本方案展示了在小鼠模型中诱导脑海绵状血管畸形疾病，并利用对比增强微计算机断层扫描技术测量病灶负荷。该方法提高了现有小鼠模型的价值，可用于研究脑海绵状血管畸形及其他脑血管疾病的分子基础和潜在治疗方法。
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摘要
摘要
基因突变 CCM1（又称 KRIT1）、CCM2， 或 CCM3（又称PDCD10） 基因突变导致人类脑海绵状血管畸形（CCM）。通过他莫昔芬诱导敲除小鼠模型已建立 CCM 疾病模型。 Ccm 出生后动物的基因。这些小鼠模型为研究CCM疾病的分子机制和治疗策略提供了宝贵的工具。为了充分挖掘这些动物模型的价值，必须采用准确且定量的方法来评估病灶负荷及其进展。本文中，我们演示了在小鼠模型中诱导CCM疾病，并利用对比增强X射线显微计算机断层扫描（micro-CT）方法定量测量小鼠脑内CCM病灶负荷。在出生后第1天（P1），我们使用4-羟基他莫昔芬（4HT）激活Cdh5-CreErt2转基因中的Cre重组酶活性，以切割floxed等位基因 Ccm2在出生后第8天（P8）分析小鼠脑内的CCM病变。对于显微CT成像，采用基于碘的卢戈氏液以增强脑组织的对比度。我们优化了扫描参数，使用9.5 µm的体素尺寸，可实现约25 µm的最小特征尺寸。该分辨率足以在全球范围内准确测量CCM病变的体积和数量，并提供小鼠脑内CCM病变的高质量三维图谱。该方法增强了现有小鼠模型在研究CCM及其他脑血管疾病分子机制和潜在治疗方法中的应用价值。
引言
CCM 是 脑内薄壁、扩张的血管畸形，在人群中的患病率高达0.5%1. 脑海绵状血管瘤（CCM）可因三个基因之一的功能缺失突变而以常染色体显性方式遗传： CCM1 （又称 Krit1), CCM2，以及 CCM3 （也称为 PDCD10)2,3,4,5,6这些基因存在于一个单一的信号复合体中。
已开发出多种模型用于模拟人类CCM疾病，并研究导致CCM的CCM基因下游通路7,8,9,10。其中最可靠的模型是在新生幼鼠出生后第1天（P1）使用他莫昔芬诱导的Cdh5-CreERT2条件性敲除任一Ccm基因8,10。这些幼鼠从出生后第6天（P6）开始在脑内形成CCM病变，被认为是寻找CCM疾病发病机制和治疗药物的临床前研究的理想模型。
小鼠脑内CCM病变负荷的测量主要依赖基于组织学的方法，这种方法极其耗时且易受研究者主观偏差的影响10,11,12。基于MRI的方法已被用于评估成年小鼠模型中的CCM病变负荷9,13。然而，要获得足以识别CCM病变的满意分辨率，需要使用高度专业化的实验动物MRI设备，并且扫描时间长达数小时至过夜。此外，目前尚未见报道MRI是否可用于检测新生小鼠中的CCM病变，且分辨率可能限制其检测灵敏度。
我们近期开发了一种微计算机断层扫描（micro-CT）技术，用于成像和分析脑海绵状血管瘤（CCM）病灶14,15。这种高分辨率、节省时间和成本的方法显著提升了CCM疾病模型在机制研究和治疗研究中的价值。已有研究采用增强对比度的全组织染色方法进行软组织和小鼠胚胎的micro-CT成像16,17。此前，我们曾使用基于锇的染色法来增强脑内CCM病灶micro-CT成像的对比度14。在本文中，我们采用了一种毒性更低、非破坏性且成本效益更高的试剂——碘化钾溶液（Lugol's溶液），以增强micro-CT成像的对比度。碘能够扩散至整个脑组织，并对血液具有高亲和力18。
本文详细介绍了在新生小鼠模型中诱导CCM病灶的实验方案，以及利用基于对比剂的显微CT对CCM病灶进行成像和分析的方法。该基于显微CT的技术可对CCM病灶体积进行定量的全局测量，准确定位小鼠脑内CCM病灶的数量及其三维空间位置，并显著降低动物表型分析所需的成本和时间。
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方案
所有动物伦理和实验方案均经悉尼地方健康区动物福利委员会以及天津医科大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有实验均遵循悉尼百年研究所、悉尼大学和天津医科大学的指南/规定进行。
1. 小鼠模型中脑海绵状血管畸形的诱导
- 将 Cdh5-CreErt2; Ccm2fl/fl 小鼠与 Ccm2fl/fl 小鼠杂交，以获得含有 Cdh5-CreErt2; Ccm2fl/fl （Ccm2iECKO）幼崽及其同窝对照（Ccm2fl/fl）的子代。Cdh5-CreErt2 和 Ccm2fl/fl 动物此前已有描述19。
- 将4HT溶于100%乙醇中，分装为每份30 µL，于-80 °C保存（4HT浓度：10 mg/mL）。使用当天，将分装的4HT用玉米油稀释至0.5 mg/mL。
- 在出生后第1天（P1），使用胰岛素注射器对新生幼崽进行胃内注射50 µL 4HT（0.5 mg/mL），以诱导实验性CCM病变。
2. 微型计算机断层扫描的样品制备
- 在 P8 时通过二氧化碳窒息法处死新生幼鼠。
- 使用装有 10 mL 注射器的 29 号针头，将 3 mL 含 2% 多聚甲醛的 PBS 溶液插入小鼠心脏心室进行心内灌注。
注意：多聚甲醛有毒；请穿戴适当的防护装备。 - 使用剪刀将头部与身体分离。用剪刀去除头部所有皮肤，并用镊子剥离颅骨以解剖出完整脑组织。
- 使用体视显微镜在 7.82 倍放大、1 倍增益、0.6 伽马值和 20 ms 曝光时间下拍摄脑组织图像。
- 将解剖得到的脑组织置于含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中固定过夜。
注意：多聚甲醛有毒；请穿戴适当的防护装备。 - 次日，使用镊子分离脑干，并用 PBS 溶液清洗。
- 将脑干置于卢戈氏碘液中孵育 48 小时。
- 孵育结束后，将脑干短暂置于空气中干燥，以去除多余的卢戈氏碘液。
- 将经卢戈氏碘液染色的脑干装入 0.65 mL 微离心管中，并用塑料石蜡膜完全密封，以防止组织收缩（图 2A）。
- 将微离心管放入装有海绵的 5 mL 塑料管中，防止扫描过程中移动（图 2B）。
3. 小鼠脑内 CCM 的显微 CT 扫描
- 将装在管中的小脑垂直安装在微计算机断层扫描系统中的铝制样品台上。
- 设置扫描参数为540个投影，曝光时间2秒，光源条件为50 kV和10 W，以获取断层数据集（图像分辨率为9.5 μm/像素）。
- 扫描所得的放射图像由微计算机断层扫描系统提供的基于硬件的投影重建软件自动重建，生成16位轴向切片图像序列（"TXM" 文件）。
4. 微计算机断层扫描数据集的分析
- 打开重建的图像文件（"TXM" 在3D分析软件中打开文件，并利用该软件可视化大脑 "体绘制" 功能。
- 使用以下方法将后脑调整至所需方向 "边界框" 和 "裁剪平面" 功能。
- 以扩展模式重采样变换后的图像，并保持体素大小不变。
- 创建 "编辑新标签字段" 在转换后的图像（4.3）上，利用灰度强度仅突出显示后脑。
- 添加高亮区域并运行 "标签分析" 以获取整个后脑的测量数据（即总体积和总面积）。将测量结果导出为 Excel 文件。
- 使用以下方法可视化后脑 "等值面渲染" 功能。
- 创建另一个 "编辑新标签字段" 在转换后的图像上，使用灰度强度标示出病灶区域。
- 添加高亮区域并运行 "标签" 分析以获取后脑内病灶的测量数据即总体积和总面积）。将测量结果导出为 Excel 文件。
- 使用以下方法可视化病灶 "生成表面" 和 "表面视图" 功能。
- 以所需方向拍摄脑干图像的快照，或生成视频以进行病变的三维可视化。
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结果
出生后第1天单次注射4HT足以诱导小脑中出现CCM病变。使用卢戈氏碘液作为对比剂的显微CT能够充分检出CCM病变，并可对其体积和数量进行定量分析。利用优化后的显微CT技术，我们对Ccm2iECKO小鼠后脑中的CCM病变进行了成像。扫描获得的X射线图像被重建为小鼠脑部的三维图像，从而可在不同深度和方向上可视化脑实质内的完整病变，并评估病变在脑内的结构及三维定位。重要的是，该图像数据集还可用于对病变大小和数量进行高效且准确的定量分析。
图1显示，在P8时，Ccm2iECKO 小鼠的小脑中成功诱导出CCM病灶（B），而在同窝对照小鼠（Ccm2fl/fl）中则未见诱导（A）。
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讨论
CCM 是一种常见的血管畸形，影响高达 0.5% 的人群1。CCM 可以以散发性或家族性形式出现。由于 CCM 病变可能意外破裂，导致中风和其他神经系统后果，患者的预后通常不明确。目前唯一的治疗选择是手术切除病变，但该手术伴随较高风险。
近期已在动物模型中成功复制出人类CCM疾病状态7,8,9,10。这些模型为研究CCM疾病的发病机制提供了不可估量的工具。一种准确、高效且定量的分析方法将有助于充分挖掘这些模型的价值。
我们近期开发了一种微计算机断层扫描（micro-CT）方法，利用四氧化锇作为对比剂对小鼠模型中的脑海绵状血管瘤（CCM）病灶进行成像14。在本研究中，我们随后采用卢...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢悉尼大学悉尼显微与微分析研究设施（AMMRF）及澳大利亚显微与微分析研究中心（ACMM）提供的设备支持以及科学与技术协助。本研究得到了澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）项目资助161558号和APP1124011号（XZ）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | H6278 | 用于激活 Cdh5-CreErt2 |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | 用于稀释 4-羟基他莫昔芬 |
| 体视显微镜 | Leica | M205FA | 用于拍摄宏观图像 |
| 卢戈氏碘液 | Sigma-Aldrich | L6146 | 用于对样品进行染色以增强显微CT对比度 |
| 塑料石蜡膜 | Parafilm | PM992 | 用于封装样品 |
| 显微CT | Xradia | MicroXCT-400 | 显微CT |
| 三维重建软件 | FEI Visualization Science group | Avizo 3D 图像处理软件 | 用于分析显微CT扫描数据 |
参考文献
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重印与许可
