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方法文章

用于优化斑马鱼幼鱼显微注射与成像的微结构装置

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DOI：

10.3791/56498

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2017年12月8日

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

本文内容

摘要

斑马鱼胚胎和幼鱼的显微注射是一种在多种斑马鱼模型中至关重要的技术，但也具有挑战性。本文介绍了一系列微尺度工具，可用于在显微注射和成像过程中辅助稳定和定向斑马鱼样本。

摘要

斑马鱼已成为研究多种人类疾病的强大模型，并被广泛应用于越来越多的实验研究中，涵盖从基础发育生物学到大规模遗传学和化学筛选等多个领域。然而，许多实验，特别是与感染和异种移植模型相关的实验，依赖于对胚胎和幼鱼进行显微注射和成像，这些技术操作繁琐，且需要较高的技能与经验。为了提高现有显微注射技术的精确性和通量，我们开发了一系列微结构装置，可在操作前将受精后2天（dpf）的斑马鱼胚胎以腹侧、背侧或侧向方位进行定向和稳定。为辅助胚胎成像，我们还设计了一种结构简单的装置，其通道可将4条斑马鱼并排侧向固定于玻璃盖玻片上。综上所述，本文所展示的工具证明了采用光刻技术制备实用装置在优化斑马鱼实验技术方面的有效性。

引言

斑马鱼已成为许多研究领域的强大模型，从基础发育生物学研究到大规模遗传学和化学筛选均广泛应用1,2。常规的遗传操作，如基因过表达、基因敲低、CRISPR/Cas9 介导的诱变以及转基因技术，均依赖于将遗传物质显微注射至单细胞受精卵中，这推动了用于定向和固定卵子以便注射的简单、易用且可商业获取的工具的发展3。其他实验方法，如细胞移植和感染实验，通常需要使用更大口径的毛细玻璃针将物质注射至发育后期的胚胎或幼鱼中4。然而，使用更大口径的注射针会带来显著的技术挑战，因为更难在不推动或滚动胚胎的情况下穿透目标组织。在此类条件下，维持适当的水表面张力以固定胚胎并防止操作过程中胚胎干燥十分困难，且胚胎可能无法被理想地定位，从而影响对目标组织的准确注射。

显微注射后，通常需要对注射后的胚胎进行筛选，以挑选出成功注射的个体，并获取初始时间点的图像。为解决这些挑战，我们开发了一系列微结构装置，可帮助在显微注射过程中5以及注射后快速基于图像的筛选过程中，以不同方向稳定固定2 dpf胚胎。

为了在这些装置中获得足够的结构分辨率，我们采用了光刻技术。该技术在微电子工业中广泛应用，近年来也被拓展应用于微流控器件的制造，能够实现1-1,000 µm范围内的垂直结构，这一尺度非常适合斑马鱼胚胎和幼鱼的操作。所有装置均采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制作，该材料成本低、物理性能稳定、生物惰性强且透明。

微结构化表面阵列（MSAs）由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，其顶部表面具有特定图案，类似于常用于卵细胞显微注射的琼脂糖块中的简单通道结构。在注射后的筛选过程中，可在标准的玻璃底六孔板中排列6个成像装置。这些装置设计便于胚胎的加载，同时其卸载过程可方便地回收特定胚胎，从而以比Beebe实验室先前开发的装置更用户友好的方式促进基于成像的筛选方法6。

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方案

幼虫显微注射实验已获得麻省总医院研究动物护理小组委员会在方案2011N000127下的批准。

1. 器件制备

注意：本文所述用于设计光刻掩模的所有计算机辅助设计（CAD）文件（图1）均可下载。相关链接见材料表。

  1. 在1,000级洁净室中，使用标准的光刻技术制备母模晶圆7。对于微结构阵列和通道，根据制造商说明，使用三种不同的掩模分三层依次图形化环氧基负性光刻胶：浅层结构为100 µm，中层结构为200 µm，深层结构为400 µm。对于成像装置，使用两层结构，浅层为400 µm，深层为600 µm。
  2. 将完成的晶圆用胶带固定在15 cm培养皿底部以进行浇铸（图2）。

2. 微结构表面阵列的制备 - PDMS

  1. 为了制备可用的装置，使用母版晶圆作为模具浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）。将50 g PDMS单体与5 g引发剂混合，在塑料称量皿中用塑料叉充分搅拌。
  2. 小心地将混合物倒入模具中。
  3. 在真空干燥器中于16–25 inHg（54–85 kPa）下脱气1小时。
  4. 将PDMS在65 °C下烘烤至少3小时以完成固化。PDMS应固化为坚固但柔韧的固体。
  5. 使用解剖刀在母版晶圆上沿装置轮廓小心切割，确保刀尖始终与晶圆表面接触。用镊子将PDMS复制品从晶圆上剥离，并转移至洁净的10 cm培养皿中，使结构面朝上（图3）。
  6. 使用等离子体清洗机对装置进行35秒的氧气等离子体处理，以降低其疏水性。
  7. 用含有168 mg/L丙氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222，pH 7.5）的斑马鱼胚胎培养基（E3）覆盖装置。使用移液管将液体流过装置表面，以去除较深结构中的气泡。

3. 微结构表面阵列的制备 - 琼脂糖

  1. 制备负性PDMS模具时，首先需对PDMS器件进行氧等离子体处理。
  2. 使用1H,1H,2H,2H-三乙氧基硅烷全氟辛基（PFDTS）硅烷蒸气处理PDMS器件，以形成惰性表面8。简要步骤如下：
    1. 将待处理的PDMS器件特征面朝上放置于通风橱内的真空腔室中。
    2. 在PDMS器件旁放置一个小型敞口玻璃或铝制培养皿，并小心地用移液器将200 µL的PFDTS（98%硅烷）加入培养皿中。
      注意：PFDTS硅烷具有高度挥发性，遇水剧烈反应，易燃，且接触后可导致严重的皮肤和眼部损伤。使用前请详细阅读材料安全数据表（MSDS）。
    3. 关闭真空腔室，抽真空15–30分钟，或直至PFDTS硅烷完全蒸发。
  3. 将处理后的器件放入培养皿中，作为新鲜PDMS的模具使用，新鲜PDMS的制备方法如步骤2.1–2.3所述。
  4. 在65 °C下烘烤至少3小时，然后将整层新鲜PDMS从处理过的器件上剥离，并转移至新的培养皿中。此PDMS层可作为负模用于浇铸琼脂糖。
  5. 制备琼脂糖时，将2%低凝胶温度琼脂糖溶于E3溶液中，在微波炉中加热至沸腾，直至琼脂糖完全溶解。
  6. 将热琼脂糖溶液倾倒于PDMS负模上，并用移液管将热琼脂糖在器件表面流动，以去除覆盖在特征结构上的气泡。
  7. 气泡去除后，于4 °C下冷藏使琼脂糖凝固。
  8. 通过手动从下方变形PDMS的方式，将琼脂糖块从负性PDMS模具中取出，转移至新的培养皿中，并用含MS-222的E3溶液润湿。

4. PDMS 成像装置的制备

  1. 为制备可用的装置，使用主模板作为模具浇铸PDMS。将50 g PDMS单体与5 g引发剂（与步骤2.1中所用相同）在塑料称量皿中用塑料叉充分混合。
  2. 小心将混合物倒入模具中。
  3. 在真空干燥器中于16–25 inHg（54–85 kPa）下脱气1小时。
  4. 为固化PDMS，在65 °C下烘烤至少3小时。PDMS应固化为坚固但柔韧的固体。
  5. 从主模板上切下装置，并使用1.5 mm打孔器打出进出口孔。
  6. 按照步骤2.6所述方法，将装置和6孔玻璃底培养板用氧气等离子体处理35秒。
  7. 将每个装置的特征面朝下，贴合至6孔板的每片玻璃盖玻片上，并置于85 °C加热板上加热10分钟以实现键合。
    注意：为确认键合成功，可用镊子用力按压已键合装置的一侧。装置应牢固附着于玻璃盖玻片上，不脱落。

5. 斑马鱼培养

  1. 采用标准技术将斑马鱼胚胎培养至2 dpf3。
  2. 在装载到装置前至少30–60分钟，使用镊子或1 mg/mL蛋白酶混合液（见材料表）去除胚胎的绒毛膜，以使其伸直3。
  3. 通过向培养皿的E3培养基中加入1 mL 25倍浓缩的MS-222储备液（终浓度168 mg/L，pH 7.5），对胚胎进行麻醉处理。

6. 斑马鱼在微结构表面——凹坑阵列上的定向行为

  1. 将步骤 2.7 中制备的 PDMS 块（图 3A）置于其培养皿中，并在其表面覆盖一层薄的 E3 溶液（1–2 mm），以便于胚胎的操作。
  2. 使用转移移液器将所需数量的胚胎（通常每组条件 10–20 个）转移至 PDMS 块的表面。
  3. 使用显微操作工具（毛细环或类似工具）将胚胎推入微结构凹坑中（图 3A）。凹坑特别适用于胚胎的背侧和腹侧方向固定。
    注意：对于贴合较紧的凹坑（背侧和腹侧），建议先将胚胎平行于凹坑放置在块体表面，再用毛细环将其滚动至凹坑内。将胚胎进一步推入凹坑深处有助于保持其稳定。

7. 斑马鱼在微结构化表面的定向行为——微结构化通道

  1. 使用转移移液管从带有微结构通道的PDMS块（图3B）中吸出E3，直至E3液面低于PDMS块边缘，但储液区、通道内以及PDMS表面仍保留一层薄薄的E3液体。
  2. 使用转移移液管将步骤5.3中的10个胚胎转移至储液区，注意避免液体溢出边缘。
  3. 使用毛细环将每个胚胎移入相应通道入口处的漏斗结构，并调整其方向，使胚胎头部朝向通道，且进入通道时保持正确的方位。
  4. 用毛细环将每个胚胎沿通道滑入，直至其到达通道壁上的定位微结构特征处，该结构有助于固定胚胎位置。建议在进行侧向定位时特别使用微结构化通道。
    注意：为减少显微注射过程中胚胎的滑动，可尝试通过从储液区吸出部分E3来调节表面张力。

8. 斑马鱼的显微注射

  1. 准备显微注射针。
    1. 使用拉针仪制备硼硅酸盐玻璃微量毛细管针，方法如前所述4。所得针尖应在一端逐渐变细至尖端，锥形部分长度约为 10 mm。
    2. 配制待注射溶液，本实验中为含 100 nM 趋化因子（N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）或白三烯 B4（LTB4））和 100 nM 70 kDa 罗丹明葡聚糖示踪剂的 PBS 溶液。
    3. 使用细锥形移液器吸头（见材料表）将 5 µL 溶液装入注射针中。
    4. 将注射针安装至固定在磁力支架上的显微操作器，并连接至皮升注射泵（picopump）微注射装置。
  2. 用镊子夹住锥形针尖，以约 45° 角折断针尖。
  3. 通过调节皮升注射泵控制器上的注射时间，将注射体积调整为 1 nL。
  4. 调节显微注射针的角度。通常将显微操作器上的针角度设为 45° 是一个良好的起始点，此时针头与胚胎长轴平行。若需减少显微注射过程中胚胎的侧向移动，可采用更陡的角度。
  5. 左手控制培养皿，右手操控显微注射针的操作臂，将针头尽可能接近预定的注射部位，本实验中为耳泡（otic vesicle）。
    注：耳泡位于眼后方，呈椭圆形器官，其内含有两个较小且明显的深色椭圆结构（耳石），可据此识别。
  6. 使用显微操作器将针头刺入靶组织（本实验中为耳泡），使针尖进入耳泡腔内，并通过皮升注射泵脚踏开关注入预设体积的溶液。
    注：若组织阻力较大难以刺入，可尝试轻轻敲击显微操作器旋钮。
  7. 用移液器将 E3 培养基从上至下冲洗培养皿表面，或轻轻旋转培养皿，使胚胎脱离并释放到周围的 E3 培养基中。
  8. 使用移液器将胚胎转移至不含 MS-222 的 E3 恢复培养皿中。

9. 使用 PDMS 成像装置筛选胚胎

  1. 通过端口将 E3（含 MS-222）流经第 4.7 步中的装置以进行预灌注。可使用 1,000 µL 移液器或细尖转移移液器完成此操作。
  2. 用 E3 + MS-222 填充孔，直至完全覆盖装置。
  3. 使用转移移液器将第 8.7 步中注射的 4 个胚胎转移至每个孔中。如需要，可在加载前（第 5.3 步）将胚胎在 E3 + MS-222 中孵育 1–2 分钟以预先麻醉。
  4. 使用显微操作工具（毛细环或类似工具），将胚胎按所需方向（根据所用装置选择尾部朝前或头部朝前）置于成像通道的入口处，并将其部分推入装置内（图 4A）。这有助于使胚胎均匀地进入装置。
  5. 使用 1,000 µL 移液器或转移移液器从端口将 E3 通过装置抽吸，直至胚胎被吸入通道并处于正确的成像方向（图 4B）。
    注意：注意不要将胚胎吸入超过捕获点，否则会损伤胚胎并改变其方向。
  6. 将培养板转移至显微镜下进行成像（图 4C）。
  7. 使用倒置荧光显微镜进行成像。
    1. 通过选择合适的物镜调整放大倍数。通常，10X 是成像斑马鱼中性粒细胞迁移的有用放大倍数。
    2. 针对每个通道调节光源强度和曝光时间，使每个信号清晰但不饱和。
    3. 采集每个通道的图像。此处我们使用了绿色荧光蛋白（GFP，Ex: 470/22，Em: 525/50）、德克萨斯红（TxRed，Ex: 585/29，Em: 628/32）和透射光通道。多通道图像可在后期处理过程中合并（图 4B-I）。

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结果

本文所述方法展示了用于2天龄斑马鱼的装置设计（图1）及其制造过程，采用光刻（图2）和软光刻（图3）技术。该方法可快速测试多种设计迭代与修改方案，且通过调整和优化微结构尺寸以适用于斑马鱼其他发育阶段，可进一步拓展其应用范围。

我们展示了这些装置在具有挑战性的显微注射技术及便捷成像中的应用。耳囊（图4D，白色虚线轮廓）为在斑马鱼中检测中性粒细胞募集提供了一个有用、免疫豁免且独立的位点9。为了检测斑马鱼中性粒细胞对标准趋化因子的响应能力，将100 nM的fMLP和LTB4通过微结构化通道装置（图1G）显微注射至2天龄...

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讨论

本文介绍了我们近期开发的用于促进2 dpf斑马鱼显微注射的装置5，并提出一种简便的无琼脂糖固定装置，便于胚胎成像。这些工具凸显了光刻技术在制备适用于斑马鱼实验操作的装置方面的实用性。

我们发现，MSA装置在注射容易在显微注射针内聚集的细胞或颗粒时尤为有用，例如真菌分生孢子或人源癌细胞，这些物质的递送需要使用孔径较大的注射针。向耳囊（图4）注射具有特殊挑战性，因为胚胎在接触注射针时常会发生滚动。我们发现，使用具有微结构的通道将斑马鱼固定并稳定于侧向位置，可显著提高该技术的操作通量和准确性。

为了在不同时间点快速成像侧向固定的斑马鱼（例如中性粒细胞募集或异种移植转移的评估），避免使用琼脂糖可提高胚胎固定的一致性，并减少成像后回收过程中的损伤风险。这些装置在长时间延时成像中也显示出良好前景，已成功用于在12小时内以极小的斑马鱼运动实现多通道、多层面的图像采集。由于不受琼脂糖的限制，幼鱼在此期间的主动伸长效应（约在54至78小时...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 David Langenau 慷慨提供水族箱空间；感谢 Eric Stone、John C. Moore 和 Qin Tang 在斑马鱼饲养和试剂方面的帮助；感谢 Leonard Zon 实验室的 Anne Robertson 和 Elliott Hagedorn 提供本研究所用的斑马鱼品系。作者还感谢 Octavio Hurtado 在光刻技术方面提供的建议。FE 获得儿童烧伤医院（Shriner's Hospital for Children）和美澳协会（American Australian Association）奖学金的资助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金 GM92804 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
道康宁 Sylgard 184 聚二甲基硅氧烷 (PDMS)艾尔斯沃思胶粘剂184 SIL ELAST KIT 0.5KG用于铸造装置。套件包含 PDMS 单体和引发剂
低凝胶温度琼脂糖西格玛-奥德里奇A9414-10G用于铸造琼脂糖装置
PFDTS 硅烷西格玛-奥德里奇448931-10G用于铸造负性 PDMS 模具
三卡因 (MS-222)西格玛-奥德里奇E10521-10G用于麻醉斑马鱼
罗丹明葡聚糖 70,000 Da赛默飞世尔科技D1818用于追踪显微注射
白三烯 B4 (LTB4)凯曼化学20110中性粒细胞趋化剂
N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸 (fMLP)西格玛-奥德里奇F3506-50MG中性粒细胞趋化剂
15 cm 培养皿费舍尔科学08-757-148用于从主模板铸造装置
玻璃底 6 孔板MatTekP06G-0-20-F用于成像装置
硼硅酸盐玻璃微量毛细管世界科学仪器公司TW-100-4用于显微注射针头
移液管西格玛-奥德里奇Z350796用于转移斑马鱼胚胎
Microloader 加样头费舍尔科学E5242956003用于向显微注射针头中加样
Harris Uni-Core 1.5 mm 打孔器Ted Pella 公司15111-15用于在 PDMS 成像装置上打孔
11 号手术刀精细科学工具10011-00用于切割 PDMS
Dumont 5 号镊子精细科学工具11252-10用于去除胚胎外壳及打断显微注射针尖
马尔佐豪泽 MicromanipulatorASIMM33-R用于操控显微注射针头
磁力支架MSCSPI - 87242624用于安装显微操作器
MPPI-3 皮升泵控制器ASIMPPI-3用于控制显微注射体积和时间
EVOS 倒置荧光显微镜赛默飞世尔科技EVOS FL用于成像已注射的胚胎
解剖显微镜尼康SMZ745用于观察显微注射过程
AutoCAD 软件欧特克从以下网址下载 AutoCAD 文件：https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 以及 ZFIN 社区实验方案维基页面：https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki  

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