已知铀会影响骨代谢。本文介绍了一种研究天然铀暴露对破骨细胞活力、分化及功能影响的实验方案，破骨细胞是负责骨吸收的细胞。
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摘要
摘要
已证实铀会干扰骨骼生理功能，且该金属在骨骼中蓄积的现象已有明确证据。然而，关于天然铀对骨细胞行为的影响，目前所知甚少。特别是铀对破骨细胞——即负责骨基质吸收的细胞——的影响尚未见文献报道。为探讨这一问题，我们建立了一种新方案，采用醋酸铀酰作为天然铀的来源，并以小鼠RAW 264.7细胞系作为破骨细胞前体的模型。本文详细描述了检测铀对破骨细胞前体细胞毒性的全部实验方法，以及评估其对破骨细胞生成过程及成熟破骨细胞骨吸收功能影响的实验流程。我们所开发的实验条件，特别是含铀酰培养基的制备和RAW 264.7细胞的接种条件，能够获得可靠且高度可重复的实验结果。此外，我们优化了软件工具的使用，以方便分析多种参数，例如破骨细胞的大小或骨基质被吸收的百分比。
引言
铀是一种天然存在的放射性元素，存在于土壤、空气和水中；因此，动物和人类会通过饮食接触到天然铀。除了天然来源外，铀还来源于人类活动，这增加了其在环境中的丰度。铀具有化学毒性和放射性危害双重风险。然而，由于天然铀（一种同位素混合物，包含99.27% 238U、0.72% 235U 和 0.006% 234U）的比活度较低（25.103 Bq·g-1），其对健康的影响主要归因于其化学毒性。
无论通过何种途径进入体内（吸入、食入或皮肤接触），大部分铀元素会随粪便排出体外，仅有少量进入全身血液循环。血液中约67%的铀会在24小时内经肾脏过滤后随尿液排出1。其余部分主要沉积于肾脏和骨骼，这两个器官是铀毒性的主要靶器官2,3,4。由于骨骼已被确认为铀长期滞留的主要部位2,3,4,5,6，已有若干研究致力于探讨铀对骨生理的影响7。
骨是一种终生持续进行重塑的矿化组织。骨重塑是一个复杂的过程，依赖于特定类型的细胞，主要包括两个阶段：首先由破骨细胞吸收已有的旧基质，随后由成骨细胞重新构建新骨。破骨细胞是由起源于造血系统的前体细胞融合形成的大型多核细胞，这些前体细胞迁移至骨吸收部位并附着于骨表面8。其附着过程伴随着细胞骨架的广泛重组9。这种重组对于在细胞与骨表面之间形成一个封闭的微环境至关重要，破骨细胞将质子分泌到该区域，导致羟基磷灰石溶解，同时释放参与有机基质降解的蛋白酶。所生成的降解产物通过内吞作用被摄取，经细胞内转运至远离骨表面的细胞膜区域并被分泌出去，这一过程称为转吞作用10,11。
来自的结果 体内 和 体外 研究表明，铀会抑制骨形成，并改变成骨细胞的数量和活性7,12相比之下，铀对骨吸收及破骨细胞的影响研究甚少。若干 体内 已有研究报道，在向小鼠或大鼠施用硝酸铀酰后，骨吸收作用增强13,14此外，一项流行病学调查表明，男性通过饮用水摄入铀的增加趋势与血清中骨吸收标志物水平的升高相关15综上所述，这些发现表明，蓄积于骨骼中的铀可能促进骨吸收。然而，铀在这一潜在效应中所涉及的细胞机制仍不明确。因此，我们决定研究铀对骨吸收细胞行为的影响。
本文介绍了我们建立的用于表征和量化天然铀对前破骨细胞活力以及破骨细胞分化和吸收活性影响的实验方案。所述实验采用 RAW 264.7 小鼠转化巨噬细胞系进行，该细胞系在含有细胞因子 RANKL 的培养条件下培养 4 至 5 天后可高效分化为破骨细胞，是研究破骨细胞分化与功能的经典模型16。所开发的实验方法可靠，结果高度可重复，并且完全适用于原代破骨细胞。基于上述原因，我们认为该方法有助于更深入理解铀在骨组织中产生毒性的分子机制。此外，我们认为该方法还可被改造为一种筛选新型铀螯合剂的有效工具。
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方案
1. 醋酸铀酰溶液的制备
- 配制2 mL 100 mM醋酸铀酰溶液，需加入85 mg醋酸铀酰（UO₂(CH₃COO)₂）。2(OCOCH3)2，2H2O；M = 424 g·mol⁻¹-1) 以固态加入至5 mL塑料管中。
- 向塑料管中加入 2 mL 蒸馏水，并用塑料塞密封。
- 剧烈振荡试管，直至固体完全溶解。将溶液放入冰箱中静置24小时。
警告：铀酰 [U(VI)] 的操作存在一定的化学和放射性危害。所有样品均应在专用实验室中使用专门设备进行制备和表征。含 U(VI) 的液体废物应收集于指定的废液容器中，并作为有毒废物处理。固体废物（移液器吸头、离心管等） 等等。) 可用 0.1 N HNO₃ 洗涤3 溶液，可溶解并去除六价铀 [U(VI)]。 - 使用微电极和pH计检测溶液的pH值。
注意：微电极应事先使用商用缓冲溶液（pH = 4 和 pH = 7）进行校准。
2. RAW 264.7 细胞培养
- 细胞的维持
- 在75 cm2 培养瓶中培养RAW 264.7细胞（ATCC, TIB-71），使用以下培养基：添加5%胎牛血清及抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），抗生素成分为青霉素100 IU/mL、链霉素100 µg/mL。将细胞置于37 °C、5% CO2 的培养箱中维持培养。
- 每2至3天更换一次培养基。当细胞融合度达到85-90%时，按照ATCC建议，使用细胞刮刀机械性地将细胞从培养瓶表面刮下，并以1:6的比例传代。
注：仅使用第3至第10代之间的细胞进行分化实验。
- 实验用细胞的准备
- 按照上述方法将细胞从培养瓶表面刮下，转移至无菌的50 mL离心管中。通过反复吹打使细胞团块分散，混匀细胞悬液，并使用血细胞计数板进行计数。每75 cm2 培养瓶通常可获得3500万至4000万个细胞。
- 根据以下公式计算每个实验所需的细胞悬液体积：
实验条件数 × 3（三复孔） × 1 mL/孔 + 3–4 mL（移液损耗）。
注：本方案中所有检测的接种密度均为5,000个细胞/cm2。因此，在24孔板中即为每孔1 mL培养基中接种10,000个细胞，细胞悬液浓度应为10,000个细胞/mL。 - 配制所需体积的10,000个细胞/mL细胞悬液，并将细胞接种至24孔板中。进行细胞毒性检测时，使用常规生长培养基；进行分化和骨吸收检测时，使用α-最低必需培养基（αMEM），并补充2 mM L-谷氨酰胺、5% FBS以及50 ng/mL GST-RANKL17。
注：实验室自制的GST-RANKL蛋白可替换为任何市售的RANKL细胞因子。当使用新的RANKL批次时，建议通过浓度梯度实验（RANKL浓度范围为20–150 ng/mL）检测其诱导破骨细胞生成的效果，以评估其活性。
3. 在培养基中稀释100 mM醋酸铀酰溶液
注意：培养基中的铀酰离子 [U(VI)] 会与其他培养基成分形成多种复合物，这些复合物可能改变其细胞毒性18,19,20,21。因此，含铀酰的培养基应现配现用，且不得省略或缩短平衡步骤。
- 选择铀酰暴露浓度，并计算实验所需的培养基体积（需考虑每个条件设三个重复）。
- 从经过无菌处理的细胞培养用7.5%碳酸氢钠水溶液（[HCO3-] = 893 mM）出发，配制100 mM HCO3-的水溶液，并置于冰上冷却。
- 将1体积的100 mM醋酸铀酰储备液逐滴加入9体积的预冷至冰浴的100 mM HCO3-溶液中，同时轻轻振荡混合管。此操作可将醋酸铀酰储备液（[UO22+] = 100 mM，pH 4）稀释至10 mM，并使pH升至约7。
- 将1体积的无菌水逐滴加入9体积的冰浴冷却的100 mM HCO3-溶液中，得到90 mM HCO3-溶液（与10 mM铀酰溶液中的HCO3-浓度相等），用于配制对照培养基。
- 将配制好的溶液在室温（RT）下静置3小时，以达到平衡。
- 在此期间，配制基础暴露培养基：含2 mM L-谷氨酰胺和5%胎牛血清的αMEM。
注：进行分化和骨吸收实验时，需在基础暴露培养基中添加50 ng/mL GST-RANKL。 - 3小时后，将适量的10 mM铀酰溶液逐滴稀释至暴露培养基中，以获得所需的铀酰工作浓度。同时，向暴露培养基中加入与最高浓度铀酰处理组所用等量的碳酸氢盐，配制对照培养基。
- 将配制好的培养基在室温下静置3小时，以达到平衡。
- 移除孔板中的生长培养基，更换为对照培养基和含铀酰的培养基。
4. 存在铀(VI)条件下RAW 264.7前体细胞活力的分析（MTT细胞毒性检测）
警告：MTT 和 DMSO 均可能引起皮肤和眼睛刺激。操作时应佩戴手套和眼部防护装备。废弃物须收集至指定的专用废液容器中。
- 将适量的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）粉末溶于PBS中，配制成5 mg/mL的10倍储存液。使用0.22 µm滤膜过滤除菌，并分装后于-20 °C保存。
- 将细胞接种于24孔板中（每块板中每个实验条件设3个复孔）。注意每块板需预留3个空孔作为分光光度计空白对照。
- 在暴露于铀之前，于37 °C培养22–24小时，使细胞充分贴壁。
- 按照第3节所述方法配制含铀酰离子的培养基。
- 将细胞接种板中的生长培养基更换为含铀酰离子的培养基，继续孵育24小时。
- 按下述方法计算所需1倍MTT溶液的体积：
（实验条件数 + 空白对照）× 3（三复孔）× 0.4 mL/孔 + 10%移液损耗体积。 - 将10倍储存液用不含酚红的Eagle最低必需培养基（EMEM）稀释，配制所需体积的1倍MTT溶液。
注意：为确保比色法检测成功，MTT应避光操作。建议将MTT稀释于EMEM而非DMEM中，以降低背景信号。 - 移除各孔中的含铀酰培养基，用PBS洗涤一次，然后每孔（包括3个空白孔）加入400 µL MTT溶液。于37 °C避光孵育2.5小时。在显微镜下观察，确认活细胞内已形成深紫色的甲臜结晶。
- 弃去MTT溶液，每孔加入220 µL二甲基亚砜（DMSO）。用铝箔纸包裹培养板以避光，轻柔振荡10分钟，使甲臜结晶充分溶解。
- 使用酶标仪测定各孔在570 nm（甲臜特异性吸收峰）和690 nm（背景吸收）处的光密度（OD）。对每个孔，用570 nm处的OD值减去690 nm处的OD值，以校正因划痕或浊度引起的非特异性OD波动22。
- 通过从上一步所得OD值中减去空白孔的平均OD值，计算每个孔的空白校正OD值，并确定每个实验条件下的平均OD值。
- 将对照组（[UO22+] = 0 mM）的平均OD值设为100%细胞活力，据此计算其他铀酰浓度下的相对细胞活力百分比。绘制剂量-反应曲线，并评估半数细胞毒性指数（CI50），即在24小时暴露后导致50%细胞死亡的铀酰浓度。
5. 在六价铀存在下破骨细胞分化的分析
- 在铀酰存在下RAW 264.7细胞的分化及TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色。
- 将RAW 264.7细胞接种于24孔板中，每种实验条件设3个复孔。在37 °C孵育约6小时，此期间用于配制并平衡含铀酰的暴露培养基。
- 按照第3节所述方法配制含目标浓度铀酰的分化培养基（切勿忘记向培养基中添加GST-RANKL）。
- 轻柔地将孔中的基础培养基更换为含铀酰的培养基。此日记为成骨细胞分化的第0天。
- 在成骨细胞分化的第2或第3天，重复步骤5.1.2和5.1.3更换培养基。多核的破骨细胞应在第3至第4天之间出现。
- 使用市售的白细胞酸性磷酸酶试剂盒，按照制造商说明书进行TRAP染色。
注：抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），又称酸性磷酸酶5、抗酒石酸型（ACP5），在成熟的破骨细胞中高度表达，广泛用作破骨细胞分化的标志物。因此，TRAP染色用于可视化破骨细胞。根据实验条件和破骨细胞生成速率，可在分化过程的第4天或第5天进行该染色。 - 将完成TRAP染色的孔置于4 °C的PBS中以备后续分析（可在该条件下保存3至4周）。
- 破骨细胞大小/形态学分析。
- 获取每个孔整个表面的图像。图像分辨率应足以区分细胞核。将含有3个或以上细胞核的TRAP阳性细胞视为破骨细胞。
- 在ImageJ软件中打开一个孔的图像："文件" → "打开"。
- 检查图像左上角的标尺单位。对于相对定量，可使用任意单位。若需获得破骨细胞大小的绝对值，需将标尺单位转换为µm："图像" → "属性"。在弹出窗口中勾选"全局"选项，以便新标尺单位应用于后续打开的所有图像。
注：若使用显微镜获取图像，成像软件中会为每个物镜标明像素尺寸（µm）。 - 设定待分析的测量参数："分析" → "设置测量项"。在“设置测量项”窗口中，勾选"面积"和"显示标签"，其余选项均取消勾选。
- 打开ROI（感兴趣区域）管理器："分析" → "工具" → "ROI管理器"。
- 在主窗口中选择矩形选区工具。在图像任意位置绘制一个约1,000 × 1,000 µm的区域。该选区即定义了第一个用于分析破骨细胞大小的区域。
- 在ROI管理器窗口中，点击"添加"按钮，将该感兴趣区域加入管理器，并点击"更多" → "保存"进行保存。保存的ROI可通过点击"更多" → "打开"随时重新载入ROI管理器。
- 重复步骤5.2.5至5.2.6，再定义4个用于破骨细胞大小分析的区域（图2A 和 2D）。
注：所定义的区域将用于分析所有图像中的破骨细胞大小。 - 复制5个待分析区域中的任意一个：在ROI管理器主界面中选中该ROI（对应选区将显示在主图像上）→ 在选区内右键点击 → "复制"。使用该复制品进行后续分析。
- 在ROI管理器窗口中，勾选"显示全部"和"标签"。
- 在主窗口中选择多边形选区工具，手动勾勒选区内一个破骨细胞的轮廓。通过点击ROI管理器窗口中的"添加"按钮，将该轮廓加入ROI管理器。对所有完全位于所选区域内的破骨细胞重复此操作（图2B 和 2E）。
- 在ROI管理器窗口中，选中所有轮廓，点击"测量"以获取其表面积。将新窗口中出现的测量结果（结果窗口，图2C 和 2F）转移至电子表格中。
注：此时，包含所有破骨细胞轮廓的分析区域可另存为独立图像："文件" → "另存为"，选择所需格式。 - 对当前图像中其余分析区域重复步骤5.2.8至5.2.12。然后对所有其他图像重复整个流程。
- 使用ImageJ软件进行破骨细胞数量分析。
注：由于破骨细胞在孔内的分布通常不均，应基于整个孔进行计数，而非仅选取少数区域。鉴于破骨细胞在形态和大小上的异质性，无法采用自动细胞计数方法。- 在ImageJ软件中打开整孔图像（本分析使用前一小节的图像）。
- 打开细胞计数器窗口："插件" → "分析" → "细胞计数器"。点击"初始化"，并勾选"类型1"（或您偏好的其他类型编号）。确认"显示编号"已勾选，且"删除模式"未勾选。
- 在图像上点击一个破骨细胞，点击处将出现一个有色圆点及编号。对所有破骨细胞重复此操作。定期点击细胞计数器窗口中的"保存标记"以保存标记。
注：若需删除最后一个计数点，点击细胞计数器窗口中的"删除"。若需删除多个点，勾选"删除模式"，然后点击所有无效点。之后取消勾选"删除模式"以继续计数。 - 点击细胞计数器窗口中的结果以显示计数结果。将最终计数结果转移至电子表格中。
6. 在存在六价铀条件下的破骨细胞功能分析
- 骨吸收陷窝实验。
- 将 RAW 264.7 细胞接种于 24 孔骨分析板上，该板提供一种可被破骨细胞吸收的合成无机仿生表面。
注意：为了使细胞能够附着于仿生表面，通常建议在加入分化培养基的前一天进行接种。 - 按照第 5 节（步骤 5.1.2 - 5.1.4）所述方法将 RAW 264.7 细胞分化为破骨细胞。
- 在破骨细胞生成的第 5 天，通过将含铀酰离子的培养基替换为 10% 次氯酸钠溶液，从仿骨表面去除破骨细胞。室温孵育 5 分钟，用去离子水洗涤孔板两次，并使其自然风干。
- 向孔中加入 1% 茜素红 S 钠盐溶液，以染色未被吸收区域中的钙盐。孵育 10–15 秒后移除茜素红溶液，并用清水轻柔洗涤孔板 3–4 次，然后使其自然风干。
注意：上述染色步骤旨在增强吸收区域与未吸收区域之间的对比度，以便后续分析。此操作必须谨慎进行，因为在染色前若孔板未完全干燥，可能导致部分残留的仿骨表面意外脱落。此外，若茜素红溶液在孔中停留时间过长，将出现持续性的非特异性染色。需注意的是，本节所述实验反映的是铀对破骨细胞分化及其功能的综合影响。若需独立研究铀对骨吸收功能的影响（而不涉及破骨细胞形成），可在破骨细胞完全成熟后（分化过程的第 4 或第 5 天），仅用含铀酰离子的培养基处理 RAW 264.7 细胞 24 小时23。
- 将 RAW 264.7 细胞接种于 24 孔骨分析板上，该板提供一种可被破骨细胞吸收的合成无机仿生表面。
- 骨吸收陷窝分析。
- 获取骨分析板每个孔整个表面的图像。
注意：图像采集方法可有所不同，但在重复实验中应保持一致。可采用固定相机配备宏镜头拍摄照片、高分辨率扫描，或使用自动化高通量显微镜生成拼接图像。 - 开始分析前，重复上一节中的步骤 5.2.2 至 5.2.4。
- 将 RGB 图像转换为灰度 8 位格式："图像" → "类型" → "8 位"。
- 在主窗口中选择椭圆选区工具，用其绘制一个圈，涵盖待分析吸收情况的整个孔表面。
- 按照步骤 5.2.6 的方法保存此新 ROI（感兴趣区域）。
- 为便于设定阈值，清除所定义 ROI 外的所有特征："编辑" → "外部清除"。
注意：此时通常建议制作几张图像副本：点击所选区域外以取消选区 → 右键点击图像 → "复制"。此操作有助于避免在下一步中若所选阈值不理想时，重复上述图像处理过程。 - 选择 "图像" → "调整" → "阈值"。在“阈值”窗口中，使用滑动条选择合适的阈值。所有被吸收的区域应低于阈值（显示为白色），未被吸收的区域则高于阈值（显示为红色）。完成阈值设定后，点击“阈值”窗口中的 "应用"。
- 保存最终的二值图像："文件" → "另存为" → 选择所需格式。
- 设定在感兴趣区域内需测量的参数："分析" → "设定测量"。在“设定测量”窗口中，勾选 "面积"、"面积分数" 和 "限定于阈值"，其余选项取消勾选。
- 为在“结果”窗口中直接获得 "被吸收" 面积的分数，需对二值图像进行反相操作（"编辑" → "反相"）。确保最终的二值图像上已选中主 ROI（否则被吸收面积分数将基于整个图像窗口的面积进行计算）。通过点击 ROI 管理器窗口中的 "测量" 或 "分析" → "测量" 来测定被吸收面积分数，并保存结果。
- 获取骨分析板每个孔整个表面的图像。
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结果
采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法对破骨细胞进行可视化观察，破骨细胞表现为具有3个或更多细胞核的大型紫色细胞。图1展示了在RANKL和铀酰离子存在条件下培养的RAW 264.7细胞所获得的破骨细胞的代表性图像。在全孔复合图像及放大图像中，可清晰观察到铀暴露引起的破骨细胞数量和大小的变化。
使用 ImageJ 软件分析破骨细胞的大小（图2）。为此，采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色的破骨细胞全孔图像，并对每种培养条件下每个孔中的相同区域进行处理（图 2A 和 二维）。勾画出每个区域内存在的所有破骨细胞（图2B 和
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讨论
据我们所知，这是首次详细描述旨在研究天然铀对骨吸收细胞影响的实验方法。该方法将有助于更深入地理解铀对骨生理学的影响，并可能为筛选铀螯合剂提供一种新颖且有价值的工具。此外，我们认为本文所述方案也可用于研究其他重金属对破骨细胞生成的影响。
已知铀酰会与培养基中的无机和有机成分形成络合物18,19,20,21。这些络合作用会影响铀的形态分布，从而影响其细胞毒性。因此，本实验方案中的一个关键步骤是含铀培养基的制备。我们先前的研究23表明，在RAW 264.7细胞的培养基中添加5%胎牛血清，当铀酰浓度在0至400 µM范围内时，对其细胞毒性无显著影响。这一点非常重要，因为在培养基中添加血清是分析铀暴露对整个破骨细胞分化过程影响的必要条件。然而，我们需强调，暴露培养基制备过程中所描述的耗时较长...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者谨此感谢 Chantal Cros 提供的技术支持。
这项研究由以下资助项目的资助支持： "替代能源和原子能委员会" （法国原子能委员会（CEA）跨领域毒理学计划URANOs及CEA-AREVA放射性风险合作计划），以及法国国家研究局（铀的毒性：骨组织中生物矿化过程的多层次研究，ANR-16-CE34-0003）。本工作还得到了尼斯索菲亚安提波利斯大学和法国国家科学研究中心（CNRS）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| 不含酚红的 EMEM | Lonza | 12-668E | |
| 细胞培养用水 | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-谷氨酰胺溶液 | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone 胎牛血清 | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% 碳酸氢钠水溶液 | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 酸性磷酸酶（TRAP）检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 387A | |
| 噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT）粉末 | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| 茜素红 S 钠盐，1% w/v 水溶液 | Alfa Aeros | 42746 | |
| 骨吸收检测板（24 孔），用于骨代谢研究 | Corning Life Sciences | 3987 | |
| 多孔板 24 孔板 | Falcon | 353504 | |
| 锥形瓶 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| 聚丙烯圆锥形离心管 50 ml | Falcon | 352070 | |
| 细胞刮刀 30 cm | TPP | 90003 |
参考文献
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