斑马鱼胚胎和幼鱼的显微注射是一种在多种斑马鱼模型中至关重要的技术，但也具有挑战性。本文介绍了一系列微尺度工具，可用于在显微注射和成像过程中辅助稳定和定向斑马鱼样本。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼已成为研究多种人类疾病的强大模型，并被广泛应用于越来越多的实验研究中，涵盖从基础发育生物学到大规模遗传学和化学筛选等多个领域。然而，许多实验，特别是与感染和异种移植模型相关的实验，依赖于对胚胎和幼鱼进行显微注射和成像，这些技术操作繁琐，且需要较高的技能与经验。为了提高现有显微注射技术的精确性和通量，我们开发了一系列微结构装置，可在操作前将受精后2天（dpf）的斑马鱼胚胎以腹侧、背侧或侧向方位进行定向和稳定。为辅助胚胎成像，我们还设计了一种结构简单的装置，其通道可将4条斑马鱼并排侧向固定于玻璃盖玻片上。综上所述，本文所展示的工具证明了采用光刻技术制备实用装置在优化斑马鱼实验技术方面的有效性。
引言
斑马鱼已成为许多研究领域的强大模型，从基础发育生物学研究到大规模遗传学和化学筛选均广泛应用1,2。常规的遗传操作，如基因过表达、基因敲低、CRISPR/Cas9 介导的诱变以及转基因技术，均依赖于将遗传物质显微注射至单细胞受精卵中，这推动了用于定向和固定卵子以便注射的简单、易用且可商业获取的工具的发展3。其他实验方法，如细胞移植和感染实验，通常需要使用更大口径的毛细玻璃针将物质注射至发育后期的胚胎或幼鱼中4。然而，使用更大口径的注射针会带来显著的技术挑战，因为更难在不推动或滚动胚胎的情况下穿透目标组织。在此类条件下，维持适当的水表面张力以固定胚胎并防止操作过程中胚胎干燥十分困难，且胚胎可能无法被理想地定位，从而影响对目标组织的准确注射。
显微注射后，通常需要对注射后的胚胎进行筛选，以挑选出成功注射的个体，并获取初始时间点的图像。为解决这些挑战，我们开发了一系列微结构装置，可帮助在显微注射过程中5以及注射后快速基于图像的筛选过程中，以不同方向稳定固定2 dpf胚胎。
为了在这些装置中获得足够的结构分辨率，我们采用了光刻技术。该技术在微电子工业中广泛应用，近年来也被拓....
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方案
幼虫显微注射实验已获得麻省总医院研究动物护理小组委员会在方案2011N000127下的批准。
1. 器件制备
注意：本文所述用于设计光刻掩模的所有计算机辅助设计（CAD）文件（图1）均可下载。相关链接见材料表。
- 在1,000级洁净室中，使用标准的光刻技术制备母模晶圆7。对于微结构阵列和通道，根据制造商说明，使用三种不同的掩模分三层依次图形化环氧基负性光刻胶：浅层结构为100 µm，中层结构为200 µm，深层结构为400 µm。对于成像装置，使用两层结构，浅层为400 µm，深层为600 µm。
- 将完成的晶圆用胶带固定在15 cm培养皿底部以进行浇铸（图2）。
2. 微结构表面阵列的制备 - PDMS
- 为了制备可用的装置，使用母版晶圆作为模具浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）。将50 g PDMS单体与5 g引发剂混合，在塑料称量皿中用塑料叉充分搅拌。
- 小心地将混合物倒入模具中。
- 在真空干燥器中于16–25 inHg（54–85 kPa）下脱气1小时。
- 将PDMS在....
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结果
本文所述方法展示了用于2天龄斑马鱼的装置设计（图1）及其制造过程，采用光刻（图2）和软光刻（图3）技术。该方法可快速测试多种设计迭代与修改方案，且通过调整和优化微结构尺寸以适用于斑马鱼其他发育阶段，可进一步拓展其应用范围。
我们展示了这些装置在具有挑战性的显微注射技术及便捷成像中的应用。耳囊（图4D，白色虚线轮廓）为在斑马鱼中检测中性粒细胞募集提供了一个有用、免疫豁免且独立的位点9。为了检测斑马鱼中性粒细胞对标准趋化因子的响应能力，将100 nM的fMLP和LTB4通过微结构化通道装置（图1G）显微注射至2天龄.......
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讨论
本文介绍了我们近期开发的用于促进2 dpf斑马鱼显微注射的装置5，并提出一种简便的无琼脂糖固定装置，便于胚胎成像。这些工具凸显了光刻技术在制备适用于斑马鱼实验操作的装置方面的实用性。
我们发现，MSA装置在注射容易在显微注射针内聚集的细胞或颗粒时尤为有用，例如真菌分生孢子或人源癌细胞，这些物质的递送需要使用孔径较大的注射针。向耳囊（图4）注射具有特殊挑战性，因为胚胎在接触注射针时常会发生滚动。我们发现，使用具有微结构的通道将斑马鱼固定并稳定于侧向位置，可显著提高该技术的操作通量和准确性。
为了在不同时间点快速成像侧向固定的斑马鱼（例如中性粒细胞募集或异种移植转移的评估），避免使用琼脂糖可提高胚胎固定的一致性，并减少成像后回收过程中的损伤风险。这些装置在长时间延时成像中也显示出良好前景，已成功用于在12小时内以极小的斑马鱼运动实现多通道、多层面的图像采集。由于不受琼脂糖的限制，幼鱼在此期间的主动伸长效应（约在54至78小时.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 David Langenau 慷慨提供水族箱空间；感谢 Eric Stone、John C. Moore 和 Qin Tang 在斑马鱼饲养和试剂方面的帮助；感谢 Leonard Zon 实验室的 Anne Robertson 和 Elliott Hagedorn 提供本研究所用的斑马鱼品系。作者还感谢 Octavio Hurtado 在光刻技术方面提供的建议。FE 获得儿童烧伤医院（Shriner's Hospital for Children）和美澳协会（American Australian Association）奖学金的资助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金 GM92804 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 道康宁 Sylgard 184 聚二甲基硅氧烷 (PDMS) | 艾尔斯沃思胶粘剂 | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | 用于铸造装置。套件包含 PDMS 单体和引发剂 |
| 低凝胶温度琼脂糖 | 西格玛-奥德里奇 | A9414-10G | 用于铸造琼脂糖装置 |
| PFDTS 硅烷 | 西格玛-奥德里奇 | 448931-10G | 用于铸造负性 PDMS 模具 |
| 三卡因 (MS-222) | 西格玛-奥德里奇 | E10521-10G | 用于麻醉斑马鱼 |
| 罗丹明葡聚糖 70,000 Da | 赛默飞世尔科技 | D1818 | 用于追踪显微注射 |
| 白三烯 B4 (LTB4) | 凯曼化学 | 20110 | 中性粒细胞趋化剂 |
| N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸 (fMLP) | 西格玛-奥德里奇 | F3506-50MG | 中性粒细胞趋化剂 |
| 15 cm 培养皿 | 费舍尔科学 | 08-757-148 | 用于从主模板铸造装置 |
| 玻璃底 6 孔板 | MatTek | P06G-0-20-F | 用于成像装置 |
| 硼硅酸盐玻璃微量毛细管 | 世界科学仪器公司 | TW-100-4 | 用于显微注射针头 |
| 移液管 | 西格玛-奥德里奇 | Z350796 | 用于转移斑马鱼胚胎 |
| Microloader 加样头 | 费舍尔科学 | E5242956003 | 用于向显微注射针头中加样 |
| Harris Uni-Core 1.5 mm 打孔器 | Ted Pella 公司 | 15111-15 | 用于在 PDMS 成像装置上打孔 |
| 11 号手术刀 | 精细科学工具 | 10011-00 | 用于切割 PDMS |
| Dumont 5 号镊子 | 精细科学工具 | 11252-10 | 用于去除胚胎外壳及打断显微注射针尖 |
| 马尔佐豪泽 Micromanipulator | ASI | MM33-R | 用于操控显微注射针头 |
| 磁力支架 | MSC | SPI - 87242624 | 用于安装显微操作器 |
| MPPI-3 皮升泵控制器 | ASI | MPPI-3 | 用于控制显微注射体积和时间 |
| EVOS 倒置荧光显微镜 | 赛默飞世尔科技 | EVOS FL | 用于成像已注射的胚胎 |
| 解剖显微镜 | 尼康 | SMZ745 | 用于观察显微注射过程 |
| AutoCAD 软件 | 欧特克 | 从以下网址下载 AutoCAD 文件：https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 以及 ZFIN 社区实验方案维基页面：https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
参考文献
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916
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