基于球囊损伤诱导小鼠腹主动脉内膜增生

摘要

本文展示了一种小鼠模型，用于研究主动脉球囊损伤后肌性内膜增生（MH）的发展过程。

摘要

动物模型的使用对于深入理解动脉狭窄的主要病因之一——内膜增生（MH）至关重要。本文介绍了一种小鼠球囊去内皮损伤模型，该模型与已在大型动物中建立的血管损伤模型具有可比性。利用球囊导管进行主动脉去内皮操作能够模拟临床实际情况，并引发类似的病理生物学和生理学改变。简言之，在对腹主动脉（aorta abdominalis）做一横向切口后，将球囊导管插入血管并逆行推进，随后充盈球囊。球囊充盈会导致内膜损伤及血管过度扩张。取出导管后，以单针缝合方式关闭主动脉切口。本文所述模型具有良好的可重复性，操作简便，且能够快速、可靠地建立。该模型尤其适用于评估价格昂贵的实验性治疗药物，因其可实现经济高效的药物应用。通过使用不同的基因敲除小鼠品系，还可评估特定基因在内膜增生发展过程中的作用。

引言

冠状动脉和外周动脉的动脉狭窄对患者的发病率和死亡率具有重大影响¹。其中一种潜在的病理机制是肌性内膜增生（myointima hyperplasia, MH），其特征是血管平滑肌细胞（SMC）增殖、迁移以及细胞外基质蛋白合成增加²。SMC 位于血管的中膜层，在受到刺激后会迁移至管腔表面。刺激信号包括生长因子、细胞因子、细胞间接触、脂质、细胞外基质成分以及机械性剪切力和牵张力^3,4,5,6。血管壁的损伤（无论是病理性的还是医源性的）均可导致内皮细胞和平滑肌细胞受损，并引发炎症反应，从而导致 MH⁷。

目前有多种动物模型可用于研究动脉损伤和内膜增生。猪或狗等大型动物具有与人类相似的动脉和冠状动脉解剖结构，特别适用于血管成形术技术、操作过程及器械的研究⁸。然而，猪模型存在血栓形成倾向较高的缺点^9,10，而狗对血管损伤的反应较轻....

方案

动物饲养和实验遵循由实验动物资源研究所制定、美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》中的原则，给予人道护理。所有动物实验方案均经当地主管部门（“汉堡市健康与消费者保护局”）批准。

1. 导管准备

注意：有关导管的信息，请参见材料表。

1. 从导管架上取下导管。
2. 从导管远端孔口将导丝从管腔中抽出。
3. 在导管远端末端滴一滴氰基丙烯酸酯粘合剂。
   注意：佩戴乳胶或丁腈手套。
4. 将导丝插入导管的RX端口，并沿管腔推进至远端孔口。随后，将导丝略微回撤，使其末端留出约5 mm的空隙。
5. 等待5分钟，使粘合剂充分干燥。
6. 移动导丝，检查其是否固定。若导丝仍可活动，请重复步骤1.3至1.6。
7. 用3 mL注射器抽取1.5 mL 0.9%生理盐水，并连接至球囊充盈端口。
8. 推动注射器活塞以测试球囊充胀情况。注射器内保留0.6 mL生理盐水。

2. 小鼠准备

1. 获取14周龄、体重约30 g的雄性小鼠。
   注意：我们使用的动物来自实验动物研究所。本实验中使用的是 C57BL/6J 小鼠。
2. 使用诱导室通过2.0–2.5%异氟....

结果

球囊剥脱是研究小鼠MH发展的合适模型。动物术后恢复良好，且术后身体状况优异。我们已在50只小鼠中成功建立该模型，手术相关死亡率低于3%。图1B-C展示了关键的手术步骤。沿腹白线（linea alba）做皮肤切口后，辨认腹主动脉（aorta abdominalis）。放置显微外科夹（图1B）。在腹主动脉中部做一小切口，将球囊导管插入血管并逆血流方向推送（图1C）。充气球囊的移动可刮除内膜，同时造成血管过度扩张。主动脉切口需用单针缝合关闭。切口远端应可见主动脉搏动。

移植血管中的移植血管病（MH）随时间推移逐渐进展。Masson三色染色显示内弹力板内出现肌性内膜增生（图.......

讨论

本文展示了一种用于研究内膜增生发展的鼠类模型，可用于探索其潜在的病理过程，并测试新的药物或治疗方案。

该方案中最关键的步骤是主动脉的去外膜操作。在此步骤中需格外小心，因为过度去外膜会导致动脉瘤形成，从而使模型失败；反之，若去外膜不充分，则新生内膜增生过少。因此，去外膜操作的强度对该动物模型的结果和成功至关重要。

在手术过程中，缝合时必须避免刺穿血管的两层管壁，否则可能导致血管通畅性早期丧失。我们此前曾描述过一种小鼠模型，通过该模型可在小鼠腹主动脉中诱导血管狭窄¹⁸。然而，该模型及其他大多数模型仅能提供极少量的组织用于分析。本方法的优势在于可获得相对较多的组织（约1 cm长的血管节段）。因此，单个血管移植物可被分割为多个部分，用于多种不同的分析，从而有效减少所需实验动物的数量。

此外，可利用合适的基因敲除动物来研究不同疾病条件下肌性内膜增生的发展。也可将不同的遗传背景与该动物模型相结合，以阐明在多种情况下肌性内膜增生的机制或特.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-0 Ethilon 缝线	Ethicon	2814G
3 mL 注射器	BD Medical	309658
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
5-0 prolene 缝线	Ethicon	EH7229H
6-0 prolene 缝线	Ethicon	8706H
酸性品红	Sigma-Aldrich	F8129-25G	三色染色
抗原修复液	Dako	S1699
偶氮品红	Waldeck	1B-103	三色染色
Bepanthen 眼鼻软膏	Bayer	1578675	眼用软膏
聚维酮碘溶液	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
C57BL/6J	Charles River	库存编号 000664
夹钳施加器	Fine Science Tools	18056-14	钳口尺寸：4 × 0.75 mm 长度：13 mm
胶原蛋白 3	abcam	ab7778	抗体
DAPI	Thermo Fischer	D1306
驴抗山羊 IgG AF555	Invitrogen	A21432	二抗
驴抗兔 IgG AF488	Invitrogen	A21206	二抗
驴抗兔 IgG AF488	Invitrogen	A11055	二抗
驴抗兔 IgG AF555	Invitrogen	A31572	二抗
70% 乙醇	Th. Geyer	2270
96% 乙醇	Th. Geyer	2295
无水乙醇	Th. Geyer	2246
FAP	abcam	ab28246	抗体
精细镊子	Fine Science Tools	11251-20
标准镊子	Fine Science Tools	11023-10
冰醋酸	Sigma-Aldrich	537020
毛发修剪器	WAHL	8786-451A ARCO SE
肝素	Rotexmedica	PZN 3862340	25,000 I.E./mL
高温电凝套装	Bovie	18010-00
Image-iT FX 信号增强剂	Invitrogen	I36933	封闭液
亮绿 SF	Waldeck	1B-211	三色染色
显微外科夹钳	Fine Science Tools	18055-04	微型止血夹 - 4 mm
MINI TREK 冠状动脉扩张导管 1.20 mm × 6 mm / 快速交换	Abbott	1012268-06U
钼磷酸水合物	Merck	1.00532.0100	三色染色
0.9% NaCl	B.Braun	PZN 06063042 货号：3570160
持针器	Fine Science Tools	12075-14
诺瓦明磺酸	Ratiopharm	PZN 03530402	安乃近
橙黄 G	Waldeck	1B-221	三色染色
石蜡	Leica biosystems	货号 39602004
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	#157135S
丽春红 S 溶液	Serva Electrophoresis	33427	三色染色
一抗稀释液	Dako	S3022
Prolong Gold 封片液	Thermo Fischer	P36930	免疫荧光染色切片封片液
可更换精细尖头	Bovie	H101
Weigert 复红间苯二酚	Waldeck	2E-30	三色染色
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	卡洛芬
剪刀	Fine Science Tools	14028-10
Vannas 型剪刀	Fine Science Tools	15000-03
二抗稀释液	Dako	S0809
快干胶 MINIS 3×1g	UHU	45370	氰基丙烯酸酯
载玻片架	Ted Pella	21057
SM22	abcam	ab10135	抗体
SMA	abcam	ab21027	抗体
染色缸	Ted Pella	21075
手术显微镜	Leica	M651
Tabotamp 纤维止血材料	Ethicon	431962	可吸收性止血剂
Transpore 外科胶带	3M	1527-1
U-100 胰岛素注射器	BD Medical	324825
血管扩张器	Fine Science Tools	18603-14
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Weigert 铁苏木素染色试剂盒	Merck	1.15973.0002	三色染色
二甲苯	Th. Geyer	3410