方法文章

线粒体衍生肽处理后用于ERK激活的亚细胞组分分离

DOI：

10.3791/56496

⸱

2017年9月25日

 ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了如何使用线粒体来源的肽段刺激细胞，并评估磷酸化蛋白的信号级联反应及其定位。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体衍生肽（Mitochondrial-derived peptides, MDPs）是一类新型肽，由线粒体基因组中已知基因内的小型开放阅读框编码。MDPs 具有多种生物学效应，例如保护神经元免于凋亡、改善代谢指标以及保护细胞免受化疗损伤。Humanin 是首个被发现的 MDP，也是 MDP 家族中研究最为深入的肽。Humanin 的膜受体及下游信号通路已得到系统表征。近年来新发现的其他 MDPs，如 MOTS-c 和 SHLP1-6，其信号传导机制仍有待阐明。本文介绍一种基于细胞培养的方法，用于确定这些肽的功能。特别是，细胞分馏技术结合蛋白质印迹法（western blotting），可实现对关键信号分子激活状态和转位过程的定量分析。尽管存在其他细胞分馏方法，但本文所述方法简便且直接。这些方法可用于进一步阐明此类肽及其他治疗剂的作用机制。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新兴研究表明，线粒体衍生肽（mitochondrial-derived peptides, MDPs）在细胞保护和代谢过程中发挥着重要作用1,2,3。了解在MDPs存在条件下信号转导通路的变化，有助于揭示MDPs调控多种功能的作用机制。首个被发现的MDP——humanin，已被证实可通过与其受体结合，促进细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2）的磷酸化4,5。然而，ERK1/2激活后的下游效应仍尚未被充分研究。

ERK1/2级联反应是多种细胞过程的关键介导因子，包括增殖、细胞迁移、细胞代谢、存活以及凋亡6,7,8。为了协调这些不同的细胞过程，ERK1/2的活性和亚细胞定位受到磷酸酶和支架蛋白的严格调控9,10。除了翻译后修饰外，ERK1/2的动态穿梭也调节其信号功能、活性和特异性11,12。ERK1/2主要定位于细胞质13。一组锚定蛋白和支架蛋白有助于将ERK1/2保留在细胞骨架结构上、细胞器表面或细胞质中呈弥散分布13。在受到刺激后，ERK1/2被磷酸化，并从其锚定蛋白上解离，从而促使ERK1/2转位至其他亚细胞区域，包括细胞核、线粒体、高尔基体和溶酶体14,15,16。

尽管已知人源性蛋白humanin能够激活ERK1/2信号通路，但ERK1/2的激活仅在全细胞裂解液中被观察到。如前所述，由于ERK1/2的亚细胞定位在其下游效应中起关键作用，因此有必要同时分析磷酸化ERK1/2的亚细胞定位及其总体水平，以全面理解humanin诱导的ERK1/2激活及其下游靶点的激活情况。

为了确定活化型ERK1/2的作用靶细胞器，我们进行了亚细胞组分分离，随后对磷酸化的ERK1/2进行蛋白质印迹分析。该方法易于实施，仅需使用常规的实验室设备和试剂。所分离的亚细胞组分纯度较高，使得实验结果易于解释。免疫染色法检测ERK1/2可能获得类似结果，但某些亚细胞结构较难清晰观察，需要特殊的固定和通透处理方法。ERK1/2在不同亚细胞区域中的表达水平存在差异，若仅检测全细胞裂解液，这种差异可能导致假阳性或假阴性信号。因此，利用分离的亚细胞组分进行免疫印迹分析，能够更准确地揭示ERK1/2的定位情况。

该方法的多功能性使得可以对实验方案进行修改，以研究其他刺激物的影响，包括其他MDPs或如STAT3等其他信号分子的转位。最近发现的小分子人源素样肽（SHLPs）由16S rRNA区域编码，该区域也是人源素（humanin）的编码区，SHLPs与HN具有相似但不同的特性17。例如，SHLP2和SHLP3在处理8小时后激活ERK1/2，而人源素在5分钟内即可激活ERK1/2。检测不同肽处理下ERK1/2的亚细胞定位将有助于我们更深入理解这些肽的生物学功能。越来越多的证据表明，信号分子的亚细胞定位在其下游效应中起着关键作用。例如，STAT3传统上被认为在静息细胞中主要定位于细胞质，随后在细胞因子刺激下转入细胞核以激活基因表达18。STAT3也可转位至线粒体，调控三羧酸（TCA）循环和ATP的生成19。在自噬调控方面，STAT3在不同亚细胞区域的定位以多种方式调节自噬过程20。例如，核内STAT3通过转录调控自噬相关基因，发挥自噬调节因子的作用；细胞质中的STAT3则通过与自噬信号分子相互作用，持续抑制自噬；线粒体中的STAT3通过抑制氧化应激诱导的自噬，从而抑制和阻止线粒体自噬（mitophagy）。因此，这种亚细胞组分分离方法对于理解其他信号分子以及ERK1/2的功能至关重要。

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方案

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1. 肽处理细胞

  1. 接种两百万个SH-SY5Y或HEK293细胞（2 × 10⁶）6) 转入10 cm培养皿中，培养2天
  2. （可选）次日，用无血清的DMEM培养基洗涤细胞一次，若处理需在无血清培养基中进行，则加入无血清DMEM培养基过夜孵育。
  3. 第3天，将S14G-humanin肽溶解于经0.2 µm滤膜过滤的蒸馏水中，重悬配制成1 mM的储存液。
    注意：肽应溶解于适当的溶剂中，具体溶剂可根据肽的序列特性确定例如，总电荷）如果肽段为商业产品，制造商可能会提供相关信息。例如，S14G-humanin、SHLP2、SHLP6 和 MOTS-c 可溶于水。将肽段分装为适当的体积（例如，50 μL）以避免反复冻融。解冻后请勿再次使用。
  4. 将预热的含血清或无血清培养基分装至50 mL锥形管中，并加入室温保存的1 mM储备液，使其达到工作浓度（例如，1 µM，10 µM。
  5. 更换为6 mL步骤1.4中制备的肽溶液，孵育细胞适当时间。
    注意：根据您激活 ERK 的实验条件选择孵育时间。

2. 细胞质与细胞核的亚细胞组分分离

  1. 用 10 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞两次，加入 5 mL 冰冷的 PBS 刮下细胞，并将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
  2. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。
  3. 吸除 PBS，将沉淀重悬于 200 µL 冰冷的裂解缓冲液中（10 mM HEPES pH = 7.6，3 mM MgCl2，10 mM KCl，5% (v/v) 甘油，1% 非离子型表面活性剂 (C13H22O(C2H4O)n)，蛋白酶/磷酸酶抑制剂）。
    注意：为保持蛋白质的磷酸化状态，需新鲜添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂，且样品应始终置于冰上。避免反复冻融。在 -80 °C 冻存前，应将样品分装为小份（例如 50 μg）。
  4. 将重悬的沉淀在冰上孵育 15 分钟，然后在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 5 分钟。
  5. 收集上清液作为细胞质组分，保留沉淀用于获取核组分。
  6. 将上清液在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 10 分钟，以去除细胞碎片及其他污染物，然后将上清液转移至新的微量离心管中。此即为胞质溶胶组分。
  7. 将沉淀重悬于 200 μL 冰冷的洗涤缓冲液中（10 mM HEPES pH = 7.6，1.5 mM MgCl2，420 mM NaCl，25% (v/v) 甘油，0.2 mM EDTA，蛋白酶/磷酸酶抑制剂），并在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 5 分钟。
  8. 弃去上清液，将沉淀重悬于 100 μL 冰冷的核提取缓冲液中（20 mM HEPES pH = 7.6，1.5 mM MgCl2，420 mM NaCl，25% (v/v) 甘油，0.2 mM EDTA，蛋白酶/磷酸酶抑制剂），并在冰上进行 10 次超声处理（每次开启 5 秒，关闭 10 秒，振幅 30%）。
  9. 在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 10 分钟。
  10. 将上清液转移至新的微量离心管中。此即为核组分。
  11. 使用 BCA 法测定蛋白含量。

3. 粗线粒体组分

  1. 用 10 mL 冰冷的 PBS 清洗每个 10 cm 培养皿中的细胞，加入 5 mL 冰冷的 PBS，并使用细胞刮刀将细胞刮下。
    注意：使用三个 10 cm 培养皿的细胞可获得足够产量的线粒体，用于 Western Blotting。
  2. 将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，并将三个 10 cm 培养皿的细胞悬液合并至同一个 15 mL 圆锥形离心管中。
  3. 在 4 °C 条件下，以 600 × g 离心 10 分钟。
  4. 吸除 PBS，将沉淀重悬于 1 mL 冰冷的线粒体分离缓冲液（10 mM Tris-MOPS，1 mM EGTA/Tris，200 mM 蔗糖，调节 pH 至 7.4）中。
  5. 在冰上使用带有聚四氟乙烯涂层研杵的 2 mL 匀浆器，匀浆细胞 25 次。
    注意：此步骤对维持线粒体完整性并最大化线粒体组分得率至关重要。匀浆次数应根据不同细胞类型进行优化。开始操作前需预先冷却匀浆器。
  6. 将匀浆液转移至微量离心管中，在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 10 分钟，以去除细胞核和未破裂的细胞。
  7. 收集上清液，转移至新的微量离心管中，在 4 °C 条件下以 7,000 × g 离心 10 分钟。
    注意：沉淀较松散，收集上清液时应小心操作，避免扰动沉淀。
  8. 弃去上清液，将沉淀用 200 μL 冰冷的线粒体分离缓冲液重悬，并将溶液转移至新的微量离心管中。在 4 °C 条件下以 7,000 × g 离心 10 分钟。
  9. 重复步骤 3.8 以洗涤沉淀。此步骤中无需将上清液转移至新的微量离心管。
  10. 弃去洗涤后沉淀中的上清液，将含有线粒体的沉淀用 50 μL RIPA 缓冲液重悬。
  11. 将悬液置于冰上孵育 10 分钟。
  12. 在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 15 分钟。
  13. 将上清液转移至新的微量离心管中。此即为线粒体组分。
  14. 使用 BCA 法测定蛋白含量。

4. 磷酸化特异性蛋白的蛋白质印迹分析

  1. 进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（8-16%预制胶），并将蛋白质转移至PVDF膜4。
  2. 用含5% BSA的TBST（0.1% Polysorbate 20）在室温下孵育膜30分钟，以封闭背景中的非特异性结合位点。
    注意：检测磷酸化蛋白时，应使用BSA而非脱脂奶粉封闭。奶粉中含有大量酪蛋白（一种丰富的磷蛋白），会导致非特异性信号升高。
  3. 将膜与一抗（抗磷酸化ERK1/2抗体）在4 °C下孵育过夜。
  4. 次日，在室温下用TBST（0.1% Polysorbate 20）洗涤膜三次，每次5分钟。
  5. 在室温下用二抗（抗兔IgG-HRP）孵育膜1小时。
  6. 在室温下用TBST（0.1% Polysorbate 20）洗涤膜三次，每次5分钟。
  7. 将膜与ECL溶液孵育，并在成像仪中对膜进行成像。
  8. 用洗脱缓冲液在室温下洗脱膜15分钟，然后用TBST洗涤三次，每次5分钟。
  9. 使用抗总ERK1/2抗体重复步骤4.2至4.7。
  10. 为检测各组分纯度，进行SDS-PAGE并使用识别各细胞区室标志物的抗体进行免疫印迹（例如，核组分用Lamin B1，胞质用GAPDH，线粒体用TOM20）。

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结果

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采用本文所述方法，我们在完全培养基中分别用1 μM和100 μM的S14G-humanin（一种强效的humanin类似物21）处理HEK293和SH-SY5Y细胞，处理时间为指定时长（图1A和图1B）。随后，我们检测了总蛋白提取物中ERK1/2在Thr202/Tyr204位点的总形式及其磷酸化形式。S14G-humanin处理导致ERK1/2在其调控位点Thr202/Tyr204的磷酸化水平升高。ERK1/2的亚细胞定位在其信号转导功能中起重要作用，尤其影响其作用特异性。为了明确S14G-humanin介导的ERK1/2激活的作用靶点，我们分析了S14G-humanin处理后总ERK1/2及其磷酸化形式的亚细胞定位。在HEK293细胞中，磷酸化的ERK...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们证明了人源素肽介导的ERK1/2激活可在两种不同的细胞类型中发生，并且活化ERK1/2的亚细胞定位可能因条件不同而有所差异（例如，肽的剂量、时间点和细胞类型）。已有研究表明，人源素通过两种不同的受体传递信号22,23，这或许可以解释两种细胞系之间信号传导的差异，以及对人源素不同剂量的需求。这一现象的生理学意义尚未得到充分研究，但可能提示了一种HN在不同组织中产生依赖性反应的潜在机制。

ERK1/2 的磷酸化在 ERK1/2 信号通路中起着关键作用，且 ERK1/2 的磷酸化状态呈现动态变化。优化实验条件以确定在特定条件或刺激下 ERK1/2 磷酸化的时间点至关重要。为此，可尝试不同的刺激条件（例如，刺激剂量和培养基），并进行时间进程实验，以确定磷酸化水平达到最高的时间点。大多数研究仅关注全细胞裂解液中的 ERK1/2 磷酸化情况。然而，由于 ERK1/2 可在特定亚细胞区域与不同靶分子相互作用，并调控不同的下游级联反应，...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pinchas Cohen 是 CohBar 公司的股东和顾问。Kelvin Yen 曾担任 CohBar 公司的顾问。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究工作获得了SJK的艾里森/美国衰老研究基金会衰老研究项目博士后奖学金，以及PC获得的格伦基金会奖项和美国国立卫生研究院（NIH）资助（1P01AG034906，1R01GM 090311，1R01ES 020812）的支持。所有作者均出现在影片中。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
p44/42 MAPK (ERK1/2)细胞信号传导9102稀释比例 1:1,000
磷酸化-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)细胞信号传导4370稀释比例 1:1,000
Lamin B1细胞信号传导12586核标记物，稀释比例 1:1,000
GAPDH细胞信号传导5174胞质标记物，稀释比例 1:2,000
Tom20Santa CruzSC-17764线粒体标记物，稀释比例 1:2,000
抗兔-HRP 偶联抗体Cell Signaling7074稀释比例 1:30,000
RIPA 裂解与提取缓冲液ThermoFisher SCIENTIFIC89900
100 mm 培养皿ThermoFisher SCIENTIFIC12556002
HNG 肽Genescript
25 mm 注射器滤器ThermoFisher SCIENTIFIC09-719A
HEPESSigmaH3375
MgCl₂SigmaM8266
KClSigmaP9333
甘油SigmaG9012
Triton X-100ThermoFisher SCIENTIFICBP151-100
EDTASigma3609
MOPSSigmaM1254
EGTASigmaE3889
蔗糖SigmaS7903
Tris-baseThermoFisher SCIENTIFICBP152-1
HClSigmaH1758
PBSLonza17-512F
细胞刮刀FALCON353085
Halt™ 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 (100X)ThermoFisher SCIENTIFIC78440
Thomas 光滑杵组织研磨器组件Thomas Scientific3432S90
Tween-20ThermoFisher SCIENTIFICBP337-500
BSAThermoFisher SCIENTIFICBP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶BIO RAD4561104
Mini Trans-Blot 转膜模块BIO RAD1658030
Trans-Blot Turbo 快速转膜系统BIO RAD1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF 转膜试剂盒BIO RAD1704272
Clarity Western ECL 化学发光底物BIO RAD1705060
Restore Western blot 剥脱缓冲液ThermoFisher SCIENTIFIC21059
DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）ThermoFisher SCIENTIFIC11965-092
超声破碎仪，型号：FB120ThermoFisher SCIENTIFIC695320-07-12

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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