近期，我们绘制了活细胞中各种蛋白质在初级纤毛内转运的三维（3D）空间路径。本文详细描述了应用于活体初级纤毛的新型3D超分辨率荧光成像技术的实验装置、生物样本处理过程以及数据分析方法。
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本文内容
摘要
摘要
初级纤毛是许多真核细胞表面的一种基于微管的突起结构，含有独特的蛋白质组合，在细胞运动和信号传导中发挥关键作用。由于纤毛自身无法合成蛋白质，因此几乎有200种独特的纤毛蛋白需要在细胞质与初级纤毛之间进行转运。然而，由于现有技术的局限性，目前仍难以在活体初级纤毛中精确绘制这些蛋白质三维（3D）转运路径的空间位置。为克服这一技术难题，我们近期开发并应用了一种高速虚拟三维超分辨率显微技术，称为单点边缘激发亚衍射（SPEED）显微技术，用于确定活细胞初级纤毛中细胞质蛋白和膜蛋白转运路径的三维空间位置。本文将详细介绍SPEED显微技术的系统搭建、表达荧光蛋白标记纤毛蛋白的细胞制备、活纤毛中单个蛋白质的实时单分子追踪，以及纤毛蛋白转运路径三维空间概率密度图的获取方法。
引言
自1873年Ernst Abbe提出以来，传统光学显微镜的分辨率一直被认为受限于光在物镜处的衍射，极限约为200 nm1,2。目前，超分辨率光学显微技术突破了这一限制，能够以亚衍射（< 200 nm）分辨率捕捉动态图像。这些技术通常分为两大类：一类是基于受激发射损耗（STED）显微镜的方法，其通过样品中荧光分子的非线性光学响应产生亚衍射的照明体积3；另一类是基于光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM）的超分辨率技术，其利用数学函数定位荧光分子的中心位置（即质心），再将这些质心重构为超分辨率图像4,5。目前，由于光学装置相对简单，PALM和STORM技术被广泛采用，其原理是在长时间记录生物样本视频的每一帧中仅激活一小部分荧光分子。这使得可通过二维高斯拟合更精确地定位每帧图像中荧光标记蛋白的荧光斑点，即点扩散函数（PSF）。随后，可将每个荧光标记分子的二维位置叠加至单一成像平面，从而生成生物样本的超分辨率图像1,2。尽管这类单分子定位超分辨率显微技术确实革新了生物样本的成像方式，但仍存在一些亟待解决的挑战。例如....
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方案
1. 从细胞库制备用于SPEED显微镜的NIH-3T3细胞
- 实验前约1.5周，从冻存株中复苏新鲜的NIH-3T3细胞：在37 °C下解冻，并将细胞转移至含3 mL添加了110 mg/mL丙酮酸钠、2 mM谷氨酰胺、10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的25 cm2细胞培养瓶中。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。
- 当细胞融合度达到80%时（大约每两天一次），在实验前至少传代三次，以确保细胞周期的均一性。用0.25%胰蛋白酶在37 °C处理2分钟进行消化，吸除胰蛋白酶后加入2 mL培养基。反复吹打以分散细胞团块，取出所需数量的细胞，并将培养基总体积补至3 mL。
注：NIH-3T3细胞此前经基因工程改造，可表达定位于过渡区（TZ）26的NPHP-4蛋白，该蛋白在其C末端融合了mCherry。mCherry是一种荧光团，可通过561 nm激发光进行激发，用于定量定位TZ选择性屏障并确定初级纤毛的方向。 - 实验前两天，将细胞以60–70%融合度接种于35 mm玻璃底培养皿中，加入1.5 mL与步骤1.1相同的培养基，并将细胞放回培养箱中继续培养。
- 实验前一天，使用目标质粒对细胞进行化学转染。将500–1000 ng的目标质粒（见下文注）与转染试剂按....
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结果
本节展示了利用SPEED显微镜在初级纤毛的过渡区（TZ）获取的数据，用于研究通过约15 nm外部连接子与Alexa647相连的SSTR3的运输路径图3A）。它具有双重作用：验证3D转换算法的准确性。Alexa647应仅标记初级纤毛的外表面，因此3D运输路径应在该位置显示出高密度的信号。必须将稳定表达TZ部位NPHP3-mCherry的NIH-3T3细胞转染AP-SSTR3-GFP，并按照上述方案与链霉亲和素偶联的Alexa647共同孵育。使用mCherry荧光的宽场成像用于定位过渡区（TZ），而GFP信号用于确认细胞已成功表达目标SSTR3构建体。此外，需使用633 nm激发光对Alexa647进行宽场成像，以确认细胞已正确表达BirA质粒并从培养基中吸收了足够的生物素。阳性结果表现为可清晰分辨出与背景荧光分离的纤毛结构。图3B。只有在这些条件下，才能实现链霉亲和素偶联的Alexa647.......
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讨论
本方案描述了SPEED显微镜技术在初级纤毛中的应用，初级纤毛是一种高度依赖高效蛋白质运输的细胞信号传导细胞器。SPEED显微镜可在中心定位于过渡区（TZ）的单点照明条件下，提供荧光标记分子在通过时的高分辨率（< 10 nm）定位信息。此前，该技术已被用于研究核孔复合体（NPC）中的蛋白质运输6,7,8。然而，该方法也可拓展应用于研究任何亚衍射极限细胞腔隙中的物质运输过程。与其他高分辨率成像技术相比，该技术的优势在于能够在活细胞系统中以空间分辨率<10 nm和时间分辨率<2 ms的精度捕捉单个蛋白质运输的动力学过程。另一优势在于，只需对目标蛋白进行荧光标记，并通过转染（一种研究蛋白质定位的常用分子生物学方法）表达该构建体，即可开始进行SPEED显微镜观察。需要注意的是，高功率激光的单点照明是实现分子位置清晰分离和高分辨率定位的关键特征，但这也限制了照明区域，使该技术不适用于宽场定位成像。幸运的是，若需要宽场成像，研究者可从多种现有的宽场超分辨率技术中进行.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢密歇根大学安娜堡分校的 Kristen Verhey 博士和马萨诸塞大学医学院的 Gregory Pazour 博士提供部分质粒。本项目获得了美国国立卫生研究院（NIH GM097037、GM116204 和 GM122552 至 W.Y.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25 cm2 组织培养皿 | Corning | VV-01936-00 | |
| 青霉素/链霉素 | ThermoFisher | 15140122 | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| 胰蛋白酶 | ThermoFisher | 25300054 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647 标记的链霉亲和素 | ThermoFisher | S21374 | |
| 生物素 | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm 氦-氖激光器 | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm 固态激光器 | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm 固态激光器 | Coherent | 1185053 | |
| 倒置荧光显微镜 | Olympus | IX81 | |
| 1.4 数值孔径 100× 油浸复消色差物镜 | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| 片上乘法增益电荷耦合器件相机 | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| 二向色镜滤光片 | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| 发射滤光片 | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | 数字显微成像软件 |
参考文献
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O.,....
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重印与许可
