在室温下洗涤膜3次，每次10分钟。
  13. 进行化学发光检测时，将Western化学发光HRP底物加入膜上，在室温下孵育5分钟。去除多余底物后，将印迹膜暴露于X射线胶片。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用本实验方案，在第6天可观察到大量巨大的破骨细胞；如果未观察到巨大破骨细胞，可能需要额外延长一天破骨细胞分化时间（图1）。通过TRAP染色确认破骨细胞成功形成（图2A）。破骨细胞为巨大的酒红色/紫色细胞，含有3个以上细胞核。在野生型BMMs中，每个96孔板孔内可获得超过250个破骨细胞（图4A）。

缺失 Raptor 通过蛋白质印迹分析证实，mTORC1的失活通过核糖体蛋白S6磷酸化水平降低（P-S6）来确定，该指标被广泛用作mTORC1活性的检测标准。图3).

TRAP阳性破...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

破骨细胞生成实验是体外分离和培养破骨细胞最常用的方法体外12,13。尽管已有多种基于RANKL的破骨细胞诱导方法被报道13,14,15，本研究描述了一种在既往方法基础上进行部分改良的实验方案。

在之前的研究中，BMMs 在分离后立即接种14,15建议将BMMs用基础培养基培养过夜后再进行铺板，以分离出立即贴壁的间充质干细胞和成纤维细胞。M-CSF可促进单核细胞增殖为破骨细胞前体，并刺激破骨细胞前体表达RANK，后者与RANKL结合，进而诱导成熟破骨细胞的形成6,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

所有作者均声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢童明汉博士和 S. Kato 慷慨提供试剂和小鼠。感谢邹实验室成员的有益讨论。本工作部分得到了中国科学技术部973计划项目（[2014CB964704 和 2015CB964503]）、上海交通大学医学院第九人民医院临床研究计划项目的支持。感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心、生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学核心设施和化学生物学核心设施提供的帮助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Raptorfl/fl 小鼠杰克逊实验室013188
Ctsk-cre 小鼠东京大学S. Kato的馈赠
α-MEM康宁10-022-CVR
谷氨酰胺Gibico25030081
青霉素-链霉素Gibico15140122
胎牛血清BioInd04-001-1A
重组小鼠 M-CSF 蛋白R&研发Q3U4F9
重组小鼠 RANKL 蛋白R&研发Q3TWY5
红细胞裂解缓冲液BeyotimeC3702
台盼蓝Sigma-Aldrich302643
丙酮上海化学有限公司
柠檬酸溶液Sigma-Aldrich915
甲醛溶液上海化学有限公司
白细胞酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒Sigma-Aldrich387A-1KT
快固红 GBC 碱性溶液Sigma-Aldrich3872
亚硝酸钠溶液Sigma-Aldrich914
萘酚AS-BI磷酸盐溶液Sigma-Aldrich3871
乙酸溶液Sigma-Aldrich3863
酒石酸溶液Sigma-Aldrich3873
Dulbecco 磷酸盐缓冲液康宁21-031-CVR
L-酒石酸Sigma-Aldrich251380
二水合酒石酸钠Sigma-Aldrichs4797
甘氨酸上海化学有限公司
MgCl2上海化学有限公司
ZnCl2上海化学有限公司
NaOH上海化学有限公司
磷酸酶底物Sigma-AldrichP4744
抗Raptor细胞信号技术公司2280
抗磷酸化核糖体蛋白 S6（S235/236）细胞信号技术公司2317
抗核糖体蛋白 S6细胞信号技术公司2211
抗-ββ-肌动蛋白Santa Cruz Biotechnologysc-130300
37% 甲醛Xilong scientific
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜Bio-Rad
Western 化学发光 HRP 底物（ECL）Millipore00000367MSDS
IX71奥林巴斯
EnvisionPerkin Elmer
0.45-mm 注射器
剪刀
蚊式钳

参考文献

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056(2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

基于RANKL的检测mTORC1失活骨髓巨噬细胞抗酒石酸酸性磷酸酶细胞培养方案破骨细胞分化Raptor基因敲除TRAP染色
基于RANKL的小鼠骨髓破骨细胞培养实验，用于研究mTORC1在破骨细胞形成中的作用
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。