我们提出了一种利用马达加斯加鸣叫蜚蠊作为替代性非哺乳动物模型的研究方案，用于开展细菌毒力、致病机制、药物毒性、药物有效性以及先天免疫反应等方面的研究。
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摘要
摘要
哺乳动物与昆虫的先天免疫系统在许多方面具有保守性。一种昆虫——来自马达加斯加的鸣声蜚蠊，属于蜚蠊属 Gromphadorhina 可作为研究毒力、宿主-病原体相互作用、先天免疫反应及药物疗效的替代动物模型。本文提供了关于鸣声蟑螂的饲养、护理和繁殖的详细方法，并阐述了如何利用细菌（如胞内病原菌）对其进行感染。 类鼻疽伯克霍尔德菌、假类鼻疽伯克霍尔德菌和泰国伯克霍尔德菌使用马达加斯加鸣蠊成本低廉，且可避免涉及哺乳动物研究的相关监管问题。此外，利用鸣蠊模型所得结果具有可重复性，且与使用哺乳动物模型获得的结果相似。因此，在开展动物实验时，马达加斯加鸣蠊是一种具有吸引力的替代宿主，值得进一步探索。
引言
近年来，利用昆虫作为替代性的非哺乳动物模型来研究细菌致病机制和宿主先天免疫防御的研究日益增多。从操作层面来看，这主要归因于昆虫相对低廉的成本，以及在获取、操作和饲养方面比哺乳动物更为简便。此外，目前尚无任何监管政策对科研中昆虫的使用进行规范，其使用不受任何动物使用委员会或政府机构的管辖或限制。作为替代性动物模型，昆虫特别适用于开展毒力因子的全面筛选、宿主-病原体相互作用研究以及抗菌药物疗效评估。使用昆虫模型可减少实验中哺乳动物的使用数量，从而有助于缓解动物实验所固有的部分伦理难题1,2。
昆虫可作为替代宿主，因为昆虫与哺乳动物的先天免疫系统具有高度共通性1,3。昆虫的浆细胞与哺乳动物的巨噬细胞均能吞噬微生物4。昆虫中对应于中性粒细胞的是血细胞5,6。昆虫与哺乳动物细胞内的胞内氧化爆发通路相似；两者均通过同源的p47phox和p67phox蛋白产生活性氧物种5。昆虫Toll受体下游的信号级联与哺乳动物Toll样受体及白细胞介素-1的信号通路也极为相似；两者均可导致抗菌肽（如防御素）的产生7。因此，昆虫可用于研究后生动物共有的基本先天免疫机制。
一种名为马达加斯加鸣蠊的昆虫，属于Gromphadorhina属，是现存体型最大的蟑螂物种之一，成年时体长通常可达5至8厘米。该物种仅原产于马达加斯加岛，其特征在于会发出嘶嘶声——这种声音是鸣蠊通过称为气门的呼吸孔排出空气时产生的8。这种独特的嘶鸣声在鸣蠊个体之间起到社会交流的作用，用于求偶和表达攻击性9，当雄性在其栖息地中受到干扰时便可听到这种声音。与美洲大蠊及其他城市害虫类蟑螂相比，马达加斯加鸣蠊行动较为缓慢。它们易于饲养和繁殖，一只怀孕的鸣蠊一次可产下20至30只后代。刚出生的鸣蠊被称为若虫，在经历6次蜕皮后约5个月即可达到性成熟，在野外和人工饲养环境下均能存活长达5年8。
我们利用马达加斯加鸣叫蟑螂作为替代宿主，感染细胞内病原体 类鼻疽伯克霍尔德菌，假类鼻疽伯克霍尔德菌，以及 B. thailandensis 10,11. 这些病原体在嘶鸣蟑螂中的毒力与其在标准动物模型中的毒力进行了比较 伯克霍尔德菌属，叙利亚仓鼠。我们发现50%致死剂量（LD50的 B. pseudomallei 和 B. mallei 在两种模型中相似 11有趣的是， B. thailandensis 尽管在啮齿类动物模型中无毒力，但在嘶鸣蜚蠊中具有致死性 11与……相比的这一差异 B. thailandensis 感染突显了嘶鸣蜚蠊模型的实用性； B. thailandensis 与啮齿类动物模型相比，衰减突变体在嘶鸣蟑螂中更容易被解析。此外，由于 B. thailandensis 常被用作模式生物 B. pseudomallei 和 B. mallei 10,12,13，识别其减毒突变可能为它更具毒力的近缘种提供类似的靶点。
尽管毒力存在差异 B. thailandensis 在马达加斯加蟑螂与叙利亚仓鼠中，关键毒力因子（如Ⅵ型分泌系统-1（T6SS-1）相关基因）的突变具有减毒作用 B. mallei 和 B. pseudomallei，是 同样地减弱 B. thailandensis 11。马氏波可虫模型的进一步验证体现在T6SS单个突变株（T6SS-2至T6SS-6）中 B. pseudomallei，这些在叙利亚仓鼠中与毒力无关的菌株，在嘶鸣蜚蠊中仍保持毒力 11因此，马达加斯加蟑螂可作为上述三种情况的可行替代动物模型 伯克霍尔德菌属 物种。我们最近利用嘶鸣蜚蠊作为替代动物模型，评估抗疟药物氯喹（CLQ）的疗效 伯克霍尔德菌属 感染 10 及其毒性。
在此，我们介绍马达加斯加鸣声蜚蠊的饲养与护理，并提供利用三种病原体感染该昆虫的具体方法 伯克霍尔德菌属 物种。此外，我们证明了嘶鸣蜚蠊可作为研究毒力和药物疗效的可行替代模型 伯克霍尔德菌属 感染，并且在类似研究中也可能作为其他细菌病原体的替代宿主。
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方案
1. 维持蜚蠊种群的准备工作
- 准备饲养鸣声蜚蠊的笼子。在笼子内壁顶部周围涂抹一层约20至30毫米宽的凡士林，以防止鸣声蜚蠊攀爬逃逸。
注意：鸣声蜚蠊可饲养于多种具有较大底面积、足够高度并带盖的容器中。建议使用小鼠笼（约43 cm × 23 cm × 20 cm）。对于将用于37 °C环境的笼子，不要涂抹凡士林。 - 在笼内倒置放置一个纸板蛋盒，为这种天性胆小的昆虫提供藏身处。切勿使用聚苯乙烯泡沫制成的蛋盒，以防昆虫误食塑料。
- 不要铺设垫料，以便于清洁并提高刚孵化若虫的可见度。
- 获取粗蛋白含量约为20%的干狗粮。使用食物处理器或搅拌机将其粗略研磨后，于4 °C保存。
- 准备若干浅碟以及水族石块或海绵，用于提供食物和水源。
注意：推荐使用培养皿。
2. 翡翠树蚺的饲养与繁殖
- 从商业养殖商处获取远交系马达加斯加鸣蠊（约5 cm）。本方案所用物种为Gromphadorhina laevigata。收到运输箱后应立即开箱。
- 遵循所在机构关于动物操作中个人防护装备使用的相关规定。
注意：操作鸣蠊时应佩戴厚的一次性手套，因其跗节爪较为尖锐。 - 每只大型饲养盒中转移不超过75只大型鸣蠊（>3 cm）。将新孵化的及体型较小的若虫（<3 cm）转移至另一独立饲养盒中。
注意：每只小鼠饲养盒中若饲养超过75只大型鸣蠊，可能导致种群健康状况恶化，甚至出现死亡。 - 对刚蜕皮、体色呈乳白色的鸣蠊应轻柔操作，避免挤压。或者，可待其外骨骼变深并硬化后再进行操作。
注意：无需清除从养殖商处收到的鸣蠊常携带的螨虫Gromphadorholaelaps schaeferi。这些有益螨虫有助于保持鸣蠊清洁，且对人类无害。 - 每周一至两次在浅碟中提供研磨后的干犬粮作为鸣蠊饲料。提供足量食物，确保鸣蠊在下次喂食前有充足食物供应。丢弃任何受潮或发霉的食物。
- 除犬粮外，另在浅碟中提供切碎的水果和蔬菜（如苹果、土豆或生菜）。及时清除发霉或腐烂的食物。
- 每周一至两次在浅碟中提供饮用水，但切勿过满，以防溢出至饲养盒内。在碟中放置小型水族石块或海绵，为小型若虫提供落脚平台。如有条件，使用反渗透水。
- 将鸣蠊置于黑暗环境中，温度维持在21 °C至30 °C之间。用于实验的大型鸣蠊应置于较低温度（约21 °C）下饲养约2个月，以减少繁殖和妊娠。相反，若虫应置于较高温度（28 °C至30 °C）下以促进生长。
注意：将饲养盒置于暗柜中，保持室温（21 °C）。 - 若将鸣蠊饲养于培养箱中，需另设一水盘以维持湿度。
- 定期铲除干燥粪便，或每2至3周将鸣蠊转移至清洁的饲养盒以清洁笼具。保持笼底干燥。若笼底积水过多并与排泄物混合，应立即清洁。
3. 实验用蟑螂的准备
- 实验前1至3周，将适量的嘶鸣蜚蠊转移至饲养笼中，并置于37 °C恒温恒湿培养箱内进行适应性驯化。需设置用于注射的对照组。此驯化阶段对避免实验过程中发生温度休克至关重要。
- 切勿在将要置于37 °C环境中的饲养笼上使用凡士林，因为较高温度会使凡士林融化。
- 每隔1至2天检查一次嘶鸣蜚蠊，及时更换食物和水，并清洁饲养笼。
- 准备带盖的透明一次性塑料食品容器，用于实验期间分组放置嘶鸣蜚蠊。为保证通风，可用钉子和锤子在容器盖或侧壁上打孔。
注意：在生物安全三级环境中，应使用螺口盖容器而非按压式盖容器。如有必要，可使用胶带加固按压式盖容器。 - 在注射当天，将6至12只已完成适应性驯化的嘶鸣蜚蠊按性别和体重均匀分配至各容器中。
- 确定每只嘶鸣蜚蠊的性别。雄性个体具有明显的角状突起，而雌性则无此特征，据此可区分性别。
- 称量每只嘶鸣蜚蠊的体重。为便于在天平上称重，可将蜚蠊置于两个已去皮的称量舟之间进行包裹称量。
注意：为确保实验间的一致性，建议选用体重为4至8 g的嘶鸣蜚蠊。 然而，研究显示小体型（1.5至2 g）与大体型（6至8 g）嘶鸣蜚蠊在感染后的存活率方面无显著差异。进行药物研究时，建议选用体重约为5 g的嘶鸣蜚蠊，以获得更一致的单位体重药物浓度。 - 无需提供水皿，可改用高含水量的水果或蔬菜（如苹果片或土豆片）作为水分来源。及时清除腐烂的食物。不要额外提供自由饮水，以保持容器内部干燥。
- 在注射前，将嘶鸣蜚蠊继续放回37 °C环境中饲养。
4. 细菌培养与制备
注意：本方案中使用的细菌种类为 B. mallei、B. pseudomallei 和 B. thailandensis。 所有操作均需在 B. mallei 和 B. pseudomallei 必须在生物安全三级（BSL-3）实验室中的II级或III级生物安全柜内进行操作。所有操作应于 B. thailandensis 在位于BSL2或BSL3实验室中的类似生物安全柜内进行操作。开展BSL3实验时，应遵循机构规定的标准操作程序。处理细菌时，应遵守机构关于个人防护装备使用的规定。
- 制备一张主平板 伯克霍尔德菌属 感染前至少 3 天。使用 Luria-Bertani (Lennox) (LB) 琼脂 B. pseudomallei 或 B. thailandensis 并使用添加4%甘油的LB琼脂 B. mallei从保存在 -80 °C 的 25% 甘油菌种中划线接种细菌。
注意：始终直接从冻存的甘油菌种中划线接种主平板；避免细菌的连续传代 从一个培养皿转移到另一个培养皿时需谨慎，因为这可能导致毒力下降。 - 接种数个菌落至10到20 mL LB肉汤中 B. pseudomallei 或 B. thailandensis 从主培养板中取出。同样接种至含有4%甘油的LB肉汤中 B. mallei.
- 在37 °C条件下，以175至250 rpm振荡培养约18小时。
- 将 2 至 3 mL 培养物在 5,000 × g 离心 10 分钟。
- 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲液（PBS，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2PO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4。
- 用PBS稀释细菌，使菌液在分光光度计中于600 nm波长处测得的光密度（OD）为0.5。
- 将细菌在PBS中从起始OD值0.5开始进行十倍系列稀释。使用这些稀释后的菌悬液进行感染。
- 通过连续稀释法将接种物进行系列稀释，并取100 µL等分试样涂布于琼脂培养基上，测定菌落形成单位（CFU）。将平板在37 °C下培养24至48小时。
5. 药物制备
- 确定每单位体重所需的适当药物剂量。给予嘶鸣蟑螂的氯喹（CLQ）剂量是基于哺乳动物的标准剂量，即 50 mg/kg/天。
- 将目标药物用溶剂重新悬浮或稀释。例如，将 CLQ 溶于 PBS 中，配制成 12 mg/mL 的浓度。该浓度可在 25 µL 的注射体积中为约 6 g 的嘶鸣蟑螂提供 300 µg 药物。
- 如有必要，通过 0.22 µm 注射器滤器过滤药物溶液以实现灭菌。
- 将药物溶液储存于 4 °C 直至使用。注射前需将药物溶液加热至至少 21 °C（室温）。
6. 注射器的组装
- 通过旋转重复移液器上的调节旋钮，将指针设置为所需体积（25 µL）。
- 向内推动重复移液器的释放杆，并将推杆向外拉出。此时重复移液器已准备好安装已装液的注射器。
注意：通过在天平上测量排出的水量，校准重复移液器排出的体积。 - 用含有细菌或药物的悬液填充一支1 mL注射器。
- 将注射器连接至无菌的26或27 G × ½英寸（或更短）针头。
- 轻敲注射器，使气泡上升至顶部，并将气泡及部分悬液排入盛有10%次氯酸钠溶液的容器中。
- 将注射器卡入重复移液器的注射器卡槽中，针尖斜面朝上。
- 将释放杆向外拉出，并用力按下分配按钮，向盛有10%次氯酸钠溶液的容器中进行空白注射，直至注射器推杆与推杆部件接触。
- 再执行1至2次额外的空白注射，以确保液体能从注射器中正常排出。此时重复移液器已准备好进行注射操作。
7. 蟑螂注射
- 在BSL2或BSL3级别的实验环境中，于II级或III级生物安全柜内进行所有蟑螂注射操作，并穿戴机构推荐的个人防护装备。
- 在生物安全柜中，对可能接触嘶鸣蜚蠊的工作表面进行清洁。先使用10%次氯酸钠溶液，再用70%乙醇去除残留的次氯酸钠。让表面自然晾干。
- 用一只手握住嘶鸣蜚蠊的侧部。固定嘶鸣蜚蠊，使其在注射过程中无法回缩。轻微弯曲嘶鸣蜚蠊，使其腹部背板之间的角质膜暴露出来。
- 另一只手持移液器，使针头与嘶叫蟑螂背腹中线呈0°至30°角。刺穿位于第三节体节附近节间膜的角质层膜。rd, 4th，或 5th 从后端的背板。
注意：以图示角度将针头刺入嘶鸣蟑螂体内，可确保针头不会穿透蟑螂体壁。注射位点的选择可保证排出的物质被限制在充满血淋巴的腹腔内。在使用活菌或药物进行注射前，应先练习抓握嘶鸣蟑螂并用水进行模拟注射。 - 用力按下分配按钮以注入液体体积。以与插入时相同的角度轻柔地拔出针头。
- 将已注射的嘶鸣蜚蠊放入单独的容器中，以区别于尚未注射的嘶鸣蜚蠊。擦去注射部位可能渗出的血淋巴。
- 使用同一注射器和针头继续为同组内的其他嘶鸣蜚蠊进行注射。在活塞到达针筒底部之前停止注射，以避免最后一次给药剂量不准确。
- 对于单只马达加斯加发声蠊的多次注射，例如同时注射细菌和药物，应在马达加斯加发声蠊背侧体节背板的不同侧进行注射。或者，可通过在不同体节背板（3）处注射来完成多次注射。rd 至 5th).
- 确保容器盖子已牢固固定，必要时用胶带加固盖子。
- 将嘶鸣蜚蠊置于37 °C、加湿的培养箱中孵育。
8. 记录蜚蠊的发病情况与死亡率
- 在 II 级或 III 级生物安全柜中进行所有蜚蠊实验操作，并佩戴机构推荐的个人防护装备。使用 10% 次氯酸钠溶液清洁生物安全柜表面，随后用 70% 乙醇擦拭，工作区域静置晾干。
- 在 1 至 2 周的时间内，每日对蜚蠊进行一次或两次评分，评分依据为疾病严重程度评分表（表 1）。
- 将死亡的蜚蠊从容器中移除，并记录存活个体数量。
- 若容器底部积聚过多水分，将剩余存活的蜚蠊转移至洁净容器中；也可使用一次性纸巾擦除多余水分。
- 每日更换腐烂的食物，并将蜚蠊放回 37 °C 恒温高湿培养箱中。
- 实验结束时，将剩余存活个体放入生物危害袋中，并于 -80 °C 冷冻以实施安乐死。
- 对数据进行统计学分析14，以确定 LD50 值，并采用 Kaplan-Meier 法和 Log-Rank 检验分析生存率。与所有昆虫实验一样，对照组中可能出现部分死亡个体，此类死亡归因于昆虫的自然死亡率15。关于如何校正对照组死亡率的更详细讨论，请参见参考文献15。
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结果
本部分展示了马达加斯加鸣蠊感染后的实验结果 B. mallei，B. pseudomallei 或 B. thailandensis；结果表明，这种昆虫是适用于不同物种的可行动物模型 伯克霍尔德菌属 在研究毒力、药物毒性以及药物对细菌感染的疗效时，感染减毒突变株（Δhcp1) 高于感染野生型的各组 B. pseudomallei K96243，亲本 B. mallei SR1，或 B. thailandensis DW503 (图1）。相反，感染强毒株突变体（Δhcp2 或 Δhcp3) 以与野生型相似的方式杀死了嘶鸣蜚蠊 B. pseudomallei (图1）。感染哺乳动物无毒力的 伯克霍尔德菌属 物种, B. thailandensis...
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讨论
最佳实验条件始于健康的蜚蠊种群，这需要投入最少但持续的时间。尽管蜚蠊在没有食物和水的情况下仍可存活相对较长时间（约数周），但仍需每周或每两周进行一次笼舍维护。维护工作包括检查食物和水源，并确保笼舍保持干燥。在较高温度下进行适应和培养时，维持干燥的生活环境尤为重要；我们发现，若容器未每日清洁，在较高温度下蜚蠊的死亡数量更多，且死亡速度更快。
确保对嘶鸣蜚蠊进行一致给药或接种的关键在于用力按压重复移液器上的分配按钮。我们建议练习该技术，包括将注射器装载到重复移液器上以及执行空白注射。对于刚接触该技术的操作人员而言，操作过程中最耗时的步骤是在注射期间固定或 immobilizing 蛤蚧蜚蠊。因此，我们强烈建议在开展更复杂的项目之前，先练习固定和注射多只嘶鸣蜚蠊的技术。可通过专门饲养一小群仅用于注射练习的嘶鸣蜚蠊来实现这一目标。尽管我们发现，当将嘶鸣蜚蠊侧放时可快速完成注射，但其他固定方法（例如 将嘶鸣蜚蠊固定在光滑的曲面上；将其置于中指上，同时用食指和拇指固定）可能更受青睐，不同操作人员应尝试探索适合自己的方法。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
J. Chua、N.A. Fisher、D. DeShazer 和 A.M. Friedlander 设计了本文所述的实验方案。J. Chua、N.A. Fisher、S.D. Falcinelli 和 D. DeShazer 进行了实验。J. Chua 撰写了本文。
作者感谢 Joshua J. W. Roan、Nora D. Doyle、Nicholas R. Carter 和 Steven A. Tobery 提供出色的技术支持，感谢 David P. Fetterer 和 Steven J. Kern 提供统计分析。
本工作由美国国防威胁降低局资助，资助项目编号为 CBCALL12-THRB1-1-0270（授予 A.M.F）和 CBS.MEDBIO.02.10.RD.034（授予 D.D）。
观点、解释、结论和建议均为作者个人意见，不一定代表美国陆军的观点。
本出版物的内容不一定反映国防部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织亦不表示美国政府的认可。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 马达加斯加鸣蠊 | Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits，任意口味 | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| 带卡扣的一次性塑料容器或等效产品 | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| 带螺纹的一次性塑料容器或等效产品 | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER 系列重复移液器 | Dymax Corporation www.dymax.com | T15469 | |
| 注射器（1 mL） | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| 针头（26 或 27G × 1/2） | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| 磷酸氯喹 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria-Bertani（Lennox）培养基 | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| 琼脂 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
参考文献
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