本文描述了一种分离和培养破骨细胞的实验方案 体外 从小鼠骨髓中分离破骨细胞前体，并研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）在破骨细胞形成中的作用。
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方法文章
基于RANKL的小鼠骨髓破骨细胞培养实验，用于研究mTORC1在破骨细胞形成中的作用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
破骨细胞是一类独特的骨吸收细胞，起源于骨髓的单核/巨噬细胞谱系。破骨细胞功能异常可能导致一系列骨代谢疾病，包括骨质疏松症。为了开发预防病理性骨量丢失的药物靶点，必须明确破骨细胞从其前体细胞分化的过程机制。能够分离并培养大量破骨细胞的能力 体外 对于确定特定基因在破骨细胞分化中的作用至关重要。在破骨细胞中失活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（TORC1）可减少破骨细胞数量并增加骨量；然而，其潜在机制仍需进一步研究。本研究描述了一种基于RANKL的方法，用于从小鼠骨髓中分离和培养破骨细胞，并研究mTORC1失活对破骨细胞形成的影响。该方案通常在一周内即可成功获得大量巨大的破骨细胞。mTORC1基因的删除 Raptor 破骨细胞形成受损且分泌性抗酒石酸酸性磷酸酶活性降低，表明mTORC1对破骨细胞的形成至关重要。
引言
骨是一种持续变化的器官，终生由成骨细胞和破骨细胞进行重塑。破骨细胞负责矿化基质的吸收，而成骨细胞则合成并分泌新的骨基质1。骨吸收与骨形成之间的平衡对于骨骼健康至关重要，包括维持骨量以及对刺激和损伤的响应。若此平衡被打破，则可能发生一系列骨代谢疾病，如骨质疏松症和牙周病。在这些疾病中，破骨细胞介导的骨吸收所导致的骨量丢失超过了成骨细胞的成骨能力2,3。因此，为了开发治疗骨质疏松等骨骼疾病的药物靶点，深入理解破骨细胞的生成及其生物学特性至关重要4。
破骨细胞是位于骨表面或其附近的独特巨大多核细胞，属于单核细胞/巨噬细胞家族1. Ibbotson K. J. 等 报道了一种生成破骨细胞样细胞的方法 体外 含1,25-二羟基维生素D3的培养基5巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）被确认为破骨细胞形成的关键因子，显著提高了破骨细胞生成的效率 体外1,6,
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方案
所有涉及动物的操作均根据斯坦福大学实验室动物护理和使用管理委员会（APLAC）批准的方案进行，并经中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所动物护理与使用委员会批准。
1. 准备
- 通过将 Raptorfl/fl 小鼠与 Ctsk-cre 小鼠杂交，获得成骨细胞特异性 Raptor 基因敲除小鼠（Raptorfl/fl; Ctsk-cre，以下简称 RapCtsk）。本研究中使用 Raptorfl/fl 小鼠作为野生型对照。
- 准备一个装有冰的容器，用于保存分离的骨骼。
- 准备培养基。
- 通过在最低必需培养基α（α-MEM）中添加1×谷氨酰胺、青霉素-链霉素和10%胎牛血清，制备α-MEM培养基。
- 制备骨髓巨噬细胞诱导培养基：在50 mL α-MEM培养基中加入M-CSF至终浓度为20 ng/mL。
- 制备成骨细胞诱导培养基：在50 mL α-MEM培养基中分别加入M-CSF和RANKL至终浓度均为20 ng/mL。
- 在进行TRAP染色前，准备以下缓冲....
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结果
采用本实验方案，在第6天可观察到大量巨大的破骨细胞；如果未观察到巨大破骨细胞，可能需要额外延长一天破骨细胞分化时间（图1）。通过TRAP染色确认破骨细胞成功形成（图2A）。破骨细胞为巨大的酒红色/紫色细胞，含有3个以上细胞核。在野生型BMMs中，每个96孔板孔内可获得超过250个破骨细胞（图4A）。
缺失 Raptor 通过蛋白质印迹分析证实，mTORC1的失活通过核糖体蛋白S6磷酸化水平降低（P-S6）来确定，该指标被广泛用作mTORC1活性的检测标准。图3).
TRAP阳性破.......
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讨论
破骨细胞生成实验是体外分离和培养破骨细胞最常用的方法体外12,13。尽管已有多种基于RANKL的破骨细胞诱导方法被报道13,14,15，本研究描述了一种在既往方法基础上进行部分改良的实验方案。
在之前的研究中，BMMs 在分离后立即接种14,15建议将BMMs用基础培养基培养过夜后再进行铺板，以分离出立即贴壁的间充质干细胞和成纤维细胞。M-CSF可促进单核细胞增殖为破骨细胞前体，并刺激破骨细胞前体表达RANK，后者与RANKL结合，进而诱导成熟破骨细胞的形成6,
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披露
所有作者均声明不存在利益冲突。
致谢
作者感谢童明汉博士和 S. Kato 慷慨提供试剂和小鼠。感谢邹实验室成员的有益讨论。本工作部分得到了中国科学技术部973计划项目（[2014CB964704 和 2015CB964503]）、上海交通大学医学院第九人民医院临床研究计划项目的支持。感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心、生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学核心设施和化学生物学核心设施提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Raptorfl/fl 小鼠 | 杰克逊实验室 | 013188 | |
| Ctsk-cre 小鼠 | 东京大学S. Kato的馈赠 | ||
| α-MEM | 康宁 | 10-022-CVR | |
| 谷氨酰胺 | Gibico | 25030081 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibico | 15140122 | |
| 胎牛血清 | BioInd | 04-001-1A | |
| 重组小鼠 M-CSF 蛋白 | R&研发 | Q3U4F9 | |
| 重组小鼠 RANKL 蛋白 | R&研发 | Q3TWY5 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Beyotime | C3702 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| 丙酮 | 上海化学有限公司 | ||
| 柠檬酸溶液 | Sigma-Aldrich | 915 | |
| 甲醛溶液 | 上海化学有限公司 | ||
| 白细胞酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒 | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| 快固红 GBC 碱性溶液 | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| 亚硝酸钠溶液 | Sigma-Aldrich | 914 | |
| 萘酚AS-BI磷酸盐溶液 | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| 乙酸溶液 | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| 酒石酸溶液 | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco 磷酸盐缓冲液 | 康宁 | 21-031-CVR | |
| L-酒石酸 | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| 二水合酒石酸钠 | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| 甘氨酸 | 上海化学有限公司 | ||
| MgCl2 | 上海化学有限公司 | ||
| ZnCl2 | 上海化学有限公司 | ||
| NaOH | 上海化学有限公司 | ||
| 磷酸酶底物 | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| 抗Raptor | 细胞信号技术公司 | 2280 | |
| 抗磷酸化核糖体蛋白 S6（S235/236） | 细胞信号技术公司 | 2317 | |
| 抗核糖体蛋白 S6 | 细胞信号技术公司 | 2211 | |
| 抗-ββ-肌动蛋白 | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% 甲醛 | Xilong scientific | ||
| 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 | Bio-Rad | ||
| Western 化学发光 HRP 底物（ECL） | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | 奥林巴斯 | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm 注射器 | |||
| 剪刀 | |||
| 蚊式钳 |
参考文献
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics<....
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重印与许可
