活细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的关键过程

摘要

了解细菌中必需过程的功能具有挑战性。利用靶向特异性染料进行荧光显微镜观察，可为微生物细胞生长和细胞周期进程提供关键见解。本文以Agrobacterium tumefaciens作为模式细菌，重点介绍用于活细胞成像以表征必需过程的方法。

摘要

DNA复制与分离、蛋白质合成、细胞壁生物合成以及细胞分裂等核心细胞过程依赖于对细菌存活至关重要的蛋白质功能。一系列靶向特异性染料可作为探针，用于深入理解这些过程。利用亲脂性染料染色可观察膜结构、可视化脂质微区以及检测膜泡形成。使用荧光标记的D-氨基酸（FDAAs）可标记肽聚糖生物合成位点，从而揭示细胞壁生物发生或细胞生长模式中的潜在缺陷。最后，核酸染料可指示DNA复制或染色体分离过程中可能存在的异常。氰基类DNA染料可标记活细胞，适用于延时显微镜观察，能够在细胞生长过程中实时监测拟核形态的变化。细胞标记方案可用于蛋白质耗竭突变体，以鉴定膜结构、细胞壁生物合成或染色体分离方面的缺陷。此外，延时显微镜可用于监测随着必需蛋白质的去除所引发的形态学变化，从而进一步揭示蛋白质功能。例如，耗竭必需的细胞分裂蛋白会导致细胞丝状化或分支化，而耗竭细胞生长相关蛋白则可能导致细胞变短或更趋圆形。本文提供了针对植物病原细菌Agrobacterium tumefaciens的细胞生长、靶向特异性标记及延时显微镜观察的实验方案。结合靶向特异性染料与延时显微镜技术，可实现对A. tumefaciens中必需生命过程的系统表征。最后，所提供的实验方案可便捷地调整应用于其他细菌中必需生命过程的研究。

引言

细菌细胞周期的进程需要协调多种过程，包括膜和细胞壁的生物合成、DNA复制与分离以及细胞分裂。要充分理解细菌细胞生物学的复杂性，必须研究这些基本事件；然而，由于这些通路中的关键组分在发生突变时会损害细胞活力，因此这一研究任务具有相当难度。利用表位荧光显微镜结合靶标特异性染料，是研究野生型和突变型细菌菌株中这些基本生命过程的一种强有力的方法。

特异性结合肽聚糖的染料包括荧光抗生素（如万古霉素-FL、博西林-FL）和荧光-D-氨基酸（例如，7-羟基香豆素-3-羧酸-3-氨基-D-丙氨酸，HADA；4-氯-7-硝基苯并呋咱-3-氨基-D-丙氨酸，NADA；四甲基罗丹明-3-氨基-D-丙氨酸，TADA）。在革兰氏阳性菌中，使用亚致死浓度的荧光抗生素类似物来探测肽聚糖生物合成位点，已被证明是揭示肽聚糖插入模式的有效策略^1,2,3,4。尽管荧光万古霉素标记已被用于研究固定后的革兰氏阴性菌中的肽聚糖插入模式⁵，但由于外膜通常构成通透性屏障，荧光抗生素一般无法用于活细胞中肽聚糖生物合成的检测。相比之下，短时间脉冲标记荧光-D-氨基酸或带有生物正交功能基团的D-氨基酸，可在多种活细菌细胞中共价标....

方案

1. A. tumefaciens 菌株的培养

1. 培养 A. tumefaciens 菌株
   1. 使用无菌的木签或移液器吸头，挑取单个目标菌株的菌落，接种于1 mL ATGN生长培养基中（培养基配方见材料列表）。
      注意：对于 A. tumefaciens 在缺失菌株中，ATGN 培养基应含有 1 mM IPTG 作为诱导剂，以维持必需蛋白的生物合成。
   2. 培养 A. tumefaciens 在ATGN中过夜培养菌株 28 °C 以225 rpm振荡培养。
   3. 在 600 nm 处测定细胞的光密度（OD₆₀₀) 使用分光光度计测定。将细胞培养液稀释至 OD₆₀₀ = ~0.2 并继续培养至 OD₆₀₀ = ~0.6 时停止。对于消耗型菌株，需在诱导剂存在下继续培养至 OD₆₀₀ = ~0.6 时停止。
   4. 使用野生型和突变型菌株 A. tumefaciens 在 OD₆₀₀ 约 0.6，用于靶标特异性染色和/或延时显微镜观察（见第 2 节和第 3.1 节）。对于诱导耗竭菌株，需洗去诱导剂（见第 1.2 节）。
2. 诱导剂去除用于表征

结果

对野生型 A. tumefaciens 细胞的靶向特异性标记
为说明细胞形态不受洗涤步骤或1% DMSO处理（用于稀释荧光染料）的影响，实验中直接从培养物中取样成像（图2A，最左图），或在按照1.2步骤通过离心洗涤细胞后成像（图2A，左图），或在用1% DMSO孵育细胞10分钟后洗涤并成像（图2A，右图）。这些图像表明，洗涤或DMSO的存在不会影响细胞形态。此外，根据生长曲线分析，细胞生长也不受洗涤或DMSO处理的影响（数据未显示）。此外，用冰乙醇固定 A. tumefaciens 不会引起明显的形态学变化（图2A，最右图）。

讨论

本方案包含一系列用于研究根癌农杆菌（A. tumefaciens）野生型、突变株及缺陷株的实验步骤。值得注意的是，方案部分所列的所有步骤均可通过适当调整培养基、温度和生长速率等条件， readily 适用于其他细菌菌株。

使用靶向特异性染料是详细表征细菌细胞中细胞周期事件的有力工具。本文中，利用荧光标记的D-氨基酸观察肽聚糖的插入模式，使用4-64可视化脂质结构域，并用DAPI或Orange对拟核进行标记。每种实验方案均可通过优化洗涤步骤并确保DMSO处理不影响细菌生长或形态，进而适用于其他细菌。关键注意事项包括选择合适的洗涤缓冲液、标记物孵育时间，以及选择适当的荧光团以避免自发荧光或实现多重标记研究。例如，脂溶性红色荧光膜染料（4-64）的替代品为绿色荧光膜染料（1-43）。类似地，已有蓝色、绿色和红色荧光D-氨基酸可供使用^6,38，且带有生物正交反应基团的D-氨基酸可通过点击化学与常用荧光团偶联⁶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌菌株
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depletion of the essential master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
名称	公司	目录编号	备注
培养基组分
ATGN最小培养基			向1 L无菌水中加入50 ml 20X缓冲液、50 ml 20X盐溶液和12.5 ml 40%葡萄糖。制备平板时，向1 L水中加入15 g Bacto琼脂并高压灭菌。冷却至55 °C后加入50 ml 20X缓冲液、50 ml 20X盐溶液和12.5 ml 40%葡萄糖。
20X AT缓冲液			将214 g/L KH2PO4溶于水中，用氢氧化钠调节pH至7.0，高压灭菌。
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT盐溶液			向水中加入40 g/L (NH4)2SO4、3.2 g/L MgSO4•7H2O、0.2 g/L CaCl2•2H2O，以及0.024 g/L MnSO4•H2O。高压灭菌。
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
葡萄糖	Fisher Chemical	D16	在水中配制40%母液，过滤除菌。
Bacto琼脂	Fisher BioReagents	BP1423	制备平板时，向1 L水中加入15 g。
名称	公司	目录编号	备注
可选培养基添加剂
卡那霉素	GoldBio	K-120	在水中配制100 mg/ml母液，过滤除菌。使用终浓度为200 µg/ml。
IPTG	GoldBio	I2481C5	在水中配制1 M母液，过滤除菌。根据诱导需要使用终浓度为1 mM。
名称	公司	目录编号	备注
显微镜材料
显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550D	25 × 75 × 1.0 mm。用Sparkle玻璃清洁剂清洗。
显微镜盖玻片	Fisherbrand	12-541-B	22 × 22 mm，1.5号。用Sparkle玻璃清洁剂清洗。
Sparkle玻璃清洁剂	Home Depot	203261385	不含氨和酒精。
超纯琼脂糖	Invitrogen	16500-100	加入水、PBS或培养基中，终浓度为1–1.5%。微波炉中融化后置于70 °C。
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X溶液需用无菌水稀释至1X。
Parafilm	Bemis	PM-999	在琼脂糖垫制备中用作密封垫片的实验室薄膜。
VALAP			将等质量的羊毛脂、石蜡和凡士林加入锥形管中。在70 °C的干浴、金属珠浴或水浴中加热熔化并混合。趁熔融状态时使用VALAP。
羊毛脂	SAAQIN	SQ-LAB-R1
凡士林	Target Corp.	06-17644
石蜡	Crafty Candles	263012
名称	公司	目录编号	备注
靶向特异性染料
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	根据需要用于稀释染料母液。
FDAAs（NADA、HADA、TADA）			FDAAs可自行合成，或通过与Mike VanNieuwenhze（印第安纳大学）达成协议获取。在DMSO中配制100 mM母液。使用终浓度为5 mM。
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	在DMSO中配制1 mg/ml母液。使用终浓度为1 µg/ml。
SYTOX Orange核酸染色剂	Invitrogen	S11368	母液浓度为5 mM（溶于DMSO）。使用终浓度为5 µM。
FM4-64	Invitrogen	T3166	在DMSO中配制8 mg/ml母液。使用终浓度为8 µg/ml。
名称	公司	目录编号	备注
设备
干浴器	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
金属热珠	Lab Armor	42370-002
配备EMCCD相机的落射荧光显微镜			本研究使用Nikon Eclipse TiE显微镜，配备QImaging Rolera em-c2 1K电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机。