Method Article

斑马鱼幼虫显微注射和成像的微装置

DOI:

10.3791/56498

⸱

December 8th, 2017

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

In This Article

Summary

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斑马鱼胚胎和幼虫的显微注射是许多斑马鱼模型中的关键但具有挑战性的技术。在这里, 我们提出了一系列的微型工具, 以帮助稳定和定位斑马鱼的显微注射和成像。

Abstract

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斑马鱼已经成为各种人类疾病的强有力的模型, 并成为越来越多的实验研究的有用工具, 通过大规模的遗传和化学屏障跨越了基础发育生物学。然而, 许多实验, 特别是那些与感染和异种模型有关的试验, 依赖于胚胎和幼虫的显微注射和成像, 这些都是需要技能和专长的费力技术。为了提高目前显微注射技术的精确度和吞吐量, 我们开发了一系列微装置, 在2天后, 在腹侧、背部或侧面定向后, 对斑马鱼胚胎进行定位和稳定。程序.为了帮助对胚胎进行成像, 我们还设计了一个简单的装置, 使4只斑马鱼在平行的方向上与一个玻璃覆盖层滑动。在这里, 我们展示了光刻方法的有效性, 为斑马鱼技术的优化创造了有用的设备。

Introduction

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斑马鱼已经成为一个强大的模型, 许多领域, 从基础发展生物学研究到大规模的遗传和化学屏幕1,2。常规的基因操作, 如基因过度表达、击倒、CRISPR/Cas9 突变和转基因依赖于单细胞受精卵的微注射, 这导致了简单易用的商业用于定向和稳定注射的卵子的可用工具3。其他方法, 如移植和感染, 往往需要注射到后期胚胎和幼虫使用较大的规范毛细管针头4。然而, 使用更大的规格针提出了重大的技术挑战, 因为它是更难穿透目标组织不推或滚动的胚胎。在这些条件下, 获得稳定胚胎所需的适当的水张力, 同时避免在手术过程中干燥是困难的, 而且胚胎可能不是理想的定向注射到靶组织。

在注射后, 筛出的胚胎选择那些已成功注射的胚, 并捕捉初始时间点的图像, 通常是有用的。为了应对这些挑战, 我们开发了一系列的微设备, 帮助稳定 2 dpf 胚胎的各种方向, 既用于微注射5, 也用于快速基于图像的扫描后注射。

为了在这些装置中获得足够的结构分辨率, 我们利用了光刻技术。这些方法通常用于微电子工业, 并且最近被外推用于微流控芯片的制造, 因此可以实现垂直结构, 范围从1-1、000µm, 这是一....

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Protocol

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根据《2011N000127 议定书》, 马萨诸塞州总医院研究动物保育小组委员会批准了微注射幼虫。

1. 设备制造

注: 此处描述的用于设计光刻掩模的所有计算机辅助绘图 (CAD) 文件 (图 1) 均可供下载。查看链接的材料表。

  1. 使用标准光刻技术7, 在1000级洁净室中制造主模具晶片。对于微结构阵列和通道, 按照制造商的说明, 在3层中依次使用3个单独的掩码对环氧基负光刻胶进行模式设计: 100 µm 为浅特征, 200 µm 为中等特征, 400 µm的深层特征。对于成像设备, 使用400µm 为浅层特征和600µm 的深部特征模式两个图层。
  2. 将完成的晶片带到 15 cm 培养皿的底座上 (图 2)。

2. 微表面阵列的制备

  1. 制作可用的设备, 铸造烷 (矽), 使用主晶片作为模具。将50克的硅烷单体与5克的引发剂结合在一起, 在塑料称重皿中彻底混合。
  2. 把混合物仔细地浇在模子上。
  3. 德加在真空干燥在 16-25 inHg (54-85 帕斯卡) 为 1 h。
  4. 为了治疗,....

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Results

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此处介绍的方法演示了设计 (图 1) 和用于 2 dpf 斑马鱼的设备的制造, 使用光刻 (图 2) 和软光刻 (图 3) 技术。此方法允许对许多设计迭代和修改进行快速测试, 并且在其他开发阶段与斑马鱼一起使用的微观结构尺寸的改变和优化可能会延长它们的应用范围。

我们示范使用这些设备的挑战显微注射技术和方便成像。耳囊泡 (图 4D, 白色虚线轮廓) 提供了一个有用的, 免疫特权和孤立的网站, 以测试中性粒细胞招募在斑马鱼9。为了测试斑马鱼中性粒细胞对标准化的反应能力, 100 nM 的 fMLP 和 LTB4 被微量到 2 dpf 斑马鱼胚胎的耳囊中 (

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Discussion

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在这里, 我们描述了使用的设备, 我们最近开发, 以方便 2 dpf 斑马鱼微注射5, 并介绍了一个简单的琼脂糖免费安装装置, 方便成像的胚胎。这些工具突出了光刻技术的效用, 用于制作适用于斑马鱼技术的设备。

我们发现 MSA 装置特别适用于注射针内的细胞或微粒, 如真菌孢子或人类癌细胞, 这需要使用更大的钻孔针来运送。注射到耳泡 (图 4) 提出了一个特殊的挑战, 因为胚胎经常在与针头接触时滚动。我们发现, 使用微通道, 定向和稳定斑马鱼的横向方向大大提高了这一技术的吞吐量和准确性, 在我们手中。

快速成像的横向定向斑马鱼在不同的时间点, 如评估中性粒细胞的招募或异种转移, 避免琼脂糖增加了胚胎之间的一致性和减少的机会损害后成像救援。这些设备也显示了延长的时间推移成像的承诺, 并已被用来成功捕获多通道, 多图像与最小的鱼移动超过12小时。因为它们不受琼脂糖的约束, 所以在这段期间幼虫的活性伸长 (300 µm 从 54.......

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Disclosures

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作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

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作者要感谢大卫 Langenau 慷慨地提供水族馆空间;埃里克石头, 约翰 c. 摩尔和秦唐帮助与斑马鱼的维护和试剂, 和安妮罗伯逊和艾略特 Hagedorn 从伦纳德区的实验室购买的斑马鱼菌株在这里使用。他们还要感谢奥克塔维奥 Hurtado 关于光刻技术的建议。FE 的经费来自实力的儿童医院和美国澳大利亚协会的研究金。这项工作由 NIH 资助 GM92804。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
道康宁 Sylgard 184 聚二甲基硅氧烷 （PDMS）Ellsworth Adhsives184 SIL ELAST 套件 0.5KG用于铸造设备。套件包括 PDMS 单体和引发剂
低胶凝温度琼脂糖Sigma AldrichA9414-10G用于琼脂糖装置的灌注
PFDTS 硅烷Sigma Aldrich448931-10G用于负性 PDMS 模具的灌注
三卡因 （MS-222）Sigma AldrichE10521-10G麻醉斑马鱼
罗丹明葡聚糖 70,000 DaThermoFisherD1818追踪显微注射
白三烯 B4 （LTB4）开曼化学20110中性粒细胞趋化剂
N-甲酰甲硫氨酸 - 亮氨酰 - 苯丙氨酸 （fMLP）Sigma AldrichF3506-50MG中性粒细胞趋化剂
15 厘米培养皿Fisher scientific08-757-148用于从主晶圆铸造
玻璃底 6 孔板MatTekP06G-0-20-F用于成像设备
硼硅酸盐玻璃微毛细管世界科学仪器公司TW-100-4用于微量注射针
移液管Sigma AldrichZ350796用于转移斑马鱼胚胎
微量注射针头Fisher scientificE5242956003用于装载微量注射针
Harris Uni-Core 1.5 毫米冲头泰德·佩拉公司15111-15用于 PDMS 成像设备中的打孔
No. 11 手术刀精细科学工具10011-00用于切割 PDMS
Dumont No. 5 镊子精细科学工具11252-10用于去除胚胎和折断显微注射针尖
Marzhauser 显微作器ASIMM33-R用于作显微注射针
磁性支架MSCSPI - 87242624用于安装显微作器
MPPI-3 皮泵控制器ASIMPPI-3控制显微注射体积和时间
EVOS 倒置荧光显微镜ThermoFisherEVOS FL对注射胚胎进行成像
解剖显微镜尼康SMZ745用于显微成像
AutoCAD 软件Autodesk从以下网址下载 AutoCAD 文件：https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 和 ZFIN 社区协议 wiki 页面：https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ 协议+Wiki  
口

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916

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