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小鼠心房的高分辨率光学标测电生理学评估

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DOI：

10.3791/56478

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2018年2月22日

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1Department of Bio-informational Pharmacology, Medical Research Institute, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Biofunctional Informatics, Tokyo Medical and Dental University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了利用具有高时间分辨率和空间分辨率的光学标测系统对小鼠心房进行电生理学评估的方法，包括通过特制电极导管进行程序化刺激，同步记录膜电位和Ca2+瞬变信号。

摘要

近期针对心房颤动（AF）的全基因组关联研究显示，基因型与心房的电生理表型之间存在强烈关联。这促使我们利用基因工程小鼠模型来阐明心房颤动的机制。然而，由于小鼠心房体积较小，评估其电生理特性具有较大难度。本方案描述了在Langendorff灌流的小鼠心脏中，使用具有高时间与空间分辨率的光学标测系统对心房进行电生理评估的方法。该光学标测系统由两个高速互补金属氧化物半导体（CMOS）相机和高倍率物镜组成，用于检测电压敏感性染料和Ca2+指示剂的荧光信号。为专注于小鼠心房的评估，光学标测的成像区域设定为2 mm × 2 mm或10 mm × 10 mm，分辨率为100 × 100（20 µm/像素或100 µm/像素），最高采样频率可达10 kHz（0.1 ms）。通过上腔静脉将一根1-French四极起搏电极导管置入右心房，避免对心房造成机械性损伤，并通过该导管施加起搏刺激。电生理研究采用程序化刺激方法，包括恒定起搏、阵发性起搏以及最多三重期前刺激。在自发节律或起搏节律下，光学标测可分别在左心房和右心房独立记录动作电位时程、激活图、传导速度以及Ca2+瞬变。此外，程序化刺激还可确定心房快速性心律失常的可诱导性。通过精确的激活标测，识别诱发的心房快速性心律失常期间心房内兴奋传导的传播路径。采用特定设置的光学标测技术，能够在小鼠病理模型中实现对心房全面而细致的电生理评估。

引言

哺乳动物的心脏由四个腔室组成。上方的两个腔室为心房，下方的两个腔室为心室。心室作为泵，将血液射入体循环或肺循环。心房接收从体静脉或肺静脉回流的血液，并协助将血液输送至心室，以实现高效的心脏泵血功能。从电生理学角度来看，心房的重要功能是调节心律。电冲动起源于上腔静脉（SVC）与右心房（RA）交界处的窦房结，随后传播至右心房和左心房（LA），并通过房室结及希氏-浦肯野传导系统传导至心室。

心律失常是一类心脏节律紊乱疾病，根据其发生部位可分为房性和室性两类。心房颤动（AF）是最常见的一种持续性心律失常，其特征是心房出现快速且无序的电活动。近期的遗传学分析和全基因组关联研究（GWAS）已揭示心房颤动与基因突变或单核苷酸多态性之间存在关联1,2,3,4。这些发现表明，心房颤动至少在一定程度上具有遗传基础。因此，利用基因工程动物模型评估心房中基因型与表型之间的相互作用至关重要。目前普遍认为，小鼠是进行遗传修饰最成熟的哺乳动物模型。

光学标测技术已用于评估心肌组织的兴奋性。然而，由于小鼠心房相对较小，利用光学标测观察小鼠心房受到限制。我们尝试以高时间分辨率和高空间分辨率实现对小鼠心房的详细评估。

方案

本动物实验经东京医科齿科大学机构动物护理和使用委员会批准，并在其监管下进行。

1. 准备

  1. 储备液
    1. 溶解电压敏感性染料（di-4-ANEPPS 和 RH237）以及 Ca2+ 分别用100%二甲基亚砜（DMSO）溶解指示剂（Rhod-2 AM），配制浓度为6 mM、10 mM和10 mM的储存液。
    2. 将兴奋-收缩（E-C）解偶联剂blebbistatin溶于90% DMSO中，配制成50 mM的储存液。
    3. 在避光环境下，将储备液分装至0.2 mL PCR管中，并用氮气置换储备液管中的空气，以防止氧化。
    4. 将储备管分别用铝箔包裹，以避光保护，并于 -20 ˚C 保存。
  2. 工作溶液
    1. 制备1 L不含Ca的磷酸盐缓冲液（PBS）2+ （137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8.0 mM Na2HPO4，以及 1.5 mM KH2PO4，用 NaOH 调节 pH 至 7.40
    2. 配制 1 L 台氏液（135 mM NaCl，5.4 mM KCl，1.8 mM CaCl₂，1 mM MgCl₂，0.33 mM NaH₂PO₄，10 mM HEPES，5.5 mM 葡萄糖，pH 7.4）2，0.53 mM MgCl2，0.33 mM NaH2PO4，5.5 mM D-葡萄糖，5.0 mM HEPES，用 NaOH 调节 pH 至 7.40。
    3. 使用0.22 µm瓶顶滤器过滤Tyrode's溶液，并通过连接氧气供应的砂芯曝气头进行充分鼓泡充氧2 气体钢瓶

2. 经Langendorff灌注心脏的光学标测

  1. 使用两个互补金属氧化物半导体（CMOS）相机组装光学标测系统（图1a&b）
    1. 按照图1a&b所示，将CMOS相机、分束器、物镜、物镜转盘、光源、二向色镜、滤光片及其他部件组装成光学标测系统。
    2. 通过更换装有不同放大倍数（1.6倍和5倍）物镜的转盘来选择放大倍数。
      注：CMOS传感器尺寸为10 mm × 10 mm，分辨率为100 × 100，这意味着使用5倍物镜时，该系统可提供20 µm的空间分辨率。
    3. 使用中心波长为530 nm的发光二极管（LED）灯作为激发光源，光束经带通滤光片（520/35 nm）后，由二向色镜（560 nm）反射。
    4. 记录经分束器（665 nm）分光后的发射信号，其中相机1配备长通滤光片（697/75 nm），用于检测膜电压敏感染料（di 4-ANEPPS 或 RH237）的荧光信号；相机2配备带通滤光片（572/28 nm），用于检测Ca2+指示剂（Rhod2-AM）的信号。
  2. 组装Langendorff灌流回路
    1. 将聚氯乙烯（PVC）管连接至蠕动泵。
    2. 将PVC管的进液端插入已用100% O2饱和的Tyrode's溶液中（如步骤1.2.3所述）。
    3. 将PVC管的出液端连接至自制的空气捕集器，然后依次连接5 µm滤器、三通旋塞、压力传感器、加热玻璃线圈和21号钝头针（针头尺寸可根据主动脉大小调整），各部件之间使用其他PVC管连接。
    4. 用Tyrode's溶液填充灌流回路，避免回路中产生任何气泡，并在心脏连接至回路前停止流动。
  3. 肝素化与麻醉
    1. 使用25号针头和1 mL注射器，将未分级肝素（200 IU，与体重无关）经腹腔注射至小鼠体内。
    2. 肝素注射10分钟后，经腹腔注射戊巴比妥钠（65 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
  4. 插管与灌流
    1. 将小鼠仰卧位放置。通过脚趾夹捏无反应确认动物已充分麻醉。使用剪刀在剑突水平以下切开腹壁。在膈肌上做横向切口，沿腋中线剪断两侧肋骨，注意避免损伤心脏。将前胸壁向上翻起。用弯头镊子伸至心脏后方，夹住降主动脉、食管和下腔静脉。迅速用剪刀将心脏连同邻近血管和组织（如主动脉、肺、气管、食管、脂肪组织和胸腺）一并剪下。
    2. 在培养皿中用10 mL冰浴PBS冲洗心脏，并去除周围组织。
    3. 在体视显微镜下，将连接灌流回路的21号钝头针插入升主动脉，并用缝线固定。
    4. 开始以100% O2饱和的Tyrode's溶液对心脏进行灌流，持续10分钟。
    5. 通过连接放大器和记录仪的压力传感器连续监测灌流压力。
    6. 在后续所有步骤中，保持灌流压力在80–100 mmHg之间（通常对应流速为2–5 mL/min）。
    7. 在初始灌流期间（步骤2.4.4），将细聚乙烯（PE）管（外径：0.8 mm）插入上腔静脉（SVC），并用缝线固定。随后将心脏置于预热的玻璃腔室中（图1b&c）。
    8. 通过心尖处穿刺24号留置针（外径：0.7 mm）进入左心室（LV）腔，避免损伤心房，拔出针芯后保留外部套管于LV内。
    9. 将定制的1-French电极导管经SVC中的PE管插入，以实现右心房（RA）电刺激。如需进行心室起搏，可将导管进一步送入右心室（RV）。
    10. 将针状电极插入心尖部，持续记录针状电极与升主动脉插管针之间的双极心电图（ECG）（图1c）。
    11. 在整个实验过程中持续监测ECG和灌流压力。
    12. 关闭光源，在暗室中进行后续实验。
    13. 如需进行膜电压单通道记录，请进入步骤2.5；如需进行膜电压与Ca2+瞬变双通道记录，请进入步骤2.6。
  5. 膜电压单通道记录的染色
    1. 在进行膜电压单通道记录染色过程中，保持灌流液温度为37 ˚C。
    2. 将8.3 µL di-4-ANEPPS储备液（6 mM）用10 mL Tyrode's溶液稀释（终浓度为5 µM）。
    3. 通过灌流途径将稀释后的di-4-ANEPPS溶液共10 mL灌注入心脏，持续2–5分钟，随后用Tyrode's溶液冲洗5分钟。
    4. 将5 µL肌球蛋白抑制剂blebbistatin储备液（50 mM）用1 mL Tyrode's溶液稀释（终浓度为250 µM）。
    5. 通过灌流途径将全部稀释后的blebbistatin溶液注入心脏。
    6. 跳过步骤2.6，直接进入步骤2.7进行冲洗。
  6. 膜电压与Ca2+瞬变双通道记录的染色
    1. 将Tyrode's溶液保持在室温。
      注：此初始温度设置不同于膜电压单通道记录染色（步骤2.5）中的设置。
    2. 以与步骤2.5.4和2.5.5相同的方式给予blebbistatin。
    3. 取3 µL Rhod2AM储备液（10 mM）与30 µL聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物F-127（20% DMSO溶液）混合，再用10 mL Tyrode's溶液稀释该混合液。
    4. 通过与blebbistatin相同的途径，将Rhod2AM溶液（终浓度3 µM）全部灌注入心脏，持续2–5分钟。
    5. 将7 µL RH237储备液（10 mM）用10 mL Tyrode's溶液稀释。
    6. 将全部稀释后的RH237溶液（终浓度7 µM）在2–5分钟内灌注入心脏。
    7. 完成上述操作后，开始将Tyrode's溶液加热至37 ˚C。
  7. 冲洗
    1. 在后续实验中保持Tyrode's溶液温度为37 ˚C。
    2. 用Tyrode's溶液对心脏灌流至少5分钟，以清除过量染料。
      注：此冲洗步骤无需提高流速（参见步骤2.4.6）。
    3. 确认心脏收缩引起的所有运动伪影消失，且灌流心脏染色均匀。
  8. 采样与数据分析
    1. 小心地将盖玻片（25 mm × 60 mm）置于灌流心脏表面，以在不过度施加机械应力的情况下展平心房表面，并防止溶液振动引起的运动伪影。确认心房已适当贴附于盖玻片。
    2. 使用CMOS相机记录荧光信号，di 4-ANEPPS的采样率可达0.1 ms，RH237和Rhod2AM染色的采样率为1 ms。
    3. 根据分析软件制造商的操作说明，使用相应分析软件处理所获得的记录数据。
    4. 在提取感兴趣区域、去除漂移、时间滤波和3 × 3像素合并后，生成激活图谱和动态视频5。

3. 电生理学研究

  1. 设置起搏电极和刺激器
    1. 确认自制起搏电极尖端与右心房（RA）组织接触良好，以进行刺激（参见步骤 2.4.9）。
    2. 所有起搏刺激均通过连接至可编程刺激器的起搏导管输送。
  2. 确定起搏阈值
    1. 将起搏间期设置在 100 至 150 ms 之间（脉冲宽度为 0.4 ms），避免固有节律超过起搏频率。
    2. 持续输送至少 20 次起搏刺激，以获得稳定的心房起搏。
    3. 将起搏输出设为 5 mV，然后逐步降低，直至输送的起搏刺激无法使心房去极化。
    4. 通过心电图中 P 波的存在和/或光学记录中出现的心房兴奋信号，确认心房兴奋。
    5. 将能够使心房去极化的最小起搏输出确定为起搏阈值。
    6. 后续研究中的起搏输出应设定为起搏阈值的两倍。
  3. 恒定与爆发式起搏
    1. 以 99 次恒定起搏开始，起搏间期从 150 ms 开始，或选择不会超过固有节律的最长间期。
    2. 以 5 ms 为步长逐步缩短起搏间期，直至达到 40 ms，或达到无法实现 1:1 心房捕获的间期。
  4. 单次额外刺激起搏
    1. 将基础刺激（S1）的起搏周长设为 120 ms、100 ms 和 80 ms，除非固有节律超过基础刺激频率，或起搏无法实现 1:1 心房兴奋。
    2. 将基础刺激序列的起搏刺激次数设为 10 次。
    3. 将第一个额外刺激（S2）的联律间期设为基础周长的 -10 ms。
    4. 在基础刺激序列的最后一次起搏刺激后输送 S2。
    5. 以 5 ms 为步长逐步缩短 S2 的联律间期，直至 S2 无法使心房去极化。
    6. 将无法使心房去极化的最长 S2 间期确定为有效不应期（ERP）。
    7. 使用至少 3 种不同的基础周长评估 ERP，以考察 ERP 的频率适应性。
  5. 双次和三次额外刺激起搏以诱发心房心动过速性心律失常
    1. 若未观察到心律失常，将 S2 间期重置至 S2 的 ERP 外 20 ms 处。
    2. 添加第二个额外刺激（S3），起始联律间期与 S2 相同。
    3. 以 5 ms 为步长逐步缩短 S2 与 S3 之间的联律间期，直至 S3 无法使心房去极化。
    4. 将 S2 间期重置至 ERP 外 10 ms 处，然后重复步骤 3.5.3。
    5. 将 S2 和 S3 的间期分别重置至各自 ERP 外 20 ms 处。
    6. 添加第三个额外刺激（S4），起始联律间期与 S3 相同。
    7. 以 5 ms 为步长逐步缩短 S3 与 S4 之间的联律间期，直至 S4 无法使心房去极化。
    8. 将 S3 间期重置至 ERP 外 10 ms 处，然后重复步骤 3.5.7。
    9. 将 S2 和 S3 间期重置至 ERP 外 10 ms 处，然后重复步骤 3.5.7。
    10. 通过使用相似程序化刺激可重复诱发的情况，定义心房心动过速性心律失常的可诱发性。
  6. 评估心房心动过速性心律失常的可诱发性
    1. 在所有起搏方案期间（步骤 3.3 - 3.5）持续记录心电图。
    2. 在每次刺激期间及之后进行光学记录，以记录是否诱发心房心动过速（AT）或重复性心房反应（RAR）。
    3. 当诱发房颤（AF）或 RAR 时，应用相同的起搏方案以确认其可重复性。

结果

光学标测实验使用如图1a所示的设备进行。图1b展示了光学系统的示意图。该系统可对心房膜电位和Ca2+瞬变进行高分辨率分析。

如图1c和d所示，离体心脏被置于一个温度可控的腔室中。将一根1法式电极导管通过插入上腔静脉（SVC）的PE管送入右心房（RA），另一根留置PE管则从左心室（LV）心尖插入LV腔，以避免对心脏腔室施加过大压力。为了同步记录心电图（ECG），阴极（ECG导联[-]）连接至插管针，阳极（ECG导联[+]）连接至插入心室心尖的针状电极。该装置的特点是可避免对心房造成任何机械性损伤。

为评估膜电位，使用 di-4-ANEPPS 进行荧光记录，采样速率最高可达每秒 10,000 帧（图 2）。在从右心房（RA）进行恒定起搏期间获取激活图。精细标测可实现对小鼠心房内详细传导模式的分析。

图3展示了在右心房恒定起搏期间，使用RH237和Rhod2AM记录的左心房膜电位和Ca2+瞬变的代表性轨迹。为了在当前设置下获得足够的Rhod2AM信号信噪比，我们将成像的采样率降低至1000帧/秒。然而，该系统仍能提供足够质量的数据，用于分析动作电位与Ca2+瞬变之间的关系。

随后，我们通过对处于病理状态的小鼠进行程序性刺激，诱导心房快速性心律失常。图4展示了使用di-4-ANEPPS染色的小鼠心房中诱导产生的心房心动过速（AT）的光学记录。该小鼠在实验前10天接受了横断性主动脉缩窄手术，以对心房施加压力负荷6。我们采用四次期前刺激（120/100/100/80）诱导AT，并观察折返环路的传导情况。

离体心脏灌流装置、光学成像系统示意图及心脏研究中的电极放置。
图1. 光学标测系统。 a. 电生理学/光学标测系统的整体装置示意图。 b. 光学标测系统的组成示意图：蓝色箭头表示光源产生的激发光。物镜可通过转盘进行更换。来自染色心脏的发射光被分光至相机1和相机2。相机1检测膜电位的长波长信号，相机2通过带通滤光片（580 ± 20 nm）记录钙离子（Ca2+）瞬变的波长信号。在实验过程中，心电图（ECG）和灌流压力被持续记录，同时ECG信号也被同步导入光学标测记录软件中。c. 离体心脏的制备：通过升主动脉插入钝头针进行插管灌流。为同步记录心电图，阴极连接至插管针，阳极则通过针状电极插入心室心尖部。d. 插管导管及电极：使用21号钝头针对心脏进行灌流插管（插管针）。通过插入上腔静脉的聚乙烯管，将1-French规格的刺激电极（Electrode）置于右心房。玻璃灌流室通过循环于腔室内的温水维持在37 ˚C。请点击此处查看该图的放大版本。

心脏解剖分析，使用5X/1.6X镜头进行轮廓绘图，示意图，光学研究结果。
图2. 心房中的激活图。 a. 使用5X物镜获得的前视图代表性激活图，以及b. 使用1.6X物镜获得的后视图激活图。（左侧面板） 离体心脏和心房的示意图。（右侧面板） 使用di-4-ANEPPS染色以每秒10,000帧速率记录的左心房激活图。记录过程中通过置于右心房的刺激电极进行恒定起搏。请点击此处查看该图的放大版本。

显示动作电位和钙瞬变荧光、心电图刺激及合并数据的心脏成像示意图。
图3. 左心房中动作电位与Ca2+瞬变的双通道记录。a. 离体心脏示意图。b. 使用RH237标记膜电位（Vm）和Rhod2AM标记Ca2+瞬变时，左心房荧光强度的代表性图像。记录使用5倍物镜，采样速率为每秒1,000帧。c. 在右心房起搏电极持续起搏期间，同步记录的心电图（上方）、RH237信号（中）和Rhod2AM信号（下方）。黑色箭头指示起搏刺激尖峰，黄色箭头指示心室兴奋。在RH237信号和Rhod2AM信号中均可观察到心室产生的光散射效应（黄色箭头所示）。d. RH237与Rhod2AM信号的合并轨迹图。动作电位与瞬时Ca2+变化被同时记录。请点击此处查看该图的放大版本。

房性心动过速与窦性心律热图；心脏电生理学，等高线分析图。
图 4. 房性心动过速期间的激动标测。 （左图） 离体心脏示意图。 （中图） 房性心动过速（AT）期间的激动图。AT 通过从右心房施加的三重额外刺激起搏诱发。 （右图） 同一心脏小鼠在窦性心律期间的激动图。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频1。 使用di-4-ANEPPS染色法对心房膜电位进行成像的代表性视频。 请点击此处下载该文件。

补充视频 2。 心房心动过速和窦性心律期间激动标测的代表性视频。 请点击此处下载该文件。

讨论

光学标测是研究心脏电生理学的一种成熟技术7，也是评估心室性心律失常8,9以及心房性心律失常10,11的有力工具。同时标测跨膜电位和Ca2+瞬变对于理解心力衰竭及其他心脏疾病相关心律失常的潜在机制具有重要意义12,13。与其他电生理评估方法（如单细胞或细胞层模型）相比，灌流心脏光学标测的显著优势之一在于能够完整评估心房和心室在窦性心律以及诱发心律失常状态下的传导模式14。尽管小鼠心脏（尤其是心房）作为人类替代模型的研究因体积过小而面临困难，但小鼠在基因工程动物模型研究中仍具有重要价值，这一难题亟需解决。本研究提出了一种可行的解决方向。

尽管我们的光学标测装置在基本结构上与传统的小鼠全心标测系统相似15，但通过一些改进，我们的方法在评估小鼠心房方面具有优势。首先，我们力求实现高达0.1 ms/帧的时间分辨率和20 µm/像素的空间分辨率，这种高分辨率标测有助于更精确地测量小鼠心房中的传导速度和传导模式。其次，为了避免对心房造成不必要的机械损伤或牵拉，这些因素可能改变电生理特性16,17，我们直接将留置针插入左心室（LV）以降低心腔内压力，而不是像先前研究中那样经左心房（LA）插入15。此外，起搏刺激通过定制的1-French导管电极置于右心房（RA）内进行，而非使用可能损伤心房的针状电极。在固定心耳时也避免使用任何固定针，而此类针曾在以往的研究中被使用15。第三，在评估心律失常潜在机制方面，程序性刺激诱发房性心动过速心律失常的方案至关重要18,19。我们采用与临床电生理检查相同的程序性刺激方案，包括猝发起搏和最多三次期前刺激，同时根据小鼠心脏的特点调整起搏间期。因此，除了基础测量参数外，该方案还可评估房性心动过速（AT）的可诱发性。必要时，可在给予异丙肾上腺素或其他药物的情况下评估AT的可诱发性。根据我们的经验，野生型小鼠即使在接受完整的刺激方案后也极少出现AT。因此，AT的可诱发性应是评估多种病理状态（如基因突变、手术操作及药物干预）对心房电生理影响的重要指标11。这些改进有助于优化对完整小鼠心房的精确电生理评估。

该方法也存在一些局限性。首先，使用5倍物镜达到最大空间分辨率时，视野（FOV）仅限于心房的一部分（即仅左侧心耳，如图所示 图2a）。为了获得更大的心房视野，有时更推荐使用1.6倍物镜（图2b）。其次，如果不使用针固定心房，有时很难准确测量心房的传导特性，因为心房表面呈曲面。因此，我们通过在其表面放置盖玻片来展平组织，而非使用针固定。该方法还有助于防止溶液振动引起的运动伪影。第三，采用我们的方法很难获得完整的视野（FOV），因此在本方法中，合理利用心房的前表面和后表面视图比在其他方法中更为重要，如图所示 图2。前位视角的优势在于能够清晰观察到病理情况下的折返现象，尤其是在心耳部位图4另一方面，后位观能够清晰显示心房后壁，可能更详细地记录来自心肌袖的触发活动。当难以通过本方法获得适当视野或展平其曲面时，可用大头针将心房以最小张力固定。

采用我们的方法时，可能存在三种问题：染色失败、起搏失败以及心律失常诱导困难。对于染色失败，若未观察到或仅观察到微弱荧光，应检查光学标测装置是否正确组装，以及试剂是否妥善保存和正确使用。灌流液的状态也至关重要，因其可能影响心脏本身的电生理特性，因此必须严格监测灌流液的pH值、温度及是否充分供氧。同时需注意避免心脏内出现任何气栓。对于起搏失败，若起搏刺激无法激动心房，研究人员应使用电路测试仪检查线路连接是否正确。当确认起搏刺激已正确输出时，问题可能在于电极与组织的接触不良。重新调整电极位置通常可解决该问题，而我们所采用的起搏导管方法使这一操作更为简便。对于心律失常诱导困难的情况，在某些特定条件下可采用右心室（RV）起搏来诱导房性心动过速（AT）。使用一种四极电极导管，其远端两个电极和近端电极可分别置于右心室和右心房（RA），从而便于将起搏位点从右心房切换至右心室。该导管在心室激动信号掩盖心房激动信号时，也适用于调整心室激动时序。

该方法将有助于评估新近研究（如全基因组关联分析）所发现的房颤相关基因的基因型-表型相互作用，特别是那些通过其他方法未能证实其作用的基因。随着设备和技术的进步，利用该方法可在完整心脏中评估肺静脉鞘的电生理特性，而肺静脉鞘是房颤的重要起源部位20。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由日本科学技术振兴特别协调基金（SCF）资助的青年研究人员研究环境改善项目（资助编号：T.S.），以及日本文部科学省（MEXT）科学研究费补助金（编号：16K09494，负责人：T.S.；编号：26293052，负责人：T.F.）支持。我们感谢Brainvision公司及坪仓健司先生提供的技术支持，同时也感谢John Martin先生在语言方面给予的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(-)-BlebbistatinSIGMAB0560-1MG用于光学标测时消除运动伪影的E-C解偶联剂
RH237Biotium61018电压敏感性染料
Rhod2AMBiotium50024钙离子指示剂
Pluronic F-127 20% 溶液（溶于DMSO）Biotium#59000增强Rhod2AM染色效果
Di-4-ANEPPSWako041-29111电压敏感性染料
二甲基亚砜（DMSO）Wako046-21981试剂溶剂
瓶顶过滤器Corning430513用于过滤Tyrode溶液
肝素钠（Haparin Sodium）Mochida Pharmaceutical Co., LtdN/A防止冠状动脉内血栓形成
曝气石（φ8 mm x 10 mm）Tokyo Koshin Rikagaku SeisakushoN/A用于溶液曝气
戊巴比妥（Pentobarbital）Kyoritsu Seiyaku CorporationN/A用于麻醉
可编程刺激器Fukuda DenshiBC-05Fukuda Denshi公司友情提供租用
Power LabAD InstrumentsPowerlab 26/8SP用于记录血压和心电图
Bio AmpAD InstrumentsML132心电图放大器
BP AmpAD InstrumentsFE117血压放大器
LabChartAD InstrumentsVersion 7用于记录和分析血压及心电图的软件
一次性血压传感器AD InstrumentsMLT0670压力传感器
1-Fr定制电极导管Unique MedicalN/A用于右心房起搏
聚乙烯管（外径：0.8 mm，内径：0.5 mm）Natsume SeisakujoSP31插入上腔静脉以引入电极导管
Millex-SV 5.00 μmMerk MilliporeSLSV025LS用于过滤循环的Tyrode溶液
24号留置针TERUMOSR-FS2419插入左心室以降低心腔内压力
21号针头TERUMOSN-2170剪去针尖并用锉刀磨钝
25号针头TERUMONN-2525R
1 ml注射器TERUMOSS-01T
PVC管TERUMOSF-ET0525用于Langendorff灌流系统
三通阀TERUMOTS-TL2K用于Langendorff灌流系统
培养皿As one3-1491-01
定制加热玻璃线圈Motohashi RikaN/A用于维持灌流液温度
定制保温玻璃腔室Motohashi RikaN/A用于维持灌流液温度
恒温循环装置LaudaE100连接加热线圈和保温腔室
盖玻片（25 mm × 60 mm）MatsunamiC025601置于心房上以展平记录区域
Perista泵ATTOSJ-1211蠕动泵
Stemi DV4Carl ZeissN/A体视显微镜
MiCAM ULTIMA-L2Brainvision Inc.UL-L2光学标测系统
BV_Ana软件Brainvision Inc.BV_Ana数据分析软件
THT MacroscopeBrainvision Inc.THT-ZS落射照明单元
LED光源Brainvision Inc.LEX2-G
二向色镜 560 nmBrainvision Inc.DM560落射照明
激发滤光片 520/35 nmSemrock, Inc.FF01-520/35-25
投影镜头 Plan S 1.0XCarl Zeiss435200-0000-000
聚焦驱动装置Carl Zeiss435400-0000-000
物镜转盘Carl Zeiss435302-0000-000
手动聚焦柱Carl Zeiss435400-0000-000
Macroscope基座Carl Zeiss435430-9901-000
直型导光管MORITEX CorporationMSG10-2200S落射照明
聚光镜MORITEX CorporationML-50
PLANAPO 5.0XLeica Microsystems10447243物镜
PLANAPO 1.0XLeica Microsystems10447157物镜
PLANAPO 1.6XLeica Microsystems10447050物镜
分光镜（Beam-Splitter）Brainvision Inc.FLSP-2
二向色镜 665 nmBrainvision Inc.DM665分光镜
发射滤光片 572/28 nmEdmund Optics#84-100Rhod2-AM
发射滤光片 697/75 nmSemrock, Inc.FF01-697/75-25RH237和Di-4-ANEPPS
0.2 mL PCR管Greiner Bio-One671201
铝箔Toyo alumi0020

参考文献

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